本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法。
背景技术
泛酸，又称遍多酸、维生素b5，广泛存在于生物界中，是动物体内合成辅酶a的主要原料，其主要作用是参与糖、脂肪和蛋白质的代谢。人体缺乏泛酸会引起肌肉酸痛或痉挛、肾上腺机能不足和减退、注意力不集中、手脚麻木、便秘、精力缺乏、轻微锻炼后即筋疲力尽、忧虑、紧张以及磨牙等症状。泛酸以其特有的生化功能广泛应用于医药、饲料和食品等领域。而d-泛解酸内酯(d-pl)则是合成d-泛酸系列产品最重要的手型中间体。
现有技术中通常只能由化学合成的方法制得dl-泛解酸内酯，在进行dl-泛解酸内酯的拆分。dl-泛解酸内酯的拆分方法大都是采用化学方法，其缺点是拆分剂昂贵，成本高，且分离困难。生物拆分方法中，采用微生物酶法拆分dl-泛解酸内酯，因具有环境污染和毒性少等特点而成为研究的一个重要方向。
微生物酶法拆分dl-泛解酸内酯的一种方式是利用产l-泛解酸内酯酶的微生物，分解dl-泛解酸内酯中的l-泛解酸内酯，得到未分解的d-构型泛解酸内酯；此方法的缺点只有l-构型的内酯被水解得非常彻底才能得到高光学纯度的d-泛解酸内酯，并且反应时间长，而且长时间的水解过程会导致一部分d-泛解酸内酯水解，导致得到的产物d-泛解酸内酯收率不高；另一种方式是利用产d-泛解酸内酯酶的微生物，选择性水解dl-泛解酸内酯中的d-泛解酸内酯，进而得到d-泛解酸，再将d-泛解酸进行内酯化生成d-泛解酸内酯；该方法水解时间短，虽然水解率不高(30％左右)，但未水解的l-泛解酸内酯可消旋后再利用，产物的总体收率较高，因此，成为现有技术中制备d-泛解酸和d-泛解酸内酯的主流方法。
现有技术中已知报道的能产生d-泛解酸内酯水解酶的菌株包括尖镰孢霉菌、串珠镰孢霉菌等，并且通过菌种活化以及产酶条件的优化，使得d-泛解酸的酶解效率有了很大的提高，但是，酶解液中目标产物的高效提取也是d-泛解酸酶解工艺中的一个难题。现有技术中对于d-泛解酸和/或d-泛解酸内酯的提取多以有机溶剂萃取法进行，即以乙酸乙酯为萃取溶剂提取未反应的l-泛解酸内酯和少了d-泛解酸内酯，而酶解的d-泛解酸则进入水相，再将水相中的d-泛解酸进行内酯化制得d-泛解酸内酯。但是，通常情况下，乙酸乙酯对d-泛解酸内酯的一次提取率只有70％左右，因此，常使得少量的d-泛解酸内酯依然残留于水相中。当然，这对于以d-泛解酸内酯为终产物的工艺而言，并没有什么影响，但对于以d-泛解酸为目标终产物的工艺而言，则存在着提取率尤其是一次提取率略低的问题，使得后续还需要进行额外精制处理，并且造成了d-泛解酸内酯的原料浪费。虽然现有技术中通过添加钠盐的方式进一步提高了乙酸乙酯对d-泛解酸内酯的提取率，但是，由于加入的钠盐会存在于水相中，对后续d-泛解酸的精制也造成一定的困扰。再者，以乙酸乙酯为萃取溶剂进行提取过程中，必须先经过加热灭酶的处理过程，以消除d-泛解酸内酯水解酶对乙酸乙酯进行水解产生的负面影响，也使得提取过程更为复杂。因此，如何从酶解液中高效提取d-泛解酸也成为d-泛解酸酶解工艺中亟待解决的问题。
技术实现要素：
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，包括如下步骤：
(1)取含d-泛解酸酶解液经固液分离去除菌体，收集上清液，备用；
(2)向所得上清液中加入含有疏水性离子液体的有机溶剂萃取，静置分层后，收集水相，即为含d-泛解酸水溶液。
所述步骤(2)中，所述疏水性离子液体为疏水性氨基酸离子液体。
所述步骤(2)中，所述疏水性氨基酸离子液体包括脯氨酸甲酯六氟磷酸盐。
所述步骤(2)中，所述疏水性离子液体与所述有机溶剂的体积比为3-5：100。
所述步骤(2)中，所述有机溶剂包括乙酸乙酯。
所述步骤(2)中，所述有机溶剂与所述上清液的体积比为1-2：1。
所述步骤(1)中，所述固液分离步骤为压滤或离心过滤。
所述步骤(1)中，还包括对所述酶解液进行预处理的步骤。
所述预处理步骤包括向所述酶解液中加入硅藻土混匀的步骤。
所述步骤(2)中，还包括将收集的含d-泛解酸水溶液经浓缩、结晶进行精制的步骤，得到d-泛解酸纯品。
本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，在现有d-泛解酸提取方法的基础上，通过对所述萃取溶剂进一步优化，使得以现有乙酸乙酯为萃取剂对酶解液中d-泛解酸的提取更为彻底，而疏水性离子液体的存在，有效改进了诸如d-泛解酸内酯、dl-泛解酸内酯和l-泛解酸内酯在有机相中的溶解情况，使得乙酸乙酯的一次提取率大大提高，对于本发明以d-泛解酸为目标提取物的工艺而言，有效排除了萃取后水相中其他物质的干扰，使得后续的精制处理过程更为简单；而且，本发明所述高效提取d-泛解酸的方法，疏水性离子液体的存在，有效抑制了d-泛解酸内酯水解酶对于乙酸乙酯的水解，使得整个提取方法无需对酶解液进行额外的灭酶处理，简化了提取的过程。
具体实施方式
实施例1
本实施例中提取所述d-泛解酸的酶解液为按照现有技术方法发酵产酶及酶解转化获得，即以野生型镰孢霉菌进行产酶发酵获得含有d-泛解酸内酯水解酶的粗酶液。所述培养基及培养条件可参照江南大学汤一新《微生物酶法拆分制备d-泛解酸内酯》中记载的产酶方法和酶解转化方法。
发酵培养基配方为：甘油1％，酵母膏1％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.4％，ph8.0，发酵产酶培养后收集粗酶液。
将化学法制备的dl-泛解酸内酯配制成浓度200g/l的水溶液，并加入30mmol/l的ca2+，于30、℃ph7.0条件下进行粗酶液转化酶解10h，获得酶解液。经检测，所得酶解液中含有d-泛解酸的含量为35.06g/l。
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，包括如下步骤：
(1)取上述制得的含d-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；
