专利名称：2型猪圆环病毒和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种2型猪圆环病毒和其用途。
背景技术：
2型猪圆环病毒(PCM)是一种小型、二十面体的无包膜DNA病毒，其直径在17到 22纳米的范围内并含有单链圆形基因组。PCV2与1型猪圆环病毒(PCVl)具有约80%的 序列一致度。尽管PCVl是不致病的，但感染PCV2的猪会有例如以下症状断奶后多系统 衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、猪呼吸道疾病综合 征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、PCV2 引起的肠炎、PCV2 引起的生殖疾 病、猪皮炎肾炎综合征(porcine dermatitis η印hritissyndrome，PDNS)、萎缩症、呼吸道 症状、腹泻、黄疸和胃溃疡。PCV2是圆环病毒科的一员。PCV2基因组并不编码病毒DNA聚 合酶，此使其依赖于细胞酶来完成其感染周期。当将PCV2接种于猪体内时，在病毒复制方面观察到高度变化。已观察到当同时接 禾中其它如猪生殖_呼吸道综合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus, PRRSV)或猪细小病毒的病毒时，PCV2能够在宿主体内较好地复制(Allan等人 (2000)Arch Virol. 145,2421-2429 ；Allan 等人(2000) J Vet Med B. 47,81-94)。存在于受PCV2感染的细胞培养物中的PCV2滴度一般在3. 4到4. 51ogl0TCID50/ 毫升范围内。美国专利第7，566，562号公开一种活体外培养猪圆环病毒的方法，所述方法 包括给培养基中的连续动物细胞系细胞接种猪圆环病毒；在一或多种核内质溶酶体系统 酸化抑制剂的存在下培养所述培养基中的所述连续动物细胞系；以及从所述培养基和/或 所述受感染的连续动物细胞系分离出所述猪圆环病毒。然而，仍需要开发在宿主细胞内具有高复制能力的PCV2。特别是还需要开发在不 使用如至少一种核内质溶酶体系统酸化抑制剂的病毒复制增强剂的情况下具有高复制能 力的PCV2。
发明内容
本发明提供一种在宿主细胞内具有高复制能力的2型猪圆环病毒(PCV2)。本发明还提供一种使在宿主细胞内具有高复制能力的PCV2减毒的方法。本发明还提供一种免疫原性组合物，其包括在宿主细胞内具有高复制能力的减毒 PCV2。本发明还提供一种使用所述免疫原性组合物来预防或治疗动物的PCV2感染相关疾病的方法。根据本发明的一个方面，提供一种用于治疗或预防动物的圆环病毒感染的组合 物，所述组合物包含至少一种选自由减毒圆环病毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505组成的群
组的减毒病毒。根据本发明的另一个方面，提供一种产生减毒圆环病毒的方法，所述方法包含使 至少一种选自由圆环病毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505组成的群组的病毒与福尔马林反 应，从而制备减毒圆环病毒。根据本发明的另一个方面，提供一种治疗或预防动物的圆环病毒感染的方法，所 述方法包含向所述动物投予有效量的根据权利要求1至11中任一权利要求所述的组合物。根据本发明的另一个方面，提供一种圆环病毒PCV2 GC0504，其包含具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的基因组。根据本发明的另一个方面，提供一种圆环病毒PCV2 GC0505，其包含具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的基因组。
通过参考随附图式详细地描述本发明的例示性实施例，本发明的上述和其它特征 与优势将变得更加明显，在随附图式中图1为说明各种浓度的PCV2的实时聚合酶链式反应(PCR)结果的图。图2为说明在PCV2攻击-接种到幼猪体内后经鼻腔的PCV2洗脱的图。图3为说明在攻击-接种PCV2和猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)到幼猪体 内后经鼻腔的PCV2洗脱的图。图4为说明在PCV2攻击-接种到幼猪体内后经排泄物的PCV2洗脱的图。图5为说明在攻击-接种PCV2和PRRSV到幼猪体内后经排泄物的PCV2洗脱的图。
