重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物与流程

本发明涉及表达猪圆环病毒3型(pcv3)cap基因的重组杆状病毒的构建方法，用于制造疫苗。

背景技术：

猪圆环病毒病(pcvd)是当前危害养猪业的重要疾病之一，其中pcv2是导致该类疾病的主要致病因子。2016年，phan等学者报道了新型猪圆环病毒pcv3，该病毒可造成猪皮炎和肾病综合征(pdns)、猪繁殖障碍呼吸系统疾病及消化系统炎症等疾病[phantg,giannittif,rossows,etal.detectionofanovelcircoviruspcv3inpigswithcardiacandmulti-systemicinflammation[j].virologyjournal,2016,13(1):184.]。通过pcv3全基因组遗传进化分析发现，pcv3与另外pcv1和pcv2两个基因型的病毒处于不同的进化分支，且pcv3各分离株之间也存在进化差异，是新型猪圆环病毒。自pcv3被报道以来，国内外多个地区均检测出该病毒，其危害正逐步受到重视。2017年初，何启盖等在我国首次检出pcv3。目前国内的pcv3毒株主要分为3a、3b和3c三种基因型，其中3a和美国pcv3参考毒株处于相同的进化分支[fux,fangb,maj,etal.insightsintotheepidemiccharacteristicsandevolutionaryhistoryofthenovelporcinecircovirustype3insouthernchina[j].transboundaryandemergingdiseases,2018,65(2):e296-e303.]。stadejek等对波兰境内14个商品化猪场母猪、仔猪和育成猪的血清进行pcv3检测，证实pcv3感染在欧洲地区同样存在[stadejekt,niaka,ekd,etal.firstdetectionofporcinecircovirustype3oncommercialpigfarmsinpoland[j].transboundaryandemergingdiseases,2017,64(5):1350-1353.]。为控制pcv3的进一步流行，亟需研发针对该病毒的商品化疫苗。

pcv3与pcv1、pcv2一样为无囊膜病毒，病毒粒子也呈二十面体结构，具有2kb的单链闭合环状负链dna基因组，包含三个最主要的开放阅读框。orf1编码参与病毒基因组复制的相关蛋白，而orf2编码主导免疫原性的cap核衣壳结构蛋白，是研制pcv3亚单位基因工程疫苗的理想靶基因[nawagitgulp,morozovi,bolinsr,etal.openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein[j].journalofgeneralvirology,2000,81(pt9):2281-2287.]。pcv3orf3编码由231个氨基酸组成的功能未知蛋白质。pcv3与pcv2的cap蛋白氨基酸同源性较低，仅为30％，此外，二者cap蛋白的抗原表位也无任何相似性，暗示pcv3和pcv2毒株间的抗原交叉保护性可能很低，现有的pcv2疫苗已无法有效预防pcv3感染[湛洋,王东亮,王乃东,等.猪圆环病毒3型检测及其cap结构序列和抗原性预测分析[j].畜牧兽医学报,2017,48(6):1076-1084.]。

疫苗仍是目前防控pcvd的主要手段，因此，针对新型pcv3感染的疫苗自然会成为全世界研究的热点。不同于原核表达系统、酵母及哺乳动物细胞真核表达系统，杆状病毒表达系统作为真核表达系统之一拥有外源插入基因容量大、蛋白表达水平高、操作简便及翻译后加工修饰等诸多优点而得到广泛应用[linsy,chengy,huyc.recentpatentsonthebaculovirussystems[j].recentpatentsonbiotechnology,2011,5(1):1-11.]。目前，关于pcv2亚单位疫苗的生产主要基于昆虫细胞/杆状病毒表达系统，如英特威公司研制的circumvent亚单位疫苗[baechnm,mengxj.efficacyandfutureprospectsofcommerciallyavailableandexperimentalvaccinesagainstporcinecircovirustype2(pcv2).virusres,2012(164):33-42.]。目前关于pcv3疫苗的报道较少，通过构建重组杆状病毒进行pcv3cap蛋白的表达，可为开发pcv3亚单位疫苗奠定基础。

技术实现要素：

本发明通过对pcv3毒株的筛选，设计了扩增pcv3全长的引物；针对pcv3全长cap基因设计了特异引物，基于bac-to-bac系统，获得了表达猪圆环病毒3型cap蛋白的重组杆状病毒。该方法可以方便快捷的构建出表达pcv3cap蛋白的重组杆状病毒，而且可以确定表达的cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。

本发明得第一个目的是提供表达猪圆环病毒3型cap蛋白的重组杆状病毒，重组杆状病毒rbac-cap于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心建议的分类命名为：表达猪圆环病毒3型cap蛋白的重组杆状病毒，保藏号为cgmccno.15692。

