本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种分离大鼠脑微血管内皮细胞的方法。
背景技术
血脑脊液屏障(bloodbrainbarrier，bbb)是机体的内部屏障之一，由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络从的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组成，是中枢神经系统的中药解剖结构。脑脊液屏障主要是由脑微血管内皮细胞和周细胞构成，星形胶质足突包绕毛细血管的外周，覆盖其95％～99％的表面积，其中，血管内皮细胞是构成血脑脊液屏障的关键组织细胞位点，存在结构复杂的紧密连接，且相对缺乏胞软囊泡及窗孔，其能够组织大多数内外源性物质透过学脑脊液屏障。
现阶段常采用大鼠大脑皮质直接进行原代分离，但由于鼠龄较大，细胞活力较弱，因此分离出来的细胞纯度相对较低，同时活力也相对较差。
技术实现要素：
本发明针对上述问题，提供一种方法简单且细胞成活率高的分离大鼠脑微血管内皮细胞的方法。
本发明提供的一种分离大鼠脑微血管内皮细胞的方法，包括以下步骤：
(1)将孕19～22天的大鼠胎鼠的全脑去除小脑、间脑、软脑膜、脑膜大血管、大脑白质、残余大血管和软脑膜，之后将分离的大脑皮质放置dmem培养基中；
(2)将大脑皮质剪成约0.5～1.5mm3大小组织块，再加入等体积质量分数为0.2～0.3％的胰蛋白酶和0.15～0.25％的胶原酶，混匀，在36.5～37.5℃下消化120～180min，每隔5～15min摇晃一次，之后加入4～6ml的含8～12％fbs的dmem培养基，悬浮混匀后2500～3500r/min离心15～25min，再去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀；
(3)加入1.5～2.5ml的0.05～0.15％胶原酶/分散酶悬浮混匀后在36.5～37.5℃的水浴消化0.5～1.5h，之后离心去上清，再加1.5～2.5ml的dmem培养基悬浮后铺于经离心形成连续梯度的10～14ml的45～55％percoll，离心后吸取红细胞层之上的纯化的微血管段，吸出后用dmem培养基漂洗1～3次；
(4)将收集的细胞用含8～12％fbs的dmem培养基重悬，之后置于co2培养箱培养，24h后换液，以后隔天换液。
作为本发明的进一步优化，步骤(1)中去除的间脑包括海马；步骤(1)中去除软脑膜及脑膜大血管采用将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动来吸除的方法；步骤(1)中去除大脑白质、残余大血管和软脑膜采用细解剖镊去除。
作为本发明的进一步优化，步骤(3)中的胶原酶/分散酶包含20u/mldnasei。
作为本发明的进一步优化，步骤(3)中的消化后的离心是在室温下1000r/min离心8分钟。
作为本发明的进一步优化，步骤(1)之前还包括细胞培养瓶的预处理步骤，如下：
将细胞培养瓶预先用100ug/ml的多聚赖氨酸包被，再用pbs润洗3次，之后在超净台内自然晾干。
本发明提供的一种分离大鼠脑微血管内皮细胞的方法步骤简单，更方便于实际应用，且分离出的原代细胞活力强、纯度高以及存活率高。
附图说明
图1是本发明分离出的细胞视图；
图2是成年大鼠细胞与胎鼠细胞存活率对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细说明。
本发明分离出的大鼠脑微血管内皮细胞的视图如图1所示。
下列实施例实施之前需做以下准备：
材料：选择孕期19～22天的清洁级sd大鼠；
pbs溶液配置：在600ml的ddh2o中溶解8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，之后用hcl调节溶液ph至7.4，定容至1l，滤器过滤后，高压灭菌，室温保存；
2％ii型胶原酶配置：200mgii型胶原酶+100dmem培养基溶解，过滤备用；
1mg/ml多聚赖氨酸配置：用超纯水配制，－20℃储存，使用时稀释10倍，即终浓度100ug/ml，4℃备用；
细胞培养瓶预处理：将25cm2细胞培养瓶预先用100ug/ml的多聚赖氨酸包被，pbs润洗3次，超净台内自然晾干，备用。
实施例1
(1)将孕20天的清洁级sd大鼠，麻醉后处死，取出胎鼠，打开颅腔后取出全脑，再去除小脑、间脑，间脑包括海马，随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，最后轻轻夹取分离的大脑皮质至另一含dmem培养基的ep管内；
