一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法与流程

本发明属于pcr检测领域，具体涉及一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重pcr检测方法。

背景技术

番鸭细小病毒(muscovyduckparvovlrus，mdpv)和鹅细小病毒病(gooseparvovirus,gpv)都是细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属成员。mdpv可引起的雏番鸭的细小病毒病又称番鸭3周病。该病具有高度的传染性，主要导致雏番鸭消化道、肠道等部位的病变。病鸭常表现为喘气，消瘦、拒食、软脚和稀便等症状，且发病率和死亡率较高。小鹅瘟是一种烈性传染病，主要由gpv引起。鹅细小病毒病是一种急性或亚急性败血性传染病，传播速度快。该病以肠道的病变为主要特征，主要侵害20日龄以下雏鹅，也可感染雏番鸭，发病率，死亡率可高达100％。禽腺病毒(fowladenovirus,fadv)属于腺病毒科禽腺病毒属，是鸡、鸭、鹅等禽类体内常见的传染性病源。血清4型i群禽腺病毒(fowladenovirusserotype4，fadv-4)可引起以心包积液，以及包涵体肝炎为特征的心包积水-肝炎综合征，病禽主要表现在精神沉郁，扭头等神经症状，死亡率可达20％-30％。

gpv与mdpv基因组具有高度的同源性，抗原性高度相似，fadv可分为5个种，12个血清型，其中以血清4型为主，种类繁多，用常规的血清学检测方法很难区分，给三种病毒的鉴别诊断造成了困难。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重pcr检测方法，该方法可同时检测三种病毒，操作更为简便、具有敏感性高、特异性强和重复性好等优点。

本发明提供了如下的技术方案：

一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重pcr检测方法，包括如下步骤：

s1、根据番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的基因保守序列，分别设计3对特异性扩增引物；

番鸭细小病毒正向引物序列：5′-aactgagagatgacatgaat-3′，番鸭细小病毒反向引物序列：5′-acttgcttctcctccactat-3′

鹅细小病毒正向引物序列：5′-gtccgggtagaccagaaa-3′，鹅细小病毒反向引物序列：5′-ctcaggagtcacaggaat-3′

禽腺病毒4型正向引物序列：5′-aactacatcgggttcagg-3′，禽腺病毒4型反向引物序列：5′-agtccacgaaggtctgat-3′；

s2、提取番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型dna；

s3、将s2中获取的所有的dna混合后进行pcr扩增；

s4、通过电泳检测s3中的pcr产物。

优选的，所述s1中，通过primerpremier5.0软件设计3对特异性扩增引物。

优选的，所述s1中，合成3对特异性扩增引物时的退火温度均为48℃。

优选的，所述s3中，pcr扩增体系：混合后总的dna1μl、s1中设计的3对特异性引物各20pmol、premixtaqdna聚合酶14μl、灭菌双蒸水补足至25μl；

pcr扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

优选的，所述s4中，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

本发明的有益效果是：

现有技术中检测番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型，需要进行3次pcr扩增，本发明将其整合为一次的3重pcr扩增，大大提高了番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型检测效率；同时利用该3重pcr反应体系进行检测，可以大大节约pcr和电泳试剂、实验耗材、减少电泳检测时间及成本。

本发明建立的三重pcr检测方法，能同时检测mdpv、gpv和fadv-4三种病毒,且对鸭黄病毒(dfv)、鸭i型肝炎病毒(dhv-ⅰ)和禽呼肠孤病毒(arv)的检测为阴性；mdpv、gpv和fadv-4核酸模板的最低检测量分别为2pg/μl、20pg/μl和2pg/μl；对多份阳性临床病料进行检测，结果mdpv、gpv和fadv-4的检出率均为100％。这说明该三重pcr具有较高特异性、敏感性和可重复性，可为鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒鉴别诊断提供准确的结果，对三种疫病传播控制具有重要意义。

附图说明

图1是实施例1的三重pcr扩增产物电泳图，其中m为dl2000dnamarker，1-4分别为mdpv、gpv和fadv-4混合模板，mdpv模板，gpv模板，fadv-4模板；

图2是实施例2的三重pcr扩增产物电泳图，其中，m为dl2000dnamarker，1-7分别为mdpv、gpv和fadv-4混合模板，mdpv模板，gpv模板，fadv-4模板，dfv模板，dhv-ⅰ模板和arv模板；