本发明得第二个目的是提供用于构建重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型cap蛋白的引物，其参照genbank上公布的pcv3序列与cap基因全长序列独立自主设计，所述引物见表1：

表1所需引物及酶切位点

引物xhoi-3f的酶切位点为ctcgag；

引物ecori-3r的酶切位点为gaattc；

引物cap-f的酶切位点为ggatcc；

引物cap-r的酶切位点为aagctt。

本发明得第三个目的是提供重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型cap蛋白的构建方法，pcv3毒株的筛选；扩增pcv3全长，用以保存pcv3基因组；表达pcv3型cap基因全长引物的设计，用以扩增pcv3cap基因全长；转移载体pfastbac^tmhta-cap的构建；穿梭质粒bacmid-cap的获得；重组杆状病毒rbac-cap的获得；pcv3cap蛋白的表达鉴定；电镜观察病毒样颗粒；免疫小鼠试验。最终得到可用于工业化生产的表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒rbac-cap；具体包括以下步骤：

1、构建包含pcv3全基因组的psk-spcv3：

以pcv3dna为模板，用权利要求1所述的引物xhoi-3f和引物ecori-3r扩增出pcv3全基因组；将pcv3全基因组胶回收后与本实验室保存的pbluescriptsk+载体同时用xhoi和ecori双酶切，将两种酶切产物纯化回收后按3:1的摩尔比进行连接，最后获得重组质粒psk-spcv3；通过xhoi和ecori双酶切鉴定重组质粒，酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为2958bp和2000bp的条带；

2、转移载体的构建：

以psk-spcv3重组质粒为模板，用权利要求1所述的引物cap-f和引物cap-r扩增pcv3cap全长，将pcr产物纯化后与本实验室保存的转移载体pfastbac^tmhta共同进行bamhi和hindiii的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应；axygen质粒小量dna提取试剂盒提取重组质粒pfastbac^tmhta-cap，分别利用限制性内切酶bamhi和hindⅲ单酶切鉴定，以及bamhi-hindⅲ的双酶切鉴定；将酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，bamhi和hindⅲ分别单酶切pfastbac^tmhta-cap质粒，则得到5501bp单一条带；bamhi-hindⅲ双酶切重组质粒pfastbac^tmhta-cap，则得到4856bp和645bp两个条带；

3、穿梭质粒的构建：

将bamhi-hindⅲ双酶切鉴定得到4856bp和645bp两个条带的正确重组载体pfastbac^tmhta-cap转化进入dh10αbac感受态细胞；蓝白斑筛选转座成功的白色单菌落，参考invirtogen公司bac-to-bac杆状病毒表达系统说明书进行相应pcr鉴定，鉴定正确后，抽提重组穿梭质粒bacmid-cap；用引物puc/m13可扩增出约3075bp条带；用引物puc/m13f+capr扩增出约2500bp目的条带；用引物capf+puc/m13r扩增出1000bp目的条带；用引物capf/r分别扩增出645bp目的条带；

4、重组杆状病毒的获得：

将阳性穿梭质粒bacmid-cap转染sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒rbac-cap。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首先获得了pcv3全基因组，然后进行常规的连接反应实现pcv3单拷贝的构建。同时获得pcv3全长cap基因，证明该基因可利用昆虫杆状病毒表达系统进行表达，得到了高滴度重组杆状病毒，扩增后的重组杆状病毒滴度可达10^8.3tcid50/ml以上，以his-tag小鼠单抗和小鼠抗pcv3阳性血清为一抗进行westernblot鉴定，发现表达蛋白具有良好的免疫反应性，免疫小鼠试验发现可以刺激小鼠产生针对pcv3的特异性抗体，最终得到完全适用于工厂化生产的表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒rbac-cap。可作为基因工程亚单位疫苗使用，同时为深入研究pcv3病毒相关基因的功能与免疫机理奠定了物质基础。