(2)将大脑皮质剪成约1mm3大小组织块，再加入等体积质量分数为0.25％的胰蛋白酶和0.2％的胶原酶，混匀，在37℃下消化150min，每个10min摇晃一次，之后加入5ml的含10％fbs的dmem培养基，悬浮混匀后3000r/min离心20min，再去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀；
(3)加入2ml的0.1％胶原酶/分散酶，胶原酶/分散酶含20u/mldnasei，悬浮混匀后在37℃的水浴消化1h，之后在室温下1000r/min离心8分钟，再去上清，再加2ml的dmem培养基悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12ml的50％percoll，1000r/min离心30分钟后吸取红细胞层之上的白黄色的层面，该层面即为纯化的微血管段，吸出后用dmem培养基采用1000r/min离心5分钟的方式漂洗2次；
(4)将收集的细胞用含10％fbs的dmem培养基重悬，之后置于co2培养箱中的而培养瓶中培养，24h后换液，以后隔天换液。
实施例2
(1)将孕22天的大鼠胎鼠的全脑去除小脑、间脑、软脑膜、脑膜大血管、大脑白质、残余大血管和软脑膜，之后将分离的大脑皮质放置dmem培养基中；
(2)将大脑皮质剪成约0.5mm3大小组织块，再加入等体积质量分数为0.3％的胰蛋白酶和0.15％的胶原酶，混匀，在37.5℃下消化120min，每个15min摇晃一次，之后加入4ml的含12％fbs的dmem培养基，悬浮混匀后2500r/min离心25min，再去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀；
(3)加入1.5ml的0.15％胶原酶/分散酶，，胶原酶/分散酶含20u/mldnasei，悬浮混匀后在36.5℃的水浴消化1.5h，之后在室温下1000r/min离心8分钟，再去上清，再加1.5ml的dmem培养基悬浮后铺于经离心形成连续梯度的14ml的45％percoll，800r/min离心25分钟后吸取红细胞层之上的纯化的微血管段，吸出后用dmem培养基采用800r/min离心4分钟的方式漂洗1次；
(4)将收集的细胞用含8％fbs的dmem培养基重悬，之后置于co2培养箱中的而培养瓶中培养，24h后换液，以后隔天换液。
实施例3
(1)将孕19天的清洁级sd大鼠，麻醉后处死，取出胎鼠，打开颅腔后取出全脑，再去除小脑、间脑，间脑包括海马，随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，最后轻轻夹取分离的大脑皮质至另一含dmem培养基的ep管内；
(2)将大脑皮质剪成约1.5mm3大小组织块，再加入等体积质量分数为0.2％的胰蛋白酶和0.25％的胶原酶，混匀，在36.5℃下消化180min，每个5min摇晃一次，之后加入6ml的含8％fbs的dmem培养基，悬浮混匀后3500r/min离心15min，再去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀；
(3)加入2.5ml的0.05％胶原酶/分散酶悬浮混匀后在37.5℃的水浴消化0.5h，之后离心去上清，再加2.5ml的dmem培养基悬浮后铺于经离心形成连续梯度的10ml的55％percoll，1200r/min离心35分钟后吸取红细胞层之上的纯化的微血管段，吸出后用dmem培养基采用1200r/min离心6分钟的方式漂洗3次；
(4)将收集的细胞用含12％fbs的dmem培养基重悬，之后置于co2培养箱中的而培养瓶中培养，24h后换液，以后隔天换液。
另外本发明还提供一种mtt检测方法，步骤如下：
(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，1～5×103个细胞/孔，以100μl培养液做空白对照，37℃培养过夜；
(2)将两组细胞分别培养12h、24h、48h、72h；
(3)取出不同分组不同时间点的细胞培养板，每孔加20ulmtt溶液(5mg/ml)，继续培养4h；
(4)然后吸掉上清，每孔加入150uldmso溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
采用上述方法，对胎鼠原代心肌细胞组和成年大鼠原代心肌细胞组进行mtt检测，最后通过测量吸光值，得到如图2所示，由图2中的od值可知，选用胎鼠细胞的存活率要远高于成年大鼠细胞的存活率。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。