一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种mdpv感染性质粒克隆的构建以及转染番鸭胚拯救病毒的方法。

背景技术：

番鸭细小病毒(muscovyduckparvovirus，mdpv)主要感染3周龄内雏番鸭，感染番鸭表现以腹泻、软脚和喘气为主要特征的临床症状，俗称番鸭“三周病”。发病率可达27％～62％，死亡率在22％～43％之间，病愈鸭大部分成为僵鸭。该病是番鸭养殖业上的重要疫病之一，国内雏番鸭细小病毒病的报道最早始于1985年，法国1990年报道该疫病的存在。

番鸭细小病毒属于细小病毒科依赖细小病毒属，其基因组为一条线性的单股dna,以相等的极性存在病毒粒子中。两侧翼为457个碱基组成的末端倒置重复序列(itr)，itr与病毒基因组的复制、剪切、拯救等特性密切相关。基因组左侧阅读框编码病毒的非结构蛋白rep，依据不同的剪接方式可生成为rep1等4种不同的rep蛋白，rep蛋白通过与itr结合参与基因组dna的复制以及调控下游p41启动子。基因组右侧阅读框编码衣壳蛋白cap，依据起始密码子不同和翻译后的蛋白裂解可分别生成vp1、vp2、vp3三个蛋白，三个蛋白氨基端不同、羧基端一致，以大约1:1:8的比例共同组成病毒的衣壳。

自上世纪80年代后期开始，由番鸭细小病毒引起的番鸭“三周病”开始在我国很多番鸭养殖区流行。到目前为止，有关mdpv的完整基因组序列仍很有限，目前报道序列多集中于内部编码蛋白。本实验室于2000年从浙江省的发病番鸭体内分离到一株mdpv,定名为yy株。在人工感染试验中，将含有yy株的新鲜尿囊液颈部皮下接种2日龄番鸭，番鸭死亡率可达62.5％。

反向遗传技术是开展病毒研究的一种有用平台，在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用。同样，构建mdpv感染性分子克隆，以此为基础可以对mdpv的特定基因展开更为有效的研究，对mdpv弱毒疫苗株的研制也提供了一个有用平台。

病毒拯救是反向遗传操作上的重要一环，大多是将构建的质粒或rna转录产物转染细胞的途径来实现拯救目的。对于细小病毒而言，细胞处于分裂期时才最适于病毒复制，因此转染时细胞所处状态对转染拯救结果影响很大，同时每次转染时制备原代细胞也颇费时间。因此，若能建立一种简便、高效的拯救方法，将极大的方便并推动mdpv相关基础研究的深入开展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种番鸭细小病毒(muscovyduckparvovirus,mdpv)感染性质粒的构建方法，以及简便高效的拯救方法。

本发明所述的mdpv感染性克隆质粒的拯救方法，是将mdpv完整基因组克隆入载体质粒pbskn，获得重组质粒，将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫番鸭胚，重组质粒在番鸭胚中得到拯救；所述pbskn载体，是将商品化质粒pbluescriptii(sk)多克隆位点上原有的ecorv酶切位点用ncoi位点替换而得到。

具体地：将重组质粒与转染试剂lipofectamine2000按照一定比例1:2.5(μg/μl)混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种11日龄非免疫番鸭胚。番鸭胚在接种后7～11天死亡，胚体具有典型的mdpv感染特征，表现为胚体出血、绒毛尿囊膜水肿的典型特征。拯救出的病毒具有与亲本病毒yy株相近的致病性。

进一步地，为了排除转染拯救过程中亲本mdpv毒株污染的可能，可通过overlappcr方法，在重组质粒的克隆基因组内部引入1个同义碱基突变作为遗传标记，得到的带有遗传标记的重组质粒再施以转染及拯救过程。更具体地，可以是在重组质粒的vp1基因中引入1个突变碱基作为遗传标记。