附图说明

图1为包含pcv3全基因组单拷贝重组质粒psk-spcv3双酶切的电泳图。

图2为转移载体pfastbac^tmhta-cap酶切电泳图。

图3为穿梭载体bacmid-cap的pcr鉴定电泳图。

图4为提取重组杆状病毒rbac-cap的pcr鉴定电泳图。

图5为提取重组杆状病毒rbac-cap的总rna电泳图。

图6为rt-pcr后pcr鉴定的电泳图。

图7-1为接种重组杆状病毒rbac-cap的sf9细胞的ifa图。

图7-2为接种野生型杆状病毒的sf9细胞的ifa对照图。

图7-3为健康sf9细胞的ifa对照图。

图8为表达猪圆环病毒3型cap蛋白的sds-page鉴定图。

图9为表达猪圆环病毒3型cap蛋白的westernblot鉴定图(以his-tag小鼠单抗作为一抗)。

图10为表达猪圆环病毒3型cap蛋白的westernblot鉴定图(以小鼠抗pcv3阳性血清作为一抗)。

图11pcv3capvlps观察透射电镜图。

图12试验小鼠抗体水平图。

具体实施方式

一、表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒rbac-cap的构建：

设计用于扩增的引物序列如下：

表1所需引物及酶切位点

注：下划线部分为各酶切位点

1、构建包含pcv3全基因组的psk-spcv3：

以提取的pcv3dna为模板，用引物xhoi-3f和引物ecori-3r扩增出pcv3全基因组；将pcv3全基因组胶回收后与实验室保存的pbluescriptsk(+)载体同时用xhoi和ecori双酶切，将两种酶切产物纯化回收后按3:1的摩尔比进行连接，最后获得重组质粒psk-spcv3。通过xhoi和ecori双酶切鉴定重组质粒，酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为3000bp和2000bp左右的条带，如图1所示。图1中，m：dl5000dnamarker；1：xhoi酶和ecori酶双酶切psk-spcv3质粒获得2958bp与2000bp左右片段。

2、转移载体的构建：

以psk-spcv3重组质粒为模板，用引物cap-f和引物cap-r扩增pcv3cap全长，将pcr产物纯化后与实验室保存的转移载体pfastbac^tmhta共同进行bamhi和hindiii的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应。axygen质粒小量dna提取试剂盒小量提取重组质粒pfastbac^tmhta-cap，分别利用限制性内切酶bamhi和hindⅲ单酶切鉴定，以及bamhi-hindⅲ的双酶切鉴定。将酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，bamhi和hindⅲ分别单酶切pfastbac^tmhta-cap质粒则可得到5501bp单一条带。bamhi-hindⅲ双酶切重组质粒pfastbac^tmhta-cap，则可得到4856bp和645bp两个条带，如图2所示。图2中，m：dl5000dnamarker；1：bamhi酶酶切pfastbac^tmhta-cap质粒获得5501bp左右片段；2：hindiii酶酶切pfastbac^tmhta-cap质粒获得5501bp左右片段；3：bamhi酶与hindiii酶双酶切pfastbac^tmhta-cap质粒获得4856bp与6_45bp左右片段。

4、穿梭质粒的构建：

将鉴定正确的重组载体pfastbac^tmhta-cap转化进入dh10αbac感受态细胞；蓝白斑筛选转座成功的白色单菌落，pcr鉴定正确后抽提重组穿梭质粒bacmid-cap。用引物puc/m13可以扩增出300bp左右条带；用引物puc/m13f+capr可以扩增出3075bp目的条带；用引物capf+puc/m13r可以扩增出2500bp左右目的条带；用引物capf/r分别可以扩增出645bp左右目的条带。如图3所示。图3中，m：dl5000dnamarker；1：puc/m13扩增野生型穿梭质粒bacmid约300bp的产物；2：puc/m13扩增重组穿梭质粒bacmid-cap约3000bp的产物；3：m13f+capr扩增重组穿梭质粒bacmid-cap约2500bp的产物；4：capf+m13r扩增重组穿梭质粒bacmid-cap约1000bp的产物；5：capf+capr扩增重组穿梭质粒bacmid-cap约645bp的产物；6:negativecontrol。

4、重组杆状病毒的获得：

将阳性穿梭质粒bacmid-cap转染sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒rbac-cap。

鉴定：提取重组杆状病毒rbac-cap的dna，分别利用引物capf/r进行pcr鉴定。用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，如图4所示：m：dl5000dnamarker；1：negativecontrol；2：capf/r扩增rbac-cap约645bp左右目的片段。

从图4可见：电泳鉴定pcr产物中有645bp左右大小的cap目的条带，说明获得了重组杆状病毒rbac-cap。

该重组杆状病毒rbac-cap于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，建议的分类命名为：表达猪圆环病毒3型cap蛋白的重组杆状病毒，保藏号为cgmccno.15692。

二、表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒的生物学特性鉴定：

材料：重组杆状病毒rbac-cap、健康sf9细胞。

猪源抗pcv3阳性血清(自制血清)、鼠源抗pcv3阳性血清(自制血清)、商品化his-tag单克隆抗体。

1、表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒的cdna检测

将f2代的重组杆状病毒rbac-cap分别接种健康sf9细胞，72h后trizol裂解提取总rna，如图5所示。去除基因组dna后进行rt-pcr，再通过pcr检测目的基因转录情况，pcr方法检测到pcv3cap基因特异性条带，如图6所示。