(2)按照1：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比3：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含d-泛解酸水溶液。经检测，所得含d-泛解酸水溶液中，d-泛解酸内酯的含量＜0.05g/l，dl-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，l-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，而所述d-泛解酸的含量＞35g/l。可见，本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法可有效的促进d-泛解酸与其他物质的一次性萃取分离，并提高了萃取效率。
所得含d-泛解酸水溶液经常规浓缩、结晶，即可得到d-泛解酸纯品。
实施例2
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，其提取酶解液与实施例1相同。
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，包括如下步骤：
(1)取上述制得的含d-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；
(2)按照2：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比5：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含d-泛解酸水溶液。经检测，所得含d-泛解酸水溶液中，d-泛解酸内酯的含量＜0.05g/l，dl-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，l-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，而所述d-泛解酸的含量＞35g/l。可见，本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法可有效的促进d-泛解酸与其他物质的一次性萃取分离，并提高了萃取效率。
实施例3
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，其提取酶解液与实施例1相同。
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，包括如下步骤：
(1)取上述制得的含d-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；
(2)按照1.5：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比4：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含d-泛解酸水溶液。经检测，所得含d-泛解酸水溶液中，d-泛解酸内酯的含量＜0.03g/l，dl-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，l-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，而所述d-泛解酸的含量＞35g/l。可见，本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法可有效的促进d-泛解酸与其他物质的一次性萃取分离，并提高了萃取效率。
实施例4
本实施例所述含d-泛解酸内酯水解酶的发酵液，按照如下步骤制得：
(1)将经过所述lb平板培养及活化培养的串珠镰孢菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为28℃，控制摇床转速150rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：甘油8g/l、荸荠浆25g/l、蛋白胨8g/l、天冬酰胺5g/l、硫酸铵3g/l，调ph7.0-8.0；所述荸荠浆为以洗净去皮的荸荠为原料，加入等量水经制浆所得；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5l发酵培养基的5l发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为28℃，搅拌速度为150rpm，通气量为1.5vvm，培养时间为40h，得到发酵菌液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖25g/l、甘油8g/l、荸荠浆35g/l、无氨基氮源10g/l、酵母膏10g/l、柠檬酸钠5g/l、缬氨酸硝酸盐6g/l、蜂胶10g/l、赤藓糖醇12g/l、mgso4.7h2o0.6g/l，k2hpo41.0g/l，调ph7.0-8.0；
发酵过程中，当发酵反应12h后开始进行150g/l的葡萄糖补料，控制补料速度为10l/h。
取化学合成的dl-泛解酸内酯配制成10％的水溶液，并加入占所述dl-泛解酸内酯添加量1％的醋酸钙，用naoh或hcl溶液调ph为7.0，作为酶催化反应底物。
取本实施例中制得发酵液经布氏漏斗滤纸抽滤，得到湿菌体；按照1g湿菌体/100ml底物溶液的添加量加入所述湿菌体，并控制ph为7.0，于28℃，控制摇床160r/min，进行酶转化反应8小时，得到酶解液。经检测，所述酶解液中d-泛解酸的含量为31.83g/l。
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，包括如下步骤：
(1)取上述制得的含d-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；
