一种快速鉴定新疆两种同域分布的雅罗鱼分子生物学方法与流程

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种快速鉴定新疆两种同域分布的雅罗鱼分子生物学方法。

技术背景

贝加尔雅罗鱼(leuciscusbaicalensis)，又称小白鱼、小白条。高体雅罗鱼(leuciscusidus)，又称中白鱼，二者均隶属鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，雅罗鱼属，我国仅分布于新疆额尔齐斯河和乌伦古河水系，是该流域的重要土著经济鱼类。其中，高体雅罗鱼由于肉质鲜嫩，营养价值高，近年来捕捞压力过大，资源量急剧下降，2006年已被列入自治区二级保护鱼类，是自治区重点保护水生野生动物。二者在形态学分类检索表上的差异仅体现在侧线鳞数量(前者46-52，后者56-61)和体长与体高比值(前者体长/体高约3.7-4.5，后者体长/体高约3.2-3.7)的微小差别上，尤其在幼鱼期，仅凭肉眼很难进行区分，容易造成误捕导致高体雅罗鱼资源的进一步破坏。因此，有必要选择一种快速、准确的检测方法，对二者进行区分和鉴别。目前，利用线粒体12srrna基因序列作为分子标记被广泛地应用到鱼类分子群体遗传学及系统发生学等领域，然而却缺乏扩增鱼类线粒体12srrna基因的通用引物，给相应的研究带了一定的困难。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种科学有效、简单快捷、准确可行，特异性强、可信度高，不用处死雅罗鱼，能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点的鉴别雅罗鱼的分子生物学方法。

本发明针对

背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：

一种快速鉴定新疆两种同域分布的雅罗鱼分子生物学方法，包括如下步骤：

采用改良酚-氯仿法分别提取雅罗鱼组织的基因组dna；

设计线粒体12srrna基因的引物；

以两种鱼的dna为模板，进行pcr扩增；

pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选条带清晰的pcr产物进行测序；

序列比对；

改良酚-氯仿法用组织提取液含有10mmtris-cl、0.1medta、0.32mmdte、0.04mmbj-br、0.5％sds；组织提取液的ph为7.8。该组织提取液中各组分能够发挥增益作用，提高提取液对尾鳍组织的消化效果，提高释放出的蛋白质的量，同时能够在加入蛋白酶k后促进其活性，使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并刺激细胞释放出的rna酶活性，降低蛋白质和rna对dna的污染，获得高质量的基因组dna，提取的dna条带清晰明亮、整齐、无降解现象，无拖带现象，a260/a280比值在1.79-1.83之间，能够提高pcr扩增结果的稳定性和准确性，扩增出了理想的目的片段，方便计算个体间k2p遗传距离的大小，进而提高分子生物学鉴定方法的准确性和可信度。

线粒体核糖体基因12srrna基因进化速率慢于控制区和蛋白编码基因，适合于种或种上水平的检测。本发明采用分子生物技术的手段，目的是针对两种同域分布的雅罗鱼的形态鉴定不准确，科学鉴别手段缺乏不足等问题，提供了一种科学有效、简单快捷、准确可行的分子生物学鉴定方法。同时也为这两种新疆特有雅罗鱼类的种质资源保护和开发利用提供保障。本发明通过分子克隆技术，通过选择线粒体核糖体基因12srrna基因、扩增并测序比对了两种鱼类线粒体核糖体基因12srrna基因，查明变异位点差异来鉴别新疆两种同域分布的雅罗鱼，为二者提供了一种科学有效、简单快捷、准确可行的分子生物学鉴定方法，具有特异性强、可信度高的优势。

作为优选，雅罗鱼组织取自尾鳍组织。本发明只需剪去少量尾鳍组织，不用处死雅罗鱼。

作为优选，设计线粒体12srrna基因的引物的具体步骤为：从genbank数据库中下载雅罗鱼的rdna序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的12srrna上设计扩增线粒体12srrna基因的引物。

作为优选，线粒体12srrna基因的引物序列为：

12sp：5’-atagcactgaagatgctaag-3’；

12sv：5’-gcatggatgtcttctcggtg-3’。本发明用引物可以高效和特异地扩增雅罗鱼的线粒体12srrna基因，增大pcr反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点。

作为优选，pcr扩增反应总体积50μl，其中10×buffer5.0μl，mg²⁺终浓度为2.0mm，2.5mmdntp4μl，taq聚合酶2units，10μm引物各2μl，1μgdna模板2μl，加灭菌水至终体积50μl。

作为优选，pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明通过分子克隆技术，通过选择its1基因、扩增并测序比对了两种鱼类线粒体12srrna基因，查明变异位点差异来鉴别雅罗鱼，为二者提供了一种科学有效、简单快捷、准确可行的分子生物学鉴定方法，具有特异性强、可信度高的优势，同时也为其种质资源保护和开发利用提供保障；2)本发明只需剪去少量尾鳍组织，不用处死雅罗鱼；3)本发明用引物可以高效和特异地扩增雅罗鱼的线粒体12srrna基因，增大pcr反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点。

附图说明

图1是本发明实施例2贝加尔雅罗鱼和高体雅罗鱼12srrna基因序列比较。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种快速鉴定新疆两种同域分布的雅罗鱼分子生物学方法，包括如下步骤：