本发明中，所述的重组质粒是插入mdpvyy株完整基因组pyy质粒，或者是插入mdpvyy株完整基因组并引入遗传标记的pyyδ质粒。但是，本发明的拯救方法适用于但不仅限于插入mdpvyy株完整基因组的pyy质粒或pyyδ质粒。对其它mdpv分离株，以本发明内容公开的相同构建方法克隆其全基因组，获得重组质粒，重组质粒的拯救方法同pyy质粒或pyyδ质粒。

本发明所述的质粒pyy，它的构建方法在于：超速离心浓缩mdpvyy株病毒，提取病毒基因组单链dna，体外退火后生成双股dna。用ncoi酶切基因组dna生成两个亚基因组片段，分别克隆入自行改造的pbskn载体的相应酶切位点，在sure株大肠杆菌感受态细胞中增殖。再通过酶切-连接的常规分子操作，拼接获得含有完整基因组的质粒pyy。

进一步地，通过overlappcr方法，在pyy质粒的vp1基因中引入1个同义突变碱基作为遗传标记，获得质粒pyyδ。

本发明中所述相近的致病性是指在雏番鸭感染试验中，拯救病毒具有与亲本病毒相近的死亡率。

本发明公开了yy株的完整基因组序列。yy株基因组由5075个核苷酸组成(seqibno.7)。yy株itr由428个核苷酸组成，5′itr和3′itr具有一致的序列。该回文结构的茎部由342个核苷酸组成，通过碱基互补形成171个碱基对，45个核苷酸组成bubble区。itr内侧为d或d′区，由41个核苷酸组成。

作为一个具体的操作，本发明公开了一种mdpv全基因组克隆的构建方法，该方法对其它mdpv毒株同样适用，它包括如下步骤：

(1)mdpv核酸的提取

mdpvyy株在番鸭胚中增殖，收集的尿囊液分别经差速和超速离心浓缩到原有体积的1/60。采用sds-蛋白酶k消化法提取病毒核酸。经95℃变性10min，缓慢冷却至65℃退火，使单股dna形成双股dna，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，可观察到约5.1kb基因组dna。

(2)全基因组克隆的构建

将体外退火的mdpvyy株基因组双股dna用限制性内切酶ncoi酶切，产生两个亚基因组片段。将0.7kb基因组左片段插入质粒载体pbskn的hincii-ncoi之间，产生质粒pbskn-l。4.4kb基因组右片段插入质粒载体pbskn的ncoi-smai之间，产生质粒pbskn-r。pbsknb-l质粒和pbskn-r质粒分别用xhoi和ncoi进行双酶切，分别回收0.7kb和7.3kb片段，体外进行连接，连接产物转化sure感受态细胞(agilent,santaclara,usa)，最终产生包含yy株全基因组的克隆质粒pyy。

本发明还公开了pyy质粒中遗传标记引入的方法，以便于将拯救病毒与亲本病毒yy株区分开(见附图7)。

在pyy质粒的vp1基因中引入1个突变碱基作为遗传标记，不改变氨基酸组成，获得质粒pyyδ。利用yy株基因组内部在拟突变位点两侧分别存在单一bglii和kpni位点，设计了一组overlappcr引物，引物代号和序列分别为：

mp1:5′gtccggagcctgagag3′(seqibno.1)

mp2：5′gcaggtagatattctgttctgcca3′(seqibno.2)

mp3:5′tggcagaacagaatatctacctgc3′(seqibno.3)

mp4:5′atacctaatcagcctatc3′(seqibno.4)