图5中，m：dl5000dnamarker；1：rbac-cap总rna。

图6中，m：200bpdnamarker；1：rbac-cap总rna反转录后645bp条带；2：negativecontrol。

2、表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒的间接免疫荧光(ifa)检测：

以猪源抗pcv3阳性血清作为一抗，fitc荧光标记的羊抗猪igg为二抗，在荧光显微镜下观察到，经接种表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒rbac-cap的sf9细胞中均出现了明显的特异荧光(如图7-1所示)；而接种野生型杆状病毒(如图7-2所示)与正常对照细胞中则未出现荧光(如图7-3所示)，可见感染表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒rbac-cap的细胞均能够表达pcv3cap蛋白。

2、表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒的sds-page检测

待f2代重组杆状病毒rbac-cap接种sf9细胞96h后，收集蛋白样品煮沸后用于sds-page电泳分析，考马斯亮蓝染色后进行观察。可见在预期大小位置出现目的条带(图8)，可见大小约为30kd的目的蛋白条带。

3、表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒的westernblot鉴定

分别用his-tag小鼠单抗(图9)和抗pcv3小鼠阳性血清(图10)进行westernblot鉴定，无论是表达的全长cap蛋白，还是去除核定位信号的截短δcap蛋白在sds-page中的目的条带位置正确，说明目的蛋白得到成功表达。

4、表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒的tcid50测定

将长势良好的sf9细胞，分装96孔板，用grace培养基将表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒液进行10倍倍比稀释(10^-1～10^-10稀释)。接种96孔板后于37℃、5％co2培养箱中吸附1.5小时后继续培养96h。弃去培养液，pbs清洗，拍干后冷甲醇-20固定20min，弃去固定液，pbs洗3遍，每次5min，吸水纸上拍干。加入用pbs稀释的猪源pcv3阳性血清(1:500)50μl/孔，37℃孵育1h，pbs同上洗涤，拍干。避光加入30μl的1:200稀释的fitc标记的羊抗猪荧光二抗(igg)，避光孵育45min，pbs同上洗涤，拍干。进行间接免疫荧光(ifa)观察，病毒tcid50按reed-muench二氏法计算。

经检测，表达猪圆环病毒3型cap基因的重组杆状病毒的tcid50为10^8.3/ml以上，满足制备疫苗的要求。

5、透射电镜观察

将接种重组杆状病毒的sf9细胞及培养物反复冻融3次，于4℃，4000rpm离心20min去除细胞碎片。将病毒液加于蔗糖垫上，4℃，超高速离心后，适量pbs悬浮沉淀。滴加一滴重悬液于铜网上，2％磷钨酸进行负染。吸取多余染液并烘干，透射电镜观察病毒样颗粒形成情况，如图11所示：磷钨酸负染后于透射电镜下观察到形态均一的病毒样颗粒，呈圆形，直径约20nm。

6、动物免疫试验

6周龄balb/c小鼠20只随机分为4组，其中，组1注射灭活的rbac-cap(10^6.5tcid50/只)、组2注射灭活的rbac-cap(10^7.5tcid50/只)，组3和组4分别注射灭活的野生型杆状病毒感染的sf9细胞培养上清和pbs，各组均与等量的弗氏完全佐剂完全乳化后进行首次免疫，两周后与不完全弗氏佐剂乳化后进行二次加强免疫。免疫前和首次免疫后每周眶下窦采血，分离并保存血清。

将原核表达的pcv3去除核定位信号的cap蛋白包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜包被，pbst洗3次，6min/次，吸水纸上拍干；每孔加入200μl封闭液，37℃封闭3h；再次洗板3次后，加入经pbs适当倍比稀释的小鼠血清，100μl/孔，37℃，孵育1h，同时用小鼠pcv3阳性血清作阳性对照；用含4％fbs的pbs按1:8000稀释hrp标记的羊抗鼠igg二抗，100μl/孔，37℃，孵育1h；每孔加入200μltmb显色液，37℃显色15min；于各个孔中加入50μl终止液终止反应，随后用酶标仪在450nm处测定吸光度。

间接elisa检测pcv3特异性抗体水平结果如图12所示：首免后第二周即可检测到pcv3特异性抗体产生，第三周抗体水平迅速上升，第四周抗体水平继续上升，高剂量免疫组效价均可达到1:4000左右。

<110>扬州大学

<120>重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型cap蛋白及其构建方法与引物

<160>6

seqidno.1

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tttctcgagattggcgaagattcctcttcgggta34

seqidno.2

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<212>dna

<213>人工序列

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ccggaattcgtaatccccctctttcttgcaata33

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<400>3

cgcggatcccatgagacacagagctatattc31

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cccaagcttttagagaacggacttgtaacga31

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gttttcccagtcacgac17

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caggaaacagctatgac17