本发明属于植物提取分离技术领域，特别涉及一种汉麻仁提取物、提取分离方法及其应用。
背景技术
汉麻(cannabissatival.)，一年生草本植物，叶子呈掌状，有锯齿，花呈黄绿色。大麻干燥果实呈扁卵圆形，外果皮菲薄，内果皮坚脆，是一种药食同源物，有食疗，辅助治疗的功效。汉麻的发源地是亚洲，传入非洲，然后在8世纪传入北欧，接着在欧洲大地传播，西班牙人将汉麻传到秘鲁，法国人将其带入加拿大，英国人把它带入美国。目前，全球有大约三十个栽培工业汉麻的国家。20世纪时期，我国的东北、西北和长江中下游地区都有野生大麻，但由于其资源少量的原因，目前，野生大麻只有少数的存在于山东和新疆等地，大麻的大规模种植在安徽、内蒙古、广西、山西和河南等地，在陕西、湖北、湖南、宁夏等地为少数栽培。
汉麻仁提取物的营养价值和药用保健价值更高，经试验证明，汉麻仁提取物有一下作用和功效。药理作用：由于汉麻仁中含有丰富的蛋白质、脂肪酸及其酯、黄酮类、木质素酰胺类、生物碱类、大麻素类、甾体和萜类等，从而使汉麻仁呈现出多种多样的生理作用功效，如：抗神经炎性活性、预防便秘、降血糖、益智健脑、美白、抗衰老活性、改善肠道群落、抗紫外等作用。
汉麻仁中含有木质素酰胺类化合物、甾醇以及麻仁蛋白等都具有抗氧化活性。消除过氧化物的伤害，增强体质，有抗衰老功效。同时通过提高与老化相关的酶的活力，诱导防御系统，消除代谢产物，保护机体和细胞避免受到损伤，因而起到抗衰老、抗氧化的作用。大麻种子丸对患者的完全自发肠运动、便秘的严重程度和压力的缓解以及有效减少使用抢救治疗方面都有好处。因此大麻种子丸可以作为一种预防和治疗便秘的中药材使用。汉麻仁水提物能激发小鼠的肠道的黏膜的免疫系统，提高内容物的代谢，有利于维持肠道内微生态的稳固。本发明提供了一种汉麻仁的提取分离方法。
技术实现要素：
本发明的汉麻仁提取物可用于制备降血糖、美白、益智健脑等功能性保健品，应用前景好。
本发明提供了一种汉麻仁提取物，包含以下组分：式(1)所示的对羟基苯甲酸、式(2)所示的木犀草素、式(3)所示的芹菜素、式(4)所示的木犀草素-7-o-β-d-葡萄糖苷、式(5)所示的芹菜素-7-o-β-d-葡萄糖苷、式(6)所示的n-trans-coumaroyltyramine、式(7)所示的n-trans-caffeoyltyramine、式(8)所示的n-trans-feruloyltyranmine；
一种上述的汉麻仁提取物的提取分离方法，包括如下步骤：
s1，将榨油后的汉麻仁粉碎至粉末状，用体积浓度为90％的乙醇溶液渗漏提取3次，每次浸泡48h后再开始渗漏，合并三次提取液并减压浓缩，得浸膏；
s2，用水将s1中浸膏溶解，加入相当于浸膏水溶液2倍体积的石油醚萃取，混匀后静置，分层后保留水层溶液，再重复萃取2次，合并3次萃取所得水层溶液并减压浓缩，得提取物水溶液；
s3，将s2中的提取物水溶液经聚酰胺填料柱进行反相柱分离，然后用水-甲醇溶液进行梯度洗脱，得九种馏分，每种馏分分别经100-300目硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，然后选择反相柱chp、硅胶柱、sephadexlh-20反相柱中的一种或多种层析分离，得式(1)-(8)的8种汉麻仁提取物；
其中，水-甲醇溶液的体积比为100％～0％；二氯甲烷-甲醇溶液的体积比为70:1～0:1。
优选地，s2中减压浓缩的条件为：45℃、0.09mpa。
一种上述的汉麻仁提取物在制备降血糖、美白、益智健脑等功能性保健品上的应用。
优选地，所述汉麻仁提取物中羟基苯甲酸、木犀草素、芹菜素-7-o-β-d-葡萄糖苷、n-trans-feruloyltyranmine在抑制酪氨酸酶活性中的应用。
优选地，所述汉麻仁提取物中羟基苯甲酸、木犀草素、芹菜素-7-o-β-d-葡萄糖苷、n-trans-coumaroyltyramine、n-trans-feruloyltyranmine在抑制乙酰胆碱酯酶抑制活性中的应用。
优选地，所述汉麻仁提取物中羟基苯甲酸、木犀草素、n-trans-coumaroyltyramine、n-trans-feruloyltyranmine在抑制α-葡萄糖苷酶活性中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的汉麻仁提取物具有良好的酪氨酸酶抑制活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性，可用于制备降血糖、美白、益智健脑等功能性保健品，应用前景好，。