酶切位点用单下划线标示，单个突变碱基用双下划线标示，碱基由t突变为c，突变后产生1个新的ecorv位点，但不改变氨基酸组成。

mp1引物和mp4引物内部分别含有bglii和kpni位点。通过overlappcr,结合酶切连接操作，能够将1个突变碱基引入pyy质粒，获得质粒pyyδ。

本发明还公开了pyyδ质粒通过绒毛尿囊膜转染番鸭胚拯救病毒的具体方法：

采用lipofectamine2000作为转染试剂。质粒和转染试剂的比例按照1：2.5(μg：μl)进行。吸取16μgpyyδ质粒溶液至1个灭菌的1.5ml离心管中，用opti-dmem培养液(invitrogen，美国)稀释至1ml；另一个离心管内加入40μllipofectamine2000转染试剂，加入960μlopti-dmem培养液混匀。将稀释后的质粒和转染试剂静置5min后，轻柔混匀，室温静置20min后即可进行转染。每只番鸭胚接种0.25ml质粒-转染试剂混合物于绒毛尿囊膜上,其中包含了2.0μg质粒。番鸭胚在接种后第6天开始出现死亡，至转染后第9天，死亡率达到83％。拯救病毒在番鸭胚上能够成功传代。

本发明对拯救病毒的致病性进行了测定。结果表明：以拯救病毒的新鲜尿囊液颈部皮下接种2日龄雏番鸭，死亡率达到56％，不死雏番鸭生长明显慢于对照组，表明拯救病毒具有与亲本病毒yy株相当的致病力。本发明建立的拯救方法操作简便高效，避免了转染原代细胞带来的繁琐和低效问题，在mdpv反向遗传学研究和疫苗创制上具有潜在应用价值。

附图说明

图1.mdpvyy株基因组dna的琼脂糖凝胶电泳分析。m.1kbdna分子量markers；1.基因组dna退火后形成的5.1kb双股dna分子。

图2.mdpvyy株感染性克隆pyy的构建策略

图3.pyy质粒示意图

图4.pyy质粒的酶切鉴定.m:1kbdnamarkers；1:ncoi酶切产生单一的8.0-kbdna条带.2:xhoi和bamhi双酶切产生3.0kb载体分子和5.0kbmdpv基因组分子。

图5.pyyδ转染11日龄番鸭胚，胚胎在第6天开始出现死亡，至转染后第10天死亡率达到83％，而转染pbskn质粒的对照鹅胚全部存活。

图6.pyyδ转染番鸭胚后胚胎死亡的病理变化，表现为胚体、头部、肢端出血(a),而转染pbskn对照质粒的番鸭胚发育正常(b)。

图7.pyy-2δ质粒转染拯救病毒与亲本病毒的区分。拯救病毒的1.4kb扩增片段能够为ecorv酶切成0.4kb和1.0kb两条带，而亲本病毒的1.4kb扩增产物不能为ecorv所切开。

图8.拯救病毒与亲本病毒序列的比较。拯救病毒与亲本病毒株yy具有一致的序列，除了在拯救病毒中引入的作为遗传标记的唯一碱基突变(t→c).

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下结合具体生物材料及参数对本发明进一步说明，不是对本发明的进一步限定。

实施例

1.mdpv全基因组克隆pyy的构建

1.1.病毒扩增

将保存的mdpvyy株(archivesofvirology,2016,161:2589-2594)种毒用灭菌生理盐水做1:10稀释，加入青、链霉素至终浓度各2000μg或2000iu/ml，置37℃培养箱中孵育30min后接种12日龄非免疫番鸭胚，每只0.2ml。石蜡封口后放入37℃孵化箱中，每隔8h照蛋1次，剔除48h前死亡的鹅胚。收集48小时后死亡番鸭胚，置于4℃冰箱放置4～6h后无菌收取尿囊液，储存在-40℃冰箱，备用。

1.2.病毒纯化

将收集到的300ml病毒尿囊液按11,000g离心20min，取上清后加入1/3体积的氯仿，剧烈震荡，以同样的离心力转速再次离心20min，收集上层水相再经150,000g离心力超速离心3h(sw32ti转子,beckman)。弃去上清，病毒沉淀用5mlte缓冲液(50mmtris，20mmedta，ph8.0)溶解，-70℃保存待用。

