一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法，包括鉴定禽传染性支气管炎病毒的引物对探针。

背景技术

鸡传染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus,ibv)可引起鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性疾病，即鸡传染性支气管炎。该病以咳嗽、气管啰音和打喷嚏为主要特征，是对我国养鸡业危害最为严重的病毒性传染病之一，该病几乎在世界范围内所有的养鸡国家存在，在我国的流行呈上升趋势。ibv血清型众多，目前已报道30余种，不同血清型毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，相互间没有或仅有部分交叉免疫性，尤其是近些年，新的血清型不断出现，急需能够检测所有血清型的高通量检测方法用于临床诊断。传统检测方法已不适于现代疫病监测和诊断的需要，急需制定能够高通量检测、结果易于判定的荧光rt-pcr检测技术标准，用于我国鸡传染性支气管炎的诊断和防控。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法(taqman法)，以实现对禽传染性支气管炎病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一组特异性引物对和探针组，引物和探针具有序列表seqidno:1至seqidno:3的碱基序列，具体序列信息如下：

正向引物ibv-f：5′-ttgaaggtagyggygttcctga-3′(seqidno:1)

反向引物ibv-r：5′-cagmaacccacactataccatc-3′(seqidno:1)

探针ibv-probe：5′-acwggaacaggaccdgccgctgacct-3′(seqidno:1)；

其中探针的5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。

所提供的引物和探针在制备用于检测禽传染性支气管炎病毒的制品中的应用；

本发明再一个方面提供检测临床样品中禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法，包括如下的步骤：

1)配置荧光定量rt-pcr反应体系

反应液每管25μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，5u/μltakaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，10pmol/μl正向引物ibv-f、反向向引物ibv-r和探针ibv-probe各0.5μl，rnasefreedh2o8μl，待检测的样品rna模板2μl；

2)荧光定量rt-pcr反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环。保存文件，运行；

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；

质控标准:阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；

结果描述及判定:无ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测禽传染性支气管炎病毒的方法，以实现对禽传染性支气管炎病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用taqman荧光探针，避免传统sybrgreen染色法造成的污染和低特异性。

附图说明

图1：禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr优化的引物和探针设计示意图，其中引物位置由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。

具体实施方式

实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr)是在pcr定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对dna模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：引物及探针设计与筛选：

根据禽传染性支气管炎病毒的核衣壳蛋白基因(n基因)进行引物设计，通过ncbi查找到公开的306株包含各基因型禽传染性支气管炎病毒的n基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于151-480位的基因(参考序列genbank登录号：kj425486)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。

设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，上游引物所在区域对应的参考序列第212位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是a和g两种，因此引物序列中设计成简并碱基r，第218位和221位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是t和c两种，因此引物序列中设计成简并碱基y；下游引物所在区域对应的参考序列第401位和405位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是t和g两种，下游引物取参考序列的反向互补序列，对应a和c，因此引物序列中设计成简并碱基m。

上游引物ibv-f1：5′-ttgaaggtagyggygttcctga-3′(26bp)

上游引物ibv-f2：5′-ttgarggtagyggygttcctga-3′(23bp)

下游引物ibv-r1：5′-cagmaacccacactataccatc-3′(24bp)

下游引物ibv-r2：5′-cagmaacmcacactataccatc-3′(25bp)

以引物组对应目的条带区间为模板设计2条探针，进行最佳探针筛选，探针序列所在区域对应的参考序列第356位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基有a、t和g三种，因此探针序列中设计成简并碱基d；对应的参考序列第363位碱基，在306条序列中对应该位置的碱基主要是a和g两种，因此探针序列中设计成简并碱基r。探针的5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。修饰后探针序列如下：

ibv-p1：5′-hex-gaacaggaccdgccgctracc-bhq1-3′(29bp)

ibv-p2：5′-hex-actggaacaggaccdgccgctgacct-bhq1-3′(24bp)