具体实施方式
下面对本发明的几个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种汉麻仁提取物的提取分离方法，包括以下步骤：
s1，将榨油后的15kg汉麻仁粉碎至粉状，用体积浓度为90％的乙醇溶液渗漏提取，溶剂充分没过样品，边倒溶剂边搅拌样品，浸泡48h，浸泡中进行搅拌，以防止样品沉降聚集，促使样品与溶剂充分混合，然后开始渗透，分别收集一次滤液和一次滤渣，一次滤液作为得到提取液，一次滤渣再按照上述步骤渗漏提取两次，分别收集二次滤液和二次提取液，合并三次提取液并45℃、0.09mpa条件下减压浓缩，得到浸膏。
s2，用水将s1中浸膏溶解，加入相当于浸膏水溶液2倍体积的石油醚萃取，混匀后静置，分层后保留水层溶液，再重复萃取2次，合并3次萃取所得水层溶液并旋转蒸发，得提取物水溶液；
其中，减压浓缩的条件为：45℃、0.09mpa。
s3，将s2中的提取物水溶液经聚酰胺填料柱进行反相柱分离，然后用水-甲醇溶液(100％～0％)进行梯度洗脱，得九种馏分：fr1(水-甲醇溶液(100％～90％))、fr2(水-甲醇溶液(90％～80％))、fr3(水-甲醇溶液(80％～70％))、fr4(水-甲醇溶液(70％～60％))、fr5(水-甲醇溶液(60％～50％))、fr6(水-甲醇溶液(50％～40％))、fr7(水-甲醇溶液(40％～30％))、fr8(水-甲醇溶液(30％～20％))、fr9(水-甲醇溶液(20％～0％))；
fr4用100-200目的硅胶为填料进行柱色谱分离，湿法装柱，用二氯甲烷和甲醇作为溶剂进行洗脱，梯度为50:1-0:1，合并得到6个馏分：fr4-1(二氯甲烷:甲醇为50:1-30:1)、fr4-2(二氯甲烷:甲醇为30:1-25:1)、fr4-3(二氯甲烷:甲醇为25:1-20:1)、fr4-4(二氯甲烷:甲醇为20:1-12:1)、fr5-5(二氯甲烷:甲醇为12:1-5:1)、fr6-6(二氯甲烷:甲醇为5:1-0:1)。对其中第三部分(二氯甲烷:甲醇为25:1-20:1)用反相柱chp进行分离，洗脱梯度为水-甲醇溶液(100％～0％)，当水-甲醇溶液为60％时，得式(2)化合物。
fr5用200-300目硅胶柱色谱分离，湿法上样，以二氯甲烷和甲醇溶剂作为洗脱剂洗脱，梯度为70:1-0:1，合并得到4个馏分：fr5-1(二氯甲烷:甲醇为70:1-45:1)、fr5-2(二氯甲烷:甲醇为45:1-30:1)、fr5-3(二氯甲烷:甲醇为30:1-15:1)、fr5-4(二氯甲烷:甲醇为15:1-0:1)。取第三部分(二氯甲烷:甲醇为30:1-15:1)用300-400目的硅胶反复柱层析，乙酸乙酯-石油醚为溶剂洗脱，梯度(10:1-0:1)，当乙酸乙酯:石油醚体积比为8:1得式(3)化合物，当乙酸乙酯:石油醚体积比为5:1得式(4)化合物。
fr6用100-200目硅胶柱色谱分离，湿法上样，溶剂为二氯甲烷和甲醇，梯度为60:1-0:1，得到5个馏分：fr6-1(二氯甲烷:甲醇为60:1-40:1)、fr6-2(二氯甲烷:甲醇为40:1-25:1)、fr6-3(二氯甲烷:甲醇为25:1-20:1)、fr6-4(二氯甲烷:甲醇为20:1-10:1)、fr6-5(二氯甲烷:甲醇为10:1-0:1)。对其中第四部分(二氯甲烷:甲醇为20:1-10:1)用反相柱chp进行分离，洗脱梯度为水-甲醇溶液(80％～0％)，当水-甲醇溶液为50％时，得式(5)化合物，当水-甲醇溶液为30％时，得式(1)化合物。
fr7用200-300目硅胶进行柱色谱分离，湿法上样，溶剂为二氯甲烷和甲醇，梯度为60:1-0:1，合并得到6个馏分：fr7-1(二氯甲烷:甲醇为60:1-40:1)、fr7-2(二氯甲烷:甲醇为40:1-25:1)、fr7-3(二氯甲烷:甲醇为25:1-20:1)、fr7-4(二氯甲烷:甲醇为20:1-15:1)、fr7-5(二氯甲烷:甲醇为15:1-8:1)、fr7-6(二氯甲烷:甲醇为8:1-0:1)。对其中第四部分(二氯甲烷:甲醇为20:1-15:1)用sephadexlh-20反相柱分离，湿法上样，洗脱梯度为水-甲醇溶液(50％～0％)，当水-甲醇溶液为40％时，得式(6)化合物，当水-甲醇溶液为20％时，得式(7)化合物。