(2)按照1.5：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比4：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含d-泛解酸水溶液。经检测，所得含d-泛解酸水溶液中，d-泛解酸内酯的含量＜0.03g/l，dl-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，l-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，而所述d-泛解酸的含量＞31.75g/l。可见，本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法可有效的促进d-泛解酸与其他物质的一次性萃取分离，并提高了萃取效率。
实施例5
本实施例所述含d-泛解酸内酯水解酶的发酵液与实施例4相同。
取化学合成的dl-泛解酸内酯配制成70％的水溶液，并加入占所述dl-泛解酸内酯添加量2％的醋酸钙，用naoh或hcl溶液调ph为7.0，作为酶催化反应底物。
取实施例4中制得发酵液经布氏漏斗滤纸抽滤，得到湿菌体；按照1g湿菌体/100ml底物溶液的添加量加入所述湿菌体，并控制ph为7.0，于28℃，控制摇床160r/min，进行酶转化反应8小时。经检测，所述酶解液中d-泛解酸的含量为207.72g/l。
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，包括如下步骤：
(1)取上述制得的含d-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；
(2)按照1.5：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比4：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含d-泛解酸水溶液。经检测，所得含d-泛解酸水溶液中，d-泛解酸内酯的含量＜0.03g/l，dl-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，l-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，而所述d-泛解酸的含量＞207.5g/l。可见，本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法可有效的促进d-泛解酸与其他物质的一次性萃取分离，并提高了萃取效率。
实施例6
本实施例所述含d-泛解酸内酯水解酶的发酵液与实施例4相同。
取化学合成的dl-泛解酸内酯配制成40％的水溶液，并加入占所述dl-泛解酸内酯添加量1.5％的醋酸钙，用naoh或hcl溶液调ph为7.0，作为酶催化反应底物。
取实施例3中制得发酵液经布氏漏斗滤纸抽滤，得到湿菌体；按照1g湿菌体/100ml底物溶液的添加量加入所述湿菌体，并控制ph为7.0，于28℃，控制摇床160r/min，进行酶转化反应8小时。经检测，所述酶解液中d-泛解酸的含量为128.38g/l。
本实施例所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，包括如下步骤：
(1)取上述制得的含d-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；
(2)按照1.5：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比4：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含d-泛解酸水溶液。经检测，所得含d-泛解酸水溶液中，d-泛解酸内酯的含量＜0.03g/l，dl-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，l-泛解酸内酯的含量＜0.02g/l，而所述d-泛解酸的含量＞128g/l。可见，本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法可有效的促进d-泛解酸与其他物质的一次性萃取分离，并提高了萃取效率。
对比例1
本实施例所述酶解液以及从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法同实施例3，其区别仅在于，所述萃取溶剂仅为乙酸乙酯。经检测，所得水相中，d-泛解酸内酯的含量＞5g/l，dl-泛解酸内酯的含量＞30g/l，l-泛解酸内酯的含量＞20g/l，而所述d-泛解酸的含量＜32g/l。
对比例2
本实施例所述酶解液以及从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法同实施例3，其区别仅在于，所述萃取溶剂为加入饱和氯化钠的乙酸乙酯。经检测，所得水相中，d-泛解酸内酯的含量＞3g/l，dl-泛解酸内酯的含量＞20g/l，l-泛解酸内酯的含量＞14g/l，而所述d-泛解酸的含量＜32g/l。
由此可见，本发明所述从酶解液中高效提取d-泛解酸的方法，通过对所述萃取溶剂进一步优化，使得以现有乙酸乙酯为萃取剂对酶解液中d-泛解酸的提取更为彻底，而疏水性离子液体的存在，有效改进了诸如d-泛解酸内酯、dl-泛解酸内酯和l-泛解酸内酯在有机相中的溶解情况，使得乙酸乙酯的一次提取率大大提高，对于本发明以d-泛解酸为目标提取物的工艺而言，有效排除了萃取后水相中其他物质的干扰，使得后续的精制处理过程更为简单；而且，本发明所述高效提取d-泛解酸的方法，疏水性离子液体的存在，有效抑制了d-泛解酸内酯水解酶对于乙酸乙酯的水解，使得整个提取方法无需对酶解液进行额外的灭酶处理，简化了提取的过程。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。