1)采用改良酚-氯仿法分别提取雅罗鱼组织的基因组dna；

2)设计线粒体12srrna基因的引物；

3)以两种鱼的dna为模板，进行pcr扩增；

4)pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选条带清晰的pcr产物进行测序；

5)序列比对；

改良酚-氯仿法用组织提取液含有10mmtris-cl、0.1medta、0.32mmdte、0.04mmbj-br、0.5％sds；组织提取液的ph为7.8。该组织提取液中各组分能够发挥增益作用，提高提取液对尾鳍组织的消化效果，提高释放出的蛋白质的量，同时能够在加入蛋白酶k后促进其活性，使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并刺激细胞释放出的rna酶活性，降低蛋白质和rna对dna的污染，获得高质量的基因组dna，提取的dna条带清晰明亮、整齐、无降解现象，无拖带现象，a260/a280比值在1.79-1.83之间，能够提高pcr扩增结果的稳定性和准确性，扩增出了理想的目的片段，方便计算个体间k2p遗传距离的大小，进而提高分子生物学鉴定方法的准确性和可信度。。

线粒体核糖体基因12srrna基因进化速率慢于控制区和蛋白编码基因，适合于种或种上水平的检测，采用分子生物技术的手段，目的是针对两种同域分布的雅罗鱼的形态鉴定不准确，科学鉴别手段缺乏不足等问题，提供了一种科学有效、简单快捷、准确可行的分子生物学鉴定方法，同时也为这两种新疆特有雅罗鱼类的种质资源保护和开发利用提供保障，本发明通过分子克隆技术，通过选择线粒体核糖体基因12srrna基因、扩增并测序比对了两种鱼类线粒体核糖体基因12srrna基因，查明变异位点差异来鉴别新疆两种同域分布的雅罗鱼，为二者提供了一种科学有效、简单快捷、准确可行的分子生物学鉴定方法，具有特异性强、可信度高的优势。

步骤1用雅罗鱼组织取自尾鳍组织。只需剪去少量尾鳍组织，不用处死雅罗鱼。

设计线粒体12srrna基因的引物的具体步骤为：从genbank数据库中下载雅罗鱼的rdna序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的12srrna上设计扩增线粒体12srrna基因的引物。

线粒体12srrna基因的引物序列为：

12sp：5’-atagcactgaagatgctaag-3’；

12sv：5’-gcatggatgtcttctcggtg-3’。该引物可以高效和特异地扩增雅罗鱼的线粒体12srrna基因，增大pcr反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点。

步骤3中pcr扩增反应总体积50μl，其中10×buffer5.0μl，mg²⁺终浓度为2.0mm，2.5mmdntp4μl，taq聚合酶2units，10μm引物各2μl，1μgdna模板2μl，加灭菌水至终体积50μl。

步骤3中pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。

步骤4中测序结果显示获得片段长度为954bp的序列。

步骤5中序列比对共发现14处碱基突变位点，分别为38bp、62bp、185bp、277bp、308bp、392bp、398bp、417bp、456bp、477bp、670bp、680bp、760bp、889bp。

实施例2：

一种快速鉴定新疆两种同域分布的雅罗鱼分子生物学方法，包括如下步骤：

1)两种雅罗鱼样本均采自新疆额尔齐斯河流域，经形态学和解剖学鉴定确认后，分别剪取新鲜尾鳍组织用无水乙醇浸泡固定，带回实验室后置于-20℃冰箱保存，采用改良酚-氯仿法分别提取雅罗鱼组织的基因组dna；改良酚-氯仿法用组织提取液含有10mmtris-cl、0.1medta、0.32mmdte、0.04mmbj-br、0.5％sds；组织提取液的ph为7.8；

2)设计线粒体12srrna基因的引物：从genbank数据库中下载雅罗鱼的rdna序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的12srrna上设计扩增线粒体12srrna基因的引物，线粒体12srrna基因的引物序列为：

12sp：5’-atagcactgaagatgctaag-3’；

12sv：5’-gcatggatgtcttctcggtg-3’；

3)以两种鱼的dna为模板，进行pcr扩增，扩增反应总体积50μl，其中10×buffer5.0μl，mg²⁺终浓度为2.0mm，2.5mmdntp4μl，taq聚合酶2units，10μm引物各2μl，1μgdna模板2μl，加灭菌水至终体积50μl，扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min；

4)pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选条带清晰的pcr产物进行测序。

5)序列比对：具体如图1所示，其中字母表示变异位点，圆点表示相同碱基，bje表示贝加尔雅罗鱼，gt表示高体雅罗鱼。

步骤4中测序结果显示获得片段长度为954bp的序列。

步骤5中序列比对共发现14处碱基突变位点，分别为38bp、62bp、185bp、277bp、308bp、392bp、398bp、417bp、456bp、477bp、670bp、680bp、760bp、889bp。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>浙江海洋大学

<120>一种快速鉴定新疆两种同域分布的雅罗鱼分子生物学方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(12sp)

<400>1

atagcactgaagatgctaag20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(12sv)

<400>2

gcatggatgtcttctcggtg20