fr8用100-200目硅胶进行柱色谱分离，硅胶拌样，洗脱溶剂为和二氯甲烷，梯度为70:1-0:1，合并得到5个馏分：fr8-1(二氯甲烷:甲醇为70:1-40:1)、fr8-2(二氯甲烷:甲醇为40:1-30:1)、fr8-3(二氯甲烷:甲醇为30:1-20:1)、fr8-4(二氯甲烷:甲醇为20:1-8:1)、fr8-5(二氯甲烷:甲醇为8:1-0:1)。对其中第三部分(二氯甲烷:甲醇为30:1-20:1)用sephadexlh-20反相柱分离，湿法上样，洗脱梯度为水-甲醇溶液(50％～0％)，当水-甲醇溶液为30％时，得式(8)化合物。综上所述，共分离得到(1)-(8)8种汉麻仁提取物。
为鉴定上述提取方法中分离得到的8种汉麻仁提取物是哪种物质，利用化学鉴定方法、hplc、nmr等方法鉴定，谱图数据如下：
对羟基苯甲酸(1):13c-nmr(400mhz,cd3od),δ132.96(c-1),130.26(c-2),116.32(c-3),1156.78(c-4),116.32(c-5),130.26(c-6),37.21(c-1'),31.27(c-2'),76.96(c-3'),。
木犀草素(2):13c-nmr(400mhz,dmso),δ163.9(c-2),103.9(c-3),181.6(c-4),157.3(c-5),98.9(c-6),164.2(c-7),93.9(c-8),161.5(c-9),103.7(c-10),119.1(c-1′),113.4(c-2′),145.8(c-3′),149.7(c-4′),115.9(c-5′),124.4(c-6′)。
芹菜素(3):13c-nmr(400mhz,dmso),δ163.2(c-2),102.3(c-3),181.2(c-4),156.8(c-5),98.4(c-6),163.7(c-7),93.7(c-8),160.9(c-9),110.0(c-10),120.9(c-1′),128.2(c-2′),115.8(c-3′),161.2(c-4′),115.6(c-5′),128.1(c-6′)。
木犀草素-7-o-β-d-葡萄糖苷(4):13c-nmr(400mhz,dmso),δ164.2(c-2),103.5(c-3),183.2(c-4),161.8(c-5),100.7(c-6),163.5(c-7),95.5(c-8),158.2(c-9),106.3(c-10),122.5(c-1′),114.5(c-2′),146.8(c-3′),150.4(c-4′),116.6(c-5′),120.5(c-6′),100.1(c-1”),73.2(c-2”),77.3(c-3”),70.6(c-4”),78.0(c-5”),61.2(c-6”)。
芹菜素-7-o-β-d-葡萄糖苷(5):13c-nmr(400mhz,dmso),δ164.5(c-2),103.5(c-3),182.2(c-4),161.8(c-5),100.7(c-6),163.5(c-7),95.5(c-8),158.2(c-9),106.3(c-10),122.5(c-1′),129.6(c-2′),116.8(c-3′),161.5(c-4′),116.6(c-5′),129.5(c-6′),100.1(c-1”),73.2(c-2”),77.3(c-3”),71.6(c-4”),77.9(c-5”),61.0(c-6”)。
n-trans-coumaroyltyramine(6):13c-nmr(400mhz,dmso),δ165.7(c-1),139.3(c-2),116.0(c-3),152.2(c-4),115.8(c-5),126.7(c-6),136.5(c-7),115.5(c-8),119.2(c-9),41.5(c-1′),35.6(c-2′),130.2(c-3′),129.4(c-4′),115.5(c-5′),156.6(c-6′),115.5(c-7′),129.7(c-8′)。
n-trans-caffeoyltyramine(7):13c-nmr(400mhz,cd3od),δ168.4(c-1),142.3(c-2),113.5(c-3),148.2(c-4),115.8(c-5),127.7(c-6),145.5(c-7),116.5(c-8),120.5(c-9),42.5(c-1′),35.7(c-2′),130.8(c-3′),129.8(c-4′),114.5(c-5′),155.6(c-6′),115.5(c-7′),129.7(c-8′)。