1.3病毒dna提取

取500μl浓缩病毒液，分别加入10％sds和蛋白酶k至终浓度为1％和400μg/ml。45℃水浴2小时。用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇(24:1)各抽提1次。上清液加入2.5倍体积的无水乙醇和十分之一体积的醋酸钠(ph5.2)，-70℃沉淀过夜。次日15,000rpm/min，离心20min，去上清，核酸沉淀用70％酒精洗涤，再次15,000rpm/min，离心8min，去上清，沉淀凉干后，用30μlste缓冲液(10mmtris，1mmedta，100mmnacl，ph8.0)溶解。将提取的核酸置于95℃水浴10min，使单股dna发生热变性，然后缓慢冷却到65℃，此时单股dna可退火形成双链。取10μl经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析dna，见附图1。

1.4基因组克隆

为了便于克隆，我们对pbluescriptii(sk)质粒(agilent公司，美国)的酶切位点进行了改造，将质粒上原有的ecorv酶切位点用ncoi位点替换，改造后的质粒命名为pbskn。该质粒的蓝白斑筛选特性保持不变。

mdpv在724位碱基处存在单一的ncoi位点。mdpv的dsdna用ncoi酶切，酶切产物电泳分离后，切胶回收目的胶块，用胶回收试剂盒纯化目的片段。将0.7kb基因组左片段插入质粒载体pbskn的hincii-ncoi之间，产生质粒pbskn-l。4.4kb右片段插入质粒载体pbskn的ncoi-smai之间，产生质粒pbskn-r,构建策略见附图2。pbsknb-l质粒和pbskn-r质粒分别用xhoi和ncoi进行双酶切，分别回收0.7kb和7.3kb片段，体外进行连接，连接产物转化sure感受态细胞(agilent,santaclara,usa)，最终产生包含yy株全基因组的克隆质粒pyy，见附图3。

pyy质粒的酶切鉴定。ncoi酶切产生单一的8.0-kbdna条带，用xhoi和bamhi双酶切产生3.0kb载体分子和5.0kbmdpv基因组分子，见附图4。

1.5基因组序列分析

将构建的pbskn-l和pbskn-r阳性克隆送商业化公司(苏州金唯智)进行测序。由于itr形成的高级结构会干扰测序反应，利用itrloop区天然存在的sphi位点，对pbskn-l和pbskn-r质粒，分别用sphi+bamhi或者sphi+xhoi进行双酶切，生成的亚片段将包含半个itr。将含有一半itr序列的亚片段克隆进puc19或者pbsk质粒的相应位点，对重组克隆进行测序后将获得一致的itr序列。

利用dnastar软件包中的seqmanii程序对所测序列进行拼接，获得完整的基因组序列，并提交genbank。(登录号kx000918)。

序列分析结果表明，yy株基因组由5075个核苷酸组成。yy株itr由428个核苷酸组成，5′itr和3′itr具有一致的序列。该回文结构的茎部由342个核苷酸组成，通过碱基互补形成171个碱基对，45个核苷酸组成bubble区。itr内侧为d或d′区，由41个核苷酸组成。

1.6pyy质粒的转染拯救

1.6.1pyy质粒纯化

挑取pyy克隆单个菌落，接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养基中，37℃震荡培养16～24h。采用高纯度质粒纯化试剂盒提取质粒，具体操作按照其说明书进行，质粒用超纯水溶解。采用nanodrop2000核酸测定仪，检测质粒浓度和纯度，确保od260/280在1.8-2.0之间。

1.6.2质粒-转染试剂混合物的配制

转染混合物的配制参照lipofectamine2000转染试剂(invitrogen,carlsbad,usa)说明书进行。质粒和转染试剂的比例按照1:2.5(μg:μl)进行。取16μg纯化的质粒溶液至1个灭菌的指形管中，用opti-dmem培养液(invitrogen)稀释至1ml；另一个离心管内加入40μllipofectamine2000转染试剂，加入960μlopti-dmem培养液混匀。将稀释后的质粒和转染试剂静置5min后，轻柔混匀，室温静置20min后即可进行转染

