弧菌噬菌体及其杀菌组合物制备方法和应用与流程

本发明涉及弧菌噬菌体及其杀菌组合物制备方法及作为抗菌制剂在食品和水产养殖中的抗菌应用，尤其是能够特异性裂解食品及水产养殖中多种弧菌污染。属于生物技术领域。

背景技术：

近年来，水产养殖尤其是海产养殖已成提高全球水产品供给量的主要生产方式，随着养殖规模及密度的不断增加，网箱养殖过程中的疾病频繁出现，给规模化养殖的发展带来巨大威胁。针对海产养殖中的鱼类及虾类细菌性疾病研究表明，其主要病原以弧菌属为主，其中以哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)及副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)为主要致病菌，在鱼类主要表现为溃疡病，在虾类则以急性肝胰腺坏死综合征为主，死亡率高达80％，该病的暴发导致养殖业遭受巨大经济损失。目前针对弧菌病的防控和治疗途径仍以抗生素、中药制剂及消毒剂等，然而，由于传统养殖模式的不完善及抗生素使用不规模，造成弧菌出现频繁耐药，且表现多重耐药特征，从而导致抗生素防治失败，海产品中抗生素残留严重，不仅造成经济损失，且严重威胁人类健康。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。裂解性噬菌体特异性感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之瓦解，故又称毒性噬菌体，例如副溶血弧菌噬菌体能特异性感染并裂解副溶血弧菌，而哈维氏弧菌噬菌体和溶藻弧菌噬菌体则特异性裂解哈维氏弧菌和溶藻弧菌，从而具有高效杀菌、特异且无残留等优点。针对水产养殖中耐药性弧菌防治失败等问题，通过哈维氏弧菌、溶藻弧菌及副溶血弧菌相应的噬菌体进行复合使用，能够同时有效杀灭致病性哈维氏弧菌、溶藻弧菌及副溶血弧菌，从而有效防控因致病性弧菌导致感染甚至死亡。噬菌体能够通过噬菌体-宿主相互识别裂解靶细菌，与抗生素作用方式不同，因此能够有效杀灭多重耐药性弧菌。通过弧菌噬菌体的复配达到高效、广宿主谱系、不产生抗性无残留以及不影响正常菌群等特点，必然是新型抗菌产品的候选。目前噬菌体已在食品及医药行业受到广泛关注，尤其是针对耐药性细菌的不断产生和传播，噬菌体都能够作为抗菌剂来控制细菌感染，具有良好的开发和应用价值。

技术实现要素：

发明目的

开发对弧菌病主要病原哈维氏弧菌、溶藻弧菌及副溶血弧菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种弧菌，为目前防控食品及水产养殖中弧菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。

技术方案

一种弧菌噬菌体，其特征在于弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体vb_vals_pcr-1(vibrioalginolyticusphagevb_vals_pcr-1)保藏号为cctccno:m2018391，或哈维氏弧菌噬菌体vb_vham_pcb-1g(vibrioharveyiphagevb_vham_pcb-1g)保藏号为cctccno：m2018392。

一种弧菌噬菌体组合物，其特征在于所述该噬菌体组合物包括溶藻弧菌噬菌体cctccno:m2018391、哈维氏弧菌噬菌体cctccno：m2018392和副溶血弧菌噬菌体cctccno：m2015577。

所述的弧菌噬菌体组合物，其特征在于以所述的噬菌体、噬菌体分离物或噬菌体培养物制成组合物。

所述的弧菌噬菌体组合物，其特征在于将所述的噬菌体、噬菌体分离物或噬菌体培养物与赋形剂复配，制成组合物。

所述的弧菌噬菌体组合物，其特征在于：所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶、海藻酸盐。

所述的弧菌噬菌体的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

分别取10ml新鲜培养的溶藻弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌新鲜培养物，离心，分别用1ml2216e培养基重悬，分别加入0.5ml相应的噬菌体，37℃温育30min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入1l2216e培养基，30℃，150rpm/min，振荡培养6～8h；分别取上述培养物以10000×g/min，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体悬液；加rnasea、dnaseⅰ至1μg/ml，37℃温育30min；加入peg8000至终浓度为10％(w/v)，nacl终浓度为1mol/l，摇匀至溶解，冰浴1h；4℃离心10000×g/min20min，去上清液；加50mlsm溶液，悬浮沉淀，室温作用1h；加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000×g/min离心15min，回收纯化的噬菌体。

所述的弧菌噬菌体组合物在制备用于抑制溶藻弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌污染的杀菌剂中的应用。

所述的应用，其特征在于所述的杀菌剂用于对食品、生产环境或生产器具的消毒。

所述的应用，其特征在于所述的食品为由肉类、蛋类，海产品、粮食或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

所述的应用，其特征在于，所述的杀菌剂也用于控制水产养殖中的弧菌感染。

溶藻弧菌噬菌体vb_vals_pcr-1(vibrioalginolyticusphagevb_vals_pcr-1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为cctccno:m2018391，保藏时间为2018.6.21；哈维氏弧菌噬菌体vb_vham_pcb-1g(vibrioharveyiphagevb_vham_pcb-1g)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为cctccno：m2018392，保藏时间为2018.6.21；副溶血弧菌噬菌体cctccno：m2015577按文献201510872234x所述的方法的制备。