具体实施例方式在下文中，现将参考附图更充分地描述本发明，在附图中展示本发明的例示性实 施例。本发明的一或多个实施例提供一种用于治疗或预防动物的圆环病毒感染的组合 物，所述组合物包括至少一种选自由减毒圆环病毒PCV2GC0504和PCV2 GC0505组成的群组
的减毒病毒。PCV2 GC0504可以包括具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的基因组。所述基因组可 以具有由SEQ ID NO :1的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸组成的开放阅读框架I(ORFl) 核苷酸序列和与SEQ ID NO 1的核苷酸序列的1037th到1735th核苷酸互补的0RF2核苷酸 序列。ORFl核苷酸序列为正义链的并且可以编码复制酶蛋白。0RF2核苷酸序列为反义链 的并且可以编码衣壳蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分别地具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3的氨基酸序列。因为PCV2 GC0504在宿主细胞中具有高增殖活性，故可以容易地获得PCV2 GC0504病毒粒子。因此，PCV2 GC0504可以有效地用于制备减毒圆环病毒疫苗。举例来 说，PCV2 GC0504可以通过以下步骤来制备将冊_15细胞培养于补充有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco，s modified Eagle medium，DMEM) (900毫升DMEMU00毫升胎牛血清(FBS)、100微克/毫升链霉素 (streptomycin),200国际单位/毫升青霉素(penicillin)和100微克/毫升卡那霉 素(kanamycin))中形成单层；由此移除所述培养基；通过用胰蛋白酶处理来由此分离出 PK-15细胞；添加104 6TCID5。/0. 1毫升的PCV2到PK-15细胞悬浮液中以供接种；在37°CT 静止培养所述细胞3到4天；通过冻融所述细胞三次来完全地破坏所述细胞；以及以每分 钟2，500转的速度离心所述细胞15分钟，从而获得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0504 的平均含量等于或大于IO5 6TCID5tl/毫升，例如在IO5 6到IO6 tlTCID5ci/毫升范围内。由此可 见PCV2 GC0504具有高增殖活性。PCV2 GC0504的高增殖活性也可以在无增殖增强剂(如 葡糖胺)存在时获得。PCV2 GC0505可以包括具有SEQ ID NO 4的核苷酸序列的基因组。所述基因组可 以具有由SEQ ID NO :4的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸组成的ORFl核苷酸序列和与 SEQ ID NO 4的核苷酸序列的1036th到1734th核苷酸互补的0RF2核苷酸序列。ORFl核苷 酸序列为正义链的并且可以编码复制酶蛋白。0RF2核苷酸序列为反义链的并且可以编码衣 壳蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分别地具有SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的氨基酸序 列。因为PCV2 GC0505在宿主细胞中具有高增殖活性，故可以容易地获得PCV2 GC0505 病毒粒子。因此，PCV2 GC0505可以有效地用于制备减毒圆环病毒疫苗。举例来说，PCV2 GC0505可以通过以下步骤来制备将Η -15细胞培养于补充有10%胎牛血清(FBQ的达尔 伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM) (900毫升DMEMU00毫升10%胎牛血清(FBS)、100微克/ 毫升链霉素、200国际单位/毫升青霉素和100微克/毫升卡那霉素)中形成单层；由此移 除所述培养基；通过用胰蛋白酶处理来由此分离出冊-15细胞；添加104 6TCID5Q/0. 