2对引物和2条探针两两配对形成8个组合进行最佳引物和探针组合筛选。

组合1：ibv-f1、ibv-r1和ibv-p1

组合2：ibv-f1、ibv-r2和ibv-p1

组合3：ibv-f2、ibv-r1和ibv-p1

组合4：ibv-f2、ibv-r2和ibv-p1

组合5：ibv-f1、ibv-r1和ibv-p2

组合6：ibv-f1、ibv-r2和ibv-p2

组合7：ibv-f2、ibv-r1和ibv-p2

组合8：ibv-f2、ibv-r2和ibv-p2

引物对和探针的筛选包括如下步骤

1)配制荧光定量rt-pcr反应体系

反应液每管25μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，5u/μltakaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，10pmol/μlh7forward、h7reverse和h7probe各0.5μl，rnasefreedh2o8μl，待检测的样品rna模板2μl。

2)荧光定量rt-pcr反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

质控标准:阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果描述及判定:无ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

实验结果表明，相同反应条件，组合1的扩增效率优于其他7个组合，因此将组合1的引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：

正向引物ibv-f：5′-ttgaaggtagyggygttcctga-3′(seqidno:1)

反向引物ibv-r：5′-cagmaacccacactataccatc-3′(seqidno:1)

探针ibv-probe：5′-acwggaacaggaccdgccgctgacct-3′(seqidno:1)

探针的5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。

实施例2引物探针的检测灵敏度和特异性

检测灵敏度

设置7组不同浓度的禽传染性支气管炎病毒rna模板，进行实时荧光定量rt-pcr最适条件下的核酸扩增。

参照rna提取试剂盒说明书提取禽传染性支气管炎病毒rna，测定所提取的rna模板原始浓度(1ng/μl)，按照10倍梯度稀释成10^-1ng/μl，10^-2ng/μl，10^-3ng/μl，10^-4ng/μl，10^-5ng/μl，10^-6ng/μl，分别取2μl作为反应模板，按照前述加样方法进行荧光定量rt-pcr核酸扩增。

结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为rna终浓度10^-4ng/μl。

检测特异性

根据前述反应体系添加各组分，禽传染性支气管炎病毒rna模板(m41和h52)浓度为1ng/μl，非特异性病毒(h1亚型禽流感病毒，h3亚型禽流感病毒，h5亚型禽流感病毒，h7亚型禽流感病毒，h9亚型禽流感病毒，classⅰ型新城疫病毒，classⅱ型新城疫病毒)rna模板浓度分别为1ng/μl。检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。结果显示，除了禽传染性支气管炎病毒rna模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线(m41对应ct值为17.59，h52对应ct值为19.86)，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对禽传染性支气管炎病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例3：对实际样品的检测应用

采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份，其中鸡、鸭、鹅各10份。采用pbs液(ph7.0～7.4,0.01mol/l)作为保存液(含青霉素2000iu/ml、链霉素2000iu/ml、制霉菌素1000iu/ml，bsa5mg/ml)。样品采集后置于加冰的保温箱中、密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。

2.样品制备

将棉拭子置于装有1ml样品保存液的离心管中，涡旋混匀后弃去拭子。以上样品4℃3000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。

3.核酸提取

参照rna提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照rna。提取的rna须在2h内进行rt-pcr扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。

4.鉴定

4.1对比方法：参考国家标准《gb/t23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术》中的rt-pcr检测方法，作为对比方法。

引物序列：

3’s:5’-ggaagataggcatgtagctt-3’

3’x:5’-ctaactctatactagcctat-3’

ms:5’-cctaagaacggttggaat-3’

mx:5’-tactctctacacacacac-3’

4.2样品检测

采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。

4.3检测结果

结果显示，采用国标方法鉴定结果为4号、8号、16号、22号、23号和26号这6个样品以及阳性对照样品的rt-pcr扩增产物琼脂糖电泳时在740bp和290bp处分别有一条特异性条带，结果准确可信。采用本发明中的方法鉴定结果为4号、8号、16号、22号、23号和26号这6个样品以及阳性对照样品有hex荧光信号，出现扩增曲线，ct值分别为31.35、33.76、22.45、26.96、27.71、27.41和17.59，结果准确可信。

综上所述，这30份临床样品中，4号、8号、16号、22号、23号和26号这6个样品可以判定为禽传染性支气管炎病毒核酸阳性，其余样品均为阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定禽支气管炎病毒，具有良好的应用前景。

序列表

<110>中国动物卫生与流行病学中心

<120>一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttgaaggtagyggygttcctga22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cagmaacccacactataccatc22

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

acwggaacaggaccdgccgctgacct26