基于数字PCR技术检测猪圆环病毒3型菌的引物和探针及其试剂盒与方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，涉及一种基于数字pcr技术检测猪圆环病毒3型的引物和探针及其试剂盒与方法。
背景技术：
：猪圆环病毒(porcinecircovirus,pcv)是一种小型、无包膜、单链环状dna病毒，属于圆环病毒科属。猪圆环病毒主要有三个基因型，即pcv1，pcv2和pcv3。其中，pcv1不具有致病性，pcv2有致病性，与猪的多种疾病有关联，如断奶仔猪多系统衰竭综合征，皮炎，肾病综合征及及先天性震颤等。pcv3是2016年美国首次发现的病毒，能导致猪生殖失败，新生儿仔猪严重流失等症状。我国辽宁、江西、重庆等养殖场都已检测到病原体。目前，猪圆环病毒已遍及世界各养猪国家和地区，在我国猪群中已广泛流行，给养猪业造成了巨大损失。猪圆环病毒3型作为一种新型病毒，目前在我国的地理分布、流行情况、组织向性、在疾病中的作用和来源尚不清楚。为此，建立早期快速检测方法对猪圆环病毒3型的研究、预防和控制具有十分重要的意义。目前，实验室常用的检测猪圆环病毒的方法有细菌分离、电镜法、血清学诊断技术(免疫组织化学检测、免疫荧光、酶联免疫吸附试验等)和分子生物学检测技术(常规pcr和实时荧光定量pcr等)。传统的细菌分离和血清学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。pcr操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光pcr需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性。数字pcr(digitalpcr，dpcr)是近十年来兴起的第三代pcr技术，其原理是将预混的pcr反应体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过pcr扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。与实时荧光pcr相比，该方法具有精准、灵敏度超高和不易受pcr抑制物影响等优点。而现有技术并没有利用数字pcr技术针对猪圆环病毒3型进行绝对定量检测的相关研究以及是否可行的相关方案及适合产业化的成品试剂盒。因此，开发相关利用数字pcr技术对猪圆环病毒3型进行检测的方法和试剂可解决上述现有技术的局限性。技术实现要素：有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于数字pcr技术检测猪圆环病毒3型的引物和探针。本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于数字pcr技术检测猪圆环病毒3型的试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：一方面，本发明提供了一种基于数字pcr技术检测猪圆环病毒3型的引物和探针，包括上游引物fp、下游引物bp、探针probe，其核苷酸序列分别如下所示：fp：5’-ggttccaacggaaatgacgtt-3’(seqidno：1)；bp：5’-gcccacagctggcacatac-3’(seqidno：2)；probe：5’-fam-atggtggagtatttctt-mgb-3’(seqidno：3)，其中5端标记的荧光基团是fam，3端标记的淬灭基团是mgb。优选地，扩增反应时，fp引物、bp引物和探针的摩尔比为4：4：2。另一方面，本发明还公开了一种基于数字pcr技术检测猪圆环病毒3型的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的引物和探针。优选地，基于数字pcr技术检测猪圆环病毒的试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddpcrsupermix；(2)无rna酶的蒸馏水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)病毒总dna提取试剂。优选地，所述的2×ddpcrsupermix含有：2×pcrbuffer，2×taqdnapolymerase,16μmfp引物，16μmbp引物，20μm探针，400μmdntpmix和2×rnasecocktail。优选地，所述的2×pcrbuffer含有20mmtris-hcl(ph8.3)，50mmmgcl2，20mmkcl和2mg/mlbsa。优选地，阳性对照为猪圆环病毒3型dna，阴性对照为超纯水。优选地，病毒总dna提取试剂包括裂解液a、洗液b、洗液c、洗脱液d、吸附柱和收集管。