1毫升的 PCV2到细胞悬浮液中以供接种；在37°C下静止培养所述细胞3到4天；通过冻融所述细胞 三次来完全地破坏所述细胞；以及以每分钟2，500转的速度离心所述细胞15分钟，从而获 得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0505的平均含量等于或大于IO5 6TCID5tl/毫升，例如 在IO5 6到IO6 ciTCID5q/毫升范围内。由此可见PCV2GC0505具有高增殖活性。PCV2 GC0505 的高增殖活性也可以在无增殖增强剂(如葡糖胺)存在时获得。至少一种选自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505组成的群组的圆环病毒可以通过 使用所属领域的任何已知方法由其基因组序列制备。所述圆环病毒可以通过将其基因组 序列插入到PCV2的宿主细胞中或宿主动物体内并且从所述宿主细胞或宿主动物分离出感 染性PCV2而产生。宿主细胞可以为H(-15细胞。宿主动物可以为猪。举例来说，所述圆 环病毒可以通过以下步骤来产生获得具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的核苷酸序列 的PCV2 GC0504或PCV2 GC0505的基因组DNA ；将所述DNA引入到重组载体中；将所述重组 载体插入到PCV2的宿主细胞中或宿主动物体内；以及从所述宿主细胞或宿主动物分离出 感染性PCV2。举例来说，具有SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的核苷酸序列的PCV2 GC0504 或PCV2 GC0505的基因组DNA可利用DNA合成来获得。可以合成整个基因组DNA或基因 组DNA的片段。当合成基因组DNA的片段时，连接所述片段来制备基因组DNA。可以利用 酶(如DNA连接酶和DNA激酶)来进行连接。所属领域的技术人员可以容易地合成出长 度为约1. 8kb的PCV2 GC0504或PCV2 GC0505的基因组DNA。可以将所合成的基因组DNA或包括所述基因组DNA的载体插入到宿主细胞中或宿主动物体内。可以使用美国专利申 请公开案第2004/0253270A1号(例如第0084到0086号段落，实例2到5，以及图1)中所 公开以及i^enaux，M等人(J. Vir. 2002年1月，第M1-551页)所公开的方法来产生病毒， 这些文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。若使用这些方法来产生PCV2 GC0504 或PCV2GC0505，可以利用聚合酶链式反应(PCR)使用合成基因组DNA作为模板以及使用一 对具有独特限制酶位点(例如SacII位点)的正向引物和反向引物来扩增PCV2 GC0504或 PCV2 GC0505的整个基因组。为了获得包括PCV2基因组的串联二聚体的DNA克隆，将PCR 产物连接到载体(例如，TAge质粒载体(Clontech Jalo Alto，Clif))，以使大肠杆菌Dffia 感受态细胞转化。使载体与已转化的细胞分离，以鉴定整个基因组的存在以及使用限制酶 (例如McII)进行切割，并且使用DNA连接酶连接所切割的PCV2基因组DNA，从而制备串联 二聚体。接着,在 pBluescript SK(+)载体(pSK) (Stratagene 公司，La Jolla, Calif)中 克隆串联二聚体，以制备包括PCV2基因组的串联二聚体的重组质粒(PCV2分子DNA克隆)。 接着，可以将PCV2分子DNA克隆活体外转染到H(-15细胞中。培养已转染的冊_15细胞， 并加以破坏来分离出病毒，从而获得PCV2。PCV2可以被活体内接种(例如鼻内接种)到宿 主动物(例如猪)体内并且从所述宿主动物分离出来。减毒圆环病毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505可能不会感染宿主细胞并且不会引起 病理病变而具有免疫原性。或者，PCV2 GC0504和PCV2GC0505可能会感染宿主细胞，但不会 引起病理病变而具有免疫原性。病理病变可以为细胞、组织和个体中由所属领域内已知的 圆环病毒感染宿主引起而出现的任何症状。