图3是实施例3的三重pcr扩增产物电泳图，其中，m为dl2000dnamarker，1-7均为mdpv、gpv和fadv-4混合模板，1-7分别为浓度20ng/μl，2ng/μl，200pg/μl，20pg/μl，2pg/μl，200fg/μl；

图4是实施例4的三重pcr扩增产物电泳图，其中m为dl2000dnamarker，1-8均为mdpv、gpv和fadv-4混合模板。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做具体说明。

主要仪器与试剂dl2000dnamarker、premixtaqdna聚合酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；rna/dna快速提取试剂盒、反转录试剂盒、琼脂糖(电泳纯)等均购自生工生物工程科技(上海)股份有限公司。梯度pcr仪购自德国biometra公司；biophotometerd30核酸蛋白测定仪购自德国eppendorf公司。

病毒株小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒和禽腺病毒4型均由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室分离、鉴定并保存。对照毒株鸭黄病毒(duckflavivirus,dfv)、鸭i型肝炎病毒(duckhepatitisvirustypeⅰ,dhv-ⅰ)和禽呼肠孤病毒(avianreovirus,arv)的cdna模板由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室保存。

实施例1

一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重pcr检测方法，包括如下步骤：

s1、通过primerpremier5.0软件设计3对特异性扩增引物；依据引物设计原则，在病毒基因组保守区域选取特异性引物，引物之间避免形成二聚体或发夹结构，引物与模板间避免产生错配，同时3对引物退火温度保持一致，以最大程度提高pcr的效率。

番鸭细小病毒正向引物序列：5′-aactgagagatgacatgaat-3′，番鸭细小病毒反向引物序列：5′-acttgcttctcctccactat-3′，退火温度为48℃，扩增后片段长度为628bp；

鹅细小病毒正向引物序列：5′-gtccgggtagaccagaaa-3′，鹅细小病毒反向引物序列：5′-ctcaggagtcacaggaat-3′，退火温度为48℃，扩增后片段长度为432bp；

禽腺病毒4型正向引物序列：5′-aactacatcgggttcagg-3′，禽腺病毒4型反向引物序列：5′-agtccacgaaggtctgat-3′，退火温度为48℃，扩增后片段长度为979bp。

s2、根据病毒dna快速提取试剂盒说明书，提取番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的dna。通过核酸蛋白测定仪测定上述所有提取的核酸浓度和纯度，取纯度和浓度均较高的核酸，优选取a260/a280值在1.8～2.0之间的核酸，于-20℃保存备用；

s3、将s2中获取的所有的dna混合后进行pcr扩增；

pcr扩增体系：混合后总的dna1μl、s1中设计的3对特异性引物各20pmol、premixtaqdna聚合酶14μl、灭菌双蒸水补足至25μl；

pcr扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

s4、通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

结果如图1所示，采用该方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的检测，均能扩增出与试验设计大小相符的628bp，432bp，979bp的条带。

实施例2

三重pcr特异性实验

制备7个样品，第一个为番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型混合模板，第2-7个分别为番鸭细小病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒4型、鸭黄病毒、鸭i型肝炎病毒和禽呼肠孤病毒模板，将上述8个样品分别进行三重pcr扩增，pcr扩增体系和扩增条件同实施例1，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

结果如图2所示，采用该方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的检测，均能扩增出与试验设计大小相符的628bp，432bp，979bp的条带，而鸭黄病毒、鸭i型肝炎病毒和禽呼肠孤病毒在相同位置却无特异性扩增条带。

实施例3

三重pcr敏感性实验

制备总浓度为20ng/μl的番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型混合核酸模板，采用10倍递进梯度稀释至200fg/μl，分别对上述不同浓度的核酸核酸模板进行三重pcr扩增，pcr扩增体系和扩增条件同实施例1，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

结果如图3所示，该三重pcr最低能同时检测到2pg/μl的番鸭细小病毒和禽腺病毒核酸模板，20pg/μl的鹅细小病毒模板。

实施例4

三重pcr重复性实验

在相同条件下，对收集的8份已鉴定的患有番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型疾病的病料进行基因组提取和三种pcr扩增，pcr扩增体系和扩增条件同实施例1，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。

结果如图4所示，利用建立的三重pcr检测方法，对收集的病料进行检测，pcr产物经质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳显示，8次提取的基因组混合模板的pcr扩增结果均出现了三条清晰明亮的目的条带。结果表明，建立的番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型三重pcr检测方法具有良好的重复性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。