再有，本发明还公开了一种基于数字pcr技术检测猪圆环病毒3型试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)病毒总dna的提取1)取待检样品1g，加入600μl裂解液a研磨后，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；3)丢弃收集管中液体，加入500μl洗液b至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；4)丢弃收集管中液体，加入500μl洗液c至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；5)丢弃收集管中液体，12,000×g离心2分钟以甩干柱子；6)将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，向柱子中央加入洗脱液50μl，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，离心管中液体即为模板dna；(2)数字pcr操作1)待检样品、阴性对照和阳性对照每个反应管各加入数字pcr反应液19μl；分别取1μl模板dna，加入相应的反应管中，配置成20μl数字pcr反应体系；所述模板dna包括待检样品、阴性对照和阳性对照；2)将20μl样品反应液加入到微滴发生卡内，制备微滴；3)将微滴转入pcr板中，放入pcr仪中进行扩增；4)将扩增完成的pcr板放入微滴分析仪中，检测微滴中的荧光信号，分析数据，显示检测结果；5)结果判定及描述：阳性对照：40±2个拷贝，阴性对照：＜1个拷贝时，实验结果成立；待检测样品结果≥1个拷贝时为阳性；待检测样品结果＜1个拷贝时为阴性。优选地，数字pcr反应体系为20μl反应体系，其含有2×ddpcrsupermix10μl，超纯水9μl，加入1μl模板后为20μl。优选地，扩增程序为：60℃反应30min；95℃反应5min；94℃反应30sec，60℃反应60sec，40个循环；98℃反应10min；每步都设置2.5℃/sec的升降温速度。本发明以微滴数字pcr(dropletdigitalpcr，ddpcr)技术为依托，开发基于数字pcr技术绝对定量检测猪圆环病毒3型的试剂盒及检测方法。目前尚未有将微滴数字pcr技术应用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒。本试剂盒能够在短时间内实现猪圆环病毒3型的快速、精准定量，为猪圆环病毒病的早期诊断提供有力的技术支持，有着广阔的应用前景和产业化前景。因此，相比于现有的其他检测技术，本发明技术具有精准、灵敏、适用性广等优点：(1)结果精准：实现绝对定量，不依赖ct值，无需标准曲线，更精准的检测病毒含量，为猪病诊断提供准确的诊断依据；(2)灵敏度高：可检测单拷贝模板；(3)适用性广：适用复杂样品检测，不易受pcr抑制物影响。因此，本方法克服了现有实时荧光pcr依赖标准曲线的限制，可实现精准的绝对定量，无需依赖标准曲线；灵敏度超高，检测限低至单拷贝，可实现猪圆环病毒3型病诊断的早发现、早治疗，可有效避免大面积爆发猪疫病而导致经济损失。附图说明图1是本发明实施例3中特异性实验的检测结果图。图1中，1：阳性对照；2：pcv1；3：pcv2；4：猪呼吸道和生殖综合征病毒；5：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；6：猪伪狂犬病毒；7：猪细小病毒；8：经典猪热病病毒；9：猪胸膜肺炎放线杆菌；10：阴性对照。图2是本发明实施例4中实时荧光pcr试剂盒的灵敏度实验结果图。图3是本发明实施例4中数字pcr试剂盒的最低检测限结果荧光图。图4是本发明实施例4中数字pcr检测盒的最低检测限结果拷贝数图。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1基于数字pcr技术绝对定量检测猪圆环病毒3型的试剂盒的建立基于数字pcr技术绝对定量检测猪圆环病毒3型的试剂盒，包括引物组、2×ddpcrsupermix、无rna酶的超纯水、病毒总dna提取试剂、阳性对照和阴性对照。(1)数字pcr扩增引物设计：以猪圆环病毒3型特异性保守序列为靶基因进行引物的设计。引物序列见表1。表1引物序列表(2)2×ddpcrsupermix含有：2×pcrbuffer，2×taqdnapolymerase,16μmfp，16μmbp引物、20μm探针，400μmdntpmix和2×rnasecocktail。(3)阳性对照为猪圆环病毒3型dna，阴性对照为超纯水。(4)细菌总dna提取试剂包括裂解液a、洗液b、洗液c、洗脱液d、吸附柱和收集管。实施例2基于数字pcr技术绝对定量检测猪圆环病毒3型的检测方法利用实施例1的试剂盒检测猪圆环病毒3型的方法，包括如下步骤：(1)病毒dna的提取：1)取待检样品1g，加入600μl裂解液a研磨后，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；3)丢弃收集管中液体，加入500μl洗液b至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；4)丢弃收集管中液体，加入500μl洗液c至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；5)丢弃收集管中液体，12,000×g离心2分钟以甩干柱子；6)将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，向柱子中央加入洗脱液50μl，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，离心管中液体即为模板dna。(2)数字pcr操作1)设待检样品、阴性对照和阳性对照样品数总和为n，反应体系配置如下：表2数字pcr反应体系名称体系2×ddpcrsupermix11×(n+1)μl无rna酶的蒸馏水8×(n+1)μl将以上配置的反应体系充分混匀后，分装至每个反应管各19μl。其中，2×ddpcrsupermix含有2×pcrbuffer5μl，2×taqdnapolymerase0.5μl,16μmfp和bp引物各0.5μl、20μm探针0.2μl，400μmdntpmix4μl和2×rnasecocktail0.3μl。