附图说明

图1噬菌体斑形成照片

a.哈维氏弧菌噬菌体vb_vham_pcb-1g

b.溶藻弧菌噬菌体vb_vals_pcr-1

c.副溶血弧菌噬菌体vb_vhap_ow

图2噬菌体电镜照图

a.哈维氏弧菌噬菌体vb_vham_pcb-1g

b.溶藻弧菌噬菌体vb_vals_pcr-1

c.副溶血弧菌噬菌体vb_vhap_ow

图3噬菌体体外杀菌效果

图4噬菌体复配体外杀菌效果

图5噬菌体在食品中的杀菌效果

图6噬菌体防控弧菌效果

具体实施方式

本发明试验用噬菌体宿主菌哈维氏弧菌(vibrioharveyi，gim1.781/atccbaa-1117)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus，gim1.451/atcc33787)及副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus，gim1.306/atcc17802)购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；

sm溶液配制方法：1l：nacl5.8g，mgso4.7h2o2.0g，1mtris-hcl(ph7.4)50ml；

2216e培养基购自青岛海博生物技术有限公司；

本发明所述的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_pcr-1(vibrioalginolyticusphagevb_vals_pcr-1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为cctccno:m2018391，保藏时间为2018.6.21；哈维氏弧菌噬菌体(vibrioharveyiphagevb_vham_pcb-1g)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为cctccno：m2018392，保藏时间为2018.6.21；副溶血弧菌噬菌体cctccno：m2015577按文献201510872234x方法的制备。

实施例1、噬菌体制备

噬菌体纯化

分别取2ml溶藻弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌新鲜培养物，离心，分别用0.4ml2216e培养基重悬，分别依次加入0.1ml噬菌体(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例)。30℃温育30min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mllb培养基，30℃静置培养6～8h；取上述培养物以13000×g/min，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体悬液。加rnasea、dnaseⅰ至1μg/ml，37℃温育30min；加9.3gpeg8000，5.8gnacl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000×g/min20min，去上清液；加2mlsm溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000×g/min离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(如图1所示)。

噬菌体电镜检测

取纯化噬菌体悬液作电镜观察，加20μl样本滴在铜网上,待其沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min,干燥后电镜观察。

如图2所示，溶藻弧菌噬菌体vb_vals_pcr-1及哈维氏弧菌噬菌体vb_vham_pcb-1g均属于长尾噬菌体科，头对对称，直径分别为66nm及140nm，尾长约118nm及256nm；噬菌体vb_vpap_ow属于短尾噬菌体科，头部对称，直径约为65nm，尾长约为13nm。

实施例2、噬菌体体外杀菌效果

取培养至对数生长期的溶藻弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌菌液，测定其od600值，分别将其调整至od600约为0.4。然后取相应稀释好的菌液2ml与100ul效价约10⁹pfu/ml的噬菌体裂解液混合，在室温下静置。从0h开始测od600值，每0.5h测定一次，测至5h。

结果如图3所示：噬菌体均能有效抑制相应宿主菌，在作用1.5h后宿主菌浓度急速下降，在3h时已降至约0.2，而此时对照组宿主菌浓度已升至1.0以上；作用至5h，加有噬菌体的混合液已显著澄清，而对照组菌液混浊。

实施例3、噬菌体复配体外杀菌效果

取培养至对数生长期的溶藻弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌菌液，测定其od600值，分别将其调整至od600约为0.4，并进行1:1:1混合；再分别取3种噬菌体各100μl按1:1:1混合(每种噬菌体效价约为10⁹pfu/ml)；取混合菌液2ml与300μl混合噬菌体进行颠倒混匀，在室温下静置。从0h开始测od600值，每0.5h测定一次，测至5h。

结果如图4所示：噬菌体均能有效抑制相应宿主菌，在作用1.5h后宿主菌数量减少，od值开始出现下降，作用3h时已降至约0.3，而此时对照组宿主菌浓度已升至1.38以上；作用至5h，加有噬菌体的混合液已显著澄清，而对照组菌液混浊，od值已达1.68。

实施例4、噬菌体在食品中的杀菌作用

生鱼片，将其切成约面积为2cm×2cm的小块(约1g)，将肉块过火焰灭菌；制备3×10⁵cfu/ml溶藻弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌混合菌液(每种菌1×10⁵cfu混合后，pbs至1ml)；制备3×10⁹pfu/ml的噬菌体混剂(cocktail，每种噬菌体约1×10⁹pfu混合后，sm调至1ml)。无菌室温环境下，将混合菌液以20μl(1×10⁴cfu/ml)滴于肉块表面，约15min后，滴20μl噬菌体，同时设立宿主菌对照；将制备好的样品置于8～10℃环境中，分别于24h，48h，72h后检测宿主菌数量。

如图5中所示，8℃作用24h后，与对照组相比较，宿主菌数量下降0.9log；48h后，宿主菌数量减少2.6log；至72h，与对照组起始数量比较下降3.5log，呈极显著性差异。

实施例5、噬菌体防控弧菌感染

将斑马鱼随机分成3组，每组15尾，防控组腹腔注射噬菌体，每组斑马鱼注射噬菌体cocktail剂量为10⁶pfu/尾,1h后注射混合菌液10³cfu/尾；噬菌体对照组仅注射10⁶pfu/尾；宿主菌对照组仅注射混合菌液10³cfu/尾。将斑马鱼饲养于28℃的环境下，观察并记录斑马鱼死亡情况。

结果如图6所示，噬菌体防控组中因噬菌体的预防，有效的抵御了弧菌的感染，斑马鱼仅死亡1尾，防控效果达93.3％；而宿主菌对照中死亡9尾，仅40％存活，且运动力弱，活力低；仅噬菌体注射斑马鱼后，生长至7天无死亡且生长状况良好，由可表明，噬菌体对斑马鱼无毒性，能够作为防控制剂用于水产养殖中控制弧菌感染。