n-trans-feruloyltyranmine(8):13c-nmr(400mhz,cd3od),δ168.5(c-1),138.5(c-2),110.1(c-3),147.5(c-4),114.5(c-5),126.0(c-6),146.6(c-7),117.8(c-8),120.5(c-9),40.0(c-1′),34.0(c-2′),114.1(c-3′),128.5(c-4′),114.1(c-5′),154.3(c-6′),114.4(c-7′),128.5(c-8′),55.4(ome)。
上述数据表明这8中化合物分别为：对羟基苯甲酸(1)、木犀草素(2)、芹菜素(3)、木犀草素-7-o-β-d-葡萄糖苷(4)、芹菜素-7-o-β-d-葡萄糖苷(5)、n-trans-coumaroyltyramine(6)、n-trans-caffeoyltyramine(7)、n-trans-feruloyltyranmine(8)。结构式如下：
实施例2
一种上述汉麻仁提取物的分析方法，包括如下步骤：
1、用分析天平准确称取上述化合物1.0mg标准品，精确至0.001g，用0.2ml甲醇溶解，并定容至1.0ml容量瓶中，冷冻保存。分别取10μl、50μl、100μl、150μl、200μl上述标准溶液至1.0ml容量瓶，用甲醇定容，混匀后配制成浓度为10mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l的系列标准溶液，4℃冰箱中保存待用。
2、用高效液相色谱仪分别对浓度为50mg/l的8种标准品溶液进行检测，选择不同的流动相梯度洗脱方法，根据检测结构不断调整色谱条件，确定最佳色谱条件和吸收波长，最佳色谱条件为：色谱柱：phenomenexlunac-18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-水(含0.2％磷酸)系统，流速：1ml/min，柱温：30℃，进样量：15μl，检测波长：254nm和320nm。
用高效液相色谱仪分析上述配制的各化合物的系列标准溶液，进样量15μl，分别记录各化合物的峰面积，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，各化合物浓度在1-200μg/ml范围内时峰面积与浓度呈良好的线性关系，r2值均大于0.99。其中，高效液相色谱条件如表1。
表1高效液相色谱条件
色谱柱：phenomenexlunac-18(250mm×4.6mm，5μm)
柱温：30℃
流动相：a(0.2％磷酸水溶液)-b(乙腈)
流速：1ml/min
进样量：15μl
检测波长：254nm和320nm
各化合物标准曲线及其参数见表2：
表2汉麻仁提取物的标准曲线公式
3、准确称取榨油后的汉麻仁粉末5.0g，加入30ml甲醇，作为提取液，超声1h，过滤；滤液真空浓缩后定容至5ml，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后备用，取1ml注入hplc样品瓶中，4℃下保存待用。
分别精密吸取15μl各对照品溶液和供试品溶液，用高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，找出各对照品化合物对应的峰，记录其峰面积,将其峰面积代入标准曲线，分别计算各化合物的含量，结果见表3。
表3各化合物含量
实施例3
本发明汉麻仁提取物在制备降血糖、美白、益智健脑等功能性保健品上的应用。为验证其功效，作如下实验：
1、酪氨酸酶活性抑制实验
测定方法：将50μl浓度为1mg/ml的各样品溶液与80μlpbs溶液(ph＝6.8)和50μl酪氨酸酶溶液(120units/ml)加入96孔板中，最后向每个孔中加入20μl底物(l-酪氨酸)触发反应。96孔板在37℃下继续孵育30min，然后用酶标仪测定各孔在475nm处的吸光度值。溶剂：为溶解样品的溶剂(甲醇或dmso)，抑制率％＝[1-(c-d)/(a-b)]×100。结果如表5：
表4各组实验条件
表5酪氨酸酶活性抑制率
皮肤白不白，主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力。酪氨酸酶具有独特的双重催化功能，是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老有密切关系。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着性皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑，主要是通过抑制酪氨酸酶的活性而达到抑制黑色素合成，进而发挥美白的作用。