2)分别取1μl模板dna(包括待检样品、阴性对照和阳性对照)，加入相应的反应管中，终体积为20μl。3)将一个新的微滴发生卡放入卡托中，将20μl样品反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔中，不足8个样品时用20μl去离子水补足，建议使用8通道排枪，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈现大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后缓慢提升枪头位置再打出余下液滴，不要将枪打至第一档位置以免引入气泡；4)在微滴发生卡最底下一排8个孔中加入70μl微滴生成油，同样不能有空着的孔；5)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢；6)将卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成；7)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8通道排枪小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μl，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40μl，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫；8)转移油滴进入96孔板内完成后，用预热好的px1热封仪对其进行封膜(红线朝上)，运行程序为：180℃，5sec，无需颠倒方向二次封膜；9)封好膜之后应该在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr。扩增程序为：60℃反应30min；95℃反应5min；94℃反应30sec，60℃反应60sec，40个循环；98℃反应10min。每步都设置2.5℃/sec的升降温速度。10)将pcr扩增完成的96板放入微滴分析仪的plateholder中，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。11)打开quantasoft软件，建议每次实验之前做一次flushsystem，若一周以上未使用建议先做一次prime再做flushsystem。然后对96孔板中样品信息进行设置，完成后即可进行检测，结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。12)结果判定及描述：阳性对照：40±2个拷贝，阴性对照：＜1个拷贝时，实验结果成立；待检测样品结果≥1个拷贝时为猪圆环病毒3型阳性；待检测样品结果＜1个拷贝时为猪圆环病毒3型阴性。实施例3特异性验证用本发明试剂盒分别检测临床得到的pcv1、pcv2、猪呼吸道和生殖综合征病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、经典猪热病病毒、及健康猪的血清样本，并设阳性和阴性对照样品，共10份样品，所有样品均经过测序法验证，检测结果见图1。实验结果显示，阳性样本数字pcr扩增后，阈值线以上出现阳性液滴，即有扩增。而pcv1、pcv2、猪呼吸道和生殖综合征病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、经典猪热病病毒、及健康猪的血清样本提取的模板dna经过数字pcr扩增后，荧光信号值处于阈值线以下，即无扩增(见图1)。由此可见，利用本发明的数字pcr试剂盒检测猪圆环病毒3型特异性良好。实施例4数字pcr试剂盒与实时荧光pcr灵敏度对比用本发明试剂盒与市售实时荧光定量pcr试剂盒进行灵敏度实验。实时荧光定量pcr试剂盒配置体系和操作步骤参照说明书。实验结果显示，实时荧光定量pcr的灵敏度为1fg/ul的pcv3模板dna浓度(见图2)，本发明试剂盒灵敏度(见图3和图4)为0.5fg/ul的pcv3模板dna浓度，拷贝数为4.4copies/ul。上述的实验结果可以说明本试剂盒及方法准确性高，特异性强，灵敏度比实时荧光定量高2倍。实施例5实际样品验证用本发明试剂盒对实际样本进行检测，检测临床得到的猪圆环病毒疑似病料50份，同时用测序法验证，其中，本发明试剂盒和测序法检测均为阳性的有10例，检测方法均为阴性的有40例，检测结果表3所示：表3上表的实验结果可以说明本试剂盒及方法准确性高，特异性强，与测序法有很高的一致性。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。sequencelisting<110>暨南大学<120>基于数字pcr技术检测猪圆环病毒3型的引物和探针及其试剂盒与方法<130>2018<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggttccaacggaaatgacgtt<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcccacagctggcacatac<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atggtggagtatttctt当前第1页12