1.6.3转染番鸭胚

上述配制好的转染试剂，分别经绒毛尿囊膜途径接种11日龄番鸭，每只番鸭胚接种0.25ml,其中包含2.0μg质粒。同时将质粒载体pbskn转染番鸭胚作为对照。石蜡封口后放入孵化箱内继续孵育，每隔8h照胚1次，弃去48小时内死亡番鸭胚。收集转染48小时后死亡番鸭胚的尿囊液，-70冻存。

结果表明，pyy质粒转染11日龄番鸭胚，转染后第7天胚体开始死亡，至13天死亡率达到100％。收集尿囊液-70℃冻存。检查胚体病变，可见胚体、头部、肢端出血，绒毛尿囊膜水肿等特征性病变。

1.6.4拯救病毒的传代

将第1代的拯救病毒用灭菌生理盐水做1:50稀释，接种12日龄番鸭胚，收集死亡番鸭胚尿囊液，观察胚体病变。如此传至第4代，-70℃保存备用。

1.7拯救病毒中遗传标记的引入

为了排除拯救病毒可能来自于转染或传代过程中亲本病毒或mdpv野毒株污染的可能，采用overlappcr方法在pyy质粒内部vp1基因上游引入一个碱基突变(t→c)，突变后产生1个新的ecorv位点，但不改变氨基酸的组成。

1.7.1overlappcr引物设计

为了实现鉴别的目的，设计了一组重叠pcr引物，引物由大连宝生物有限公司合成，引物代号和序列分别为：

mp1:5′gtccggagcctgagag3′(seqibno.1)

mp2：5′gcaggtagatattctgttctgcca3′(seqibno.2)

mp3:5′tggcagaacagaatatctacctgc3′(seqibno.3)

mp4:5′atacctaatcagcctatc3′(seqibno.4)

mp1和mp4内部分别含有bglii和kpni位点，用斜体标示，突变碱基用双下划线标示。1.7.2overlappcr扩增

以pyy质粒为模板，以mp1引物和mp2引物扩增2109bp的a片段。反应体系为：primestarmaxpremix25μl，上下游引物各1μl，模板1μl，超纯水补至50μl体系。反应程序设定为：95℃,1min预变性；然后执行94℃，15s；55℃，退火25s，72℃,延伸23s，共25个循环；72℃，延伸10min结束。

以mp3引物和mp4引物扩增375bp的b片段。反应体系为：primestarmaxpremix25μl，上下游引物各1μl，模板1μl，超纯水补至50μl体系。反应程序设定为：95℃,1min预变性；然后执行94℃，15s；55℃退火25s，72℃延伸23s，共25个循环；72℃，10min结束。

a、b扩增片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，分别采用凝胶回收试剂盒(天根生物科技有限公司)切胶回收目的片段。

回收的a、b产物各取1μl混合后作为第二步pcr扩增反应的模板。以mp1和mp4为上下游引物。反应体系为：primestarmaxpremix25μl，模板1μl，超纯水补至48μl体系。反应程序设定为：95℃,1min变性；然后执行94℃，15s；54℃，25s，72℃,35s延伸，共5个循环。

上述反应结束后，再加入上下游引物各1μl执行以下反应程序：95℃,1min变性；然后执行94℃，15s；54℃，25s，72℃,35s延伸，共20个循环；72℃，10min补平结束反应。预期扩增片段为2.5kb。反应结束后，将50μlpcr反应产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的片段。目的片段用kpni和bglii双酶切，酒精沉淀酶切片段后，用20μl超纯水溶解。