从活性实验结果中，对羟基苯甲酸(1)、木犀草素(2)、芹菜素-7-o-β-d-葡萄糖苷(5)、n-trans-feruloyltyranmine(8)有酪氨酸酶抑制活性，汉麻仁提取物具有美白的功效。
2、乙酰胆碱酯酶活性抑制实验
测定方法：测定方法：将实施例1提取物溶于dmso配成浓度为1.0mg/ml的溶液，在96孔板中，1、2、3列24孔中均加入140μl0.1mol/l磷酸缓冲液(ph为7.4)、20μl待测样品和20μl乙酰胆碱酯酶，作为样品组；
4、5、6列24孔中均加入160μl0.1mol/l磷酸缓冲液(ph为7.4)和20μl待测样品，作为控制组；7、8、9列3孔中均加入160μl0.1mol/l磷酸缓冲液(ph为7.4)和20μl乙酰胆碱酯酶，作为空白组；在4℃下培养20min后，每孔加入10μl15mmacti和10μl2mmdtnb，再在37℃下培养20min后，用酶标仪测定在412nm波长处的吸光值大小。用石杉碱甲作为阳性对照。
抑制率％＝[1-(od样品-od控制)/od空白]×100％，结果如表6：
表6乙酰胆碱酯酶活性抑制率
乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性酶，在胆碱能突触间，该酶能降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。乙酰胆碱酯酶参与细胞的发育和成熟，能促进神经元发育和神经再生。具有益智健脑的作用。
从活性实验结果中，对羟基苯甲酸(1)、木犀草素(2)、芹菜素-7-o-β-d-葡萄糖苷(5)、n-trans-coumaroyltyramine(6)、n-trans-feruloyltyranmine(8)具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，指示汉麻仁提取物具有益智健脑的功效。
3、α-葡萄糖苷酶活性抑制实验
测定方法：将实施例1提取物溶于dmso配成浓度为1.0mg/ml的溶液，在96孔板中，1、2、3列24孔中均加入20μl0.1mol/l磷酸缓冲液(ph为6.8)、20μl待测样品和20μlα-葡萄糖苷酶，作为样品组；
4、5、6列24孔中均加入40μl0.1mol/l磷酸缓冲液(ph为6.8)和20μl待测样品，作为控制组；7、8、9列3孔中均加入40μl0.1mol/l磷酸缓冲液(ph为6.8)和20μlα-葡萄糖苷酶作为空白组；在37℃下培养15min后，每孔加入20μl2.5mmol/lpnpg糖苷，再在37℃下培养15min后，每孔加入80μl0.2mol/lna2co3溶液终止反应。用酶标仪测定在405nm波长处的吸光值大小。用阿卡波糖作为阳性对照。抑制率％＝[1-(od样品-od控制)/od空白]×100％，结果如表7：
表7α-葡萄糖苷酶活性抑制率
葡萄糖苷酶是生物体内糖代谢途径中的重要成员，α-葡萄糖苷酶更是直接参与淀粉及糖原的代谢途径。通过抑制α-葡萄糖苷酶，可以降低唐化学代谢，从而达到降血糖的功效。
从活性实验结果中可以看出对羟基苯甲酸(1)、木犀草素(2)、n-trans-coumaroyltyramine(6)、n-trans-feruloyltyranmine(8)具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，指示汉麻仁提取物具有降血糖的功效。
实施例4
准确度实验：
精确称取汉麻仁6份，每份5g，以木犀草素为例，已知其含量为52.6μg/g，精确加入该对照品53μg，按供试品溶液的制备方法制备样品6份，高相液相色谱分析，并计算加样回收率，得其平均回收率为97.3％，rsd(％)≤3，并且回收率(％)于96％-100％，表示本发明的方法可靠。结构如表8：
表8回收率测定
稳定性实验
分别精确称取汉麻仁6份，每份5.0g，按照对照品的制备方法制备样品，hplc分析，进样量20μl，每个样品连续进样3次，记录木犀草素的峰面积计算其含量的平均值，计算rsd(％)值，rsd(％)≤2，表示本发明的方法稳定性好。结果见表9：
表9稳定性验证
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。