1.7.3突变位点导入pyy质粒

将pyy用kpni和bglii双酶切，电泳分离线性化片段，然后切胶回收5.5kb片段。将前述回收的2.5kbpcr扩增片段与5.5kb片段连接，连接产物转入sure感受态细胞，涂布lb平板。采用ecorv酶切消化质粒的方法来鉴定阳性的突变插入克隆，并进一步用自带引物送商业化公司进行测序，确保在突变位点正确引入的同时，其它位点未发生改变。阳性克隆命名为pyyδ。

1.7.4遗传标记病毒的拯救

将pyyδ质粒转染番鸭胚。pyyδ转染11日龄番鸭胚，胚胎在第6天开始出现死亡，至转染后第10天死亡率达到83％，而转染pbskn质粒的对照鹅胚全部存活。实验方法同2.5，见附图5。pyyδ转染番鸭胚后胚胎死亡的病理变化，表现为胚体、头部、肢端出血(a),而转染pbskn对照质粒的番鸭胚发育正常(b)，见附图6。

拯救病毒在番鸭胚上传代4次。从尿囊液中提取病毒核酸，用m7和m8引物扩增含有突变位点的1.4kbdna片段，并用ecorv酶切鉴定。

m7：5′-ggaacaaacccagactcaaa-3′(seqibno.5)

m8：5′-ccaatcagcctatcttctacat-3′(seqibno.6)

结果表明，pyy-2δ质粒转染拯救病毒的1.4kb扩增片段用ecorv酶切，产生0.4kb和1.0kb的两个片段，而亲本病毒的1.4kb扩增片段无法用ecorv酶切，见附图7。

1.8遗传标记拯救病毒的雏番鸭感染试验

将32只2日龄易感雏番鸭随机分成2组。一组为感染组，颈部皮下注射0.4ml的新鲜的拯救病毒尿囊液原液；另一组16只雏番鸭感染仅注射生理盐水作为对照。雏番鸭分别在单独的房间隔离饲养18天，记录死亡个数和死亡时间，所有死亡雏番鸭均剖解观察病理变化并做病毒分离和pcr测序鉴定。

结果表明，2日龄雏番鸭接种后第6天开始出现死亡，至第13天死亡率达到56％，不死雏番鸭生长明显慢于对照组，表明拯救病毒具有与亲本病毒yy株相当的致病力。剖解病死番鸭，可见肝脏、脑淤血、出血，肾脏肿大，有尿酸盐沉积，肠道充出血，肠上皮粘膜脱落，某些病例可见胸腔有胶冻样渗出液。

从肠道、肝脏采集的病料经无菌处理后接种番鸭胚，能够使番鸭胚致死。取尿囊液检测，能够扩增出包含标记位点在内的mdpv特异片段。pcr产物直接测序，除了引入的突变碱基，其余序列与yy株完全一致，表明死亡雏番鸭确实死于拯救病毒感染所致，可以排除野毒感染的可能，见附图8。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法

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<213>番鸭细小病毒yy株

<400>7

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agtgcgtcaccggaagtcacgtgacaggaaacacgtcaccggaagtcacgtgaccggaag300

tcacatgaccggaagcacgtgaccggaacttacgtcacttcccccctcccctgattggct360

ggttcgaacgaacgaaccctccaatgagactcaaggacagcaggactttttgcgcgccag420

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gctctgctctcacagagaacggacctcaggtcaggaaaatggcattttctaggcctcttc540

agatttcttctgacaaattctatgaagttatcatcaggctaccctcggatattgatcaag600

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ccggaatatggaatatggagcatgtgaatctccccatggttactctggcagacaaaatca720

agaacattttcatccagagatggaaccaattcaatcaggacgaaacggatttcttctttc780

aattggaagaaggcagtgagtacatccatctgcattgctgtattgctcaggggaatgtcc840

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ggcaaaataagaccgtgactgctgcttatattctgcattacctgattcctaaaaaacaac1020

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