举例来说，病理病变可以包括选自由以下组成 的群组的至少一种症状先天性震颤、断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、消瘦、呼吸困难、 呼吸急促、黄疸、腹泻、咳嗽、中枢神经系统不稳定、重量损失、急性血管炎(LangOhr，2010， Vet pathol.，第47卷，第140-147页)、繁殖疾病(流产、死产、胎儿木乃伊化等，Hansen, 2010，VetMicrobiol.，电子出版物先于印刷物)和猪皮炎肾病综合征(PDNS)。可以使用所属领域内已知的任何方法来进行减毒。举例来说，可以通过圆环病 毒在细胞(如H(-15细胞)中反复传代或通过活化圆环病毒相关的核酸内切酶来进行减 毒。另外，可以利用化学方法，例如使病毒暴露于甲醛(福尔马林)、多聚甲醛、丙内酯、 二甲亚胺或其衍生物，或利用紫外线照射来进行减毒。举例来说，使至少一种选自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505组成的群组的病毒与甲醛反应而被减毒。在所述反应中，甲醛的用 量以反应溶液总重量计，可以在0.2重量％到0.5重量％范围内。可以在室温下，在以每分 钟100转的速度搅拌时进行反应，持续10到M小时。所述组合物可以用来治疗或预防动物的由PCV2感染引起的病理病变。举例来说， 病理病变可以包括至少一种选自由以下组成的群组的症状先天性震颤、断奶后多系统衰 竭综合征(PMWS)、消瘦、呼吸困难、呼吸急促、黄疸、腹泻、咳嗽、中枢神经系统不稳定、重量 损失和猪皮炎肾病综合征(PDNS)。PCV2 GC0504和PCV2 GC0505在组合物中的含量可以视动物类型、疾病严重度、动 物年龄和组合物的调配而变化。举例来说，PCV2 GC0504和PCV2 GC0505的量可以等于或 大于104_ 5TCID5tl，例如在单一剂量下在IO4-5TCID50到IO6-5TCID50范围内。在组合物中，要进行预防或要对其感染进行治疗的圆环病毒可以选自由PCVh和 PCV2b组成的群组。例如，所述圆环病毒可以包括PCMa和PCV2b。PCV2可分为两种基因型PCVh*PCV2b，但PCVh*PCV2b不属于亚株。因此，根据本发明一个实施例包括减毒 PCV2 GC0504和PCV2 GC0505的组合物可以防御属于PCV^i* PCV2b (亦即所有PCV2)的病组合物可以进一步包括兽医学上可接受的载剂。载剂可以为所属领域内常用于维 持组合物免疫原性的任何载剂。例如，载剂可以包括至少一种选自由稀释剂、赋形剂、佐剂 和冻干稳定剂组成的群组的载剂。稀释剂可以包括至少一种选自由水(如无菌水)和缓冲 溶液组成的群组的稀释剂。佐剂可以为所属领域内常用于改善PCV2 GC0504和PCV2 GC0505 的免疫原性的任何佐剂。举例来说，佐剂可以包括至少一种选自由氢氧化铝、皂角苷、聚磷 腈和莫他尼德凝胶(montanide gel )组成的群组的佐剂。冻干稳定剂可以为碳水化合 物，如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖；蛋白质，如白蛋白或酪蛋白；这些 化合物的衍生物；或缓冲剂，如碱金属磷酸盐。如所属领域的技术人员众所周知，载剂的量 可以视载剂类型而变化。以组合物总重量计，组合物可以包括5%到15%的载剂。根据本发明实施例，组合物可以包括每一个单位剂量组合物各自为104_ 5TCID5tl或 IO4-5TCID50 以上(例如，IO4 5TCID5tl 到 107_5TCID5。、IO4 5TCID5tl 到 IO6 5TCID5。、或 IO6 ciTCID50 到 IO7 ciTCID5tl)的 PCV2 GC0504 和 PCV2 GC0505 以及 5%到 10%的 montanide gel (以组合 物总重量计)。Montanide gel (SEPPIC，巴黎，法国)是由合成聚合物和亲水胶组成。组合物可以为呈所属领域内已知的任何调配物形式的免疫原性组合物。组合物可 以为口服或非经肠调配物。组合物的调配物可以为冻干调配物、颗粒、粉末、液体、药片、胶 囊、糖浆粉或注射剂。冻干调配物可以在使用前溶于已灭菌的液体载剂(例如无菌水)中。可以使用所属领域内常用于投予免疫原性组合物的任何方法来投予组合物。举例 来说，组合物可以经由诸如静脉内、肌肉内、口服、经皮、粘膜、鼻内、气管内或皮下途径的途 径投予个体。投药可以为全身投药或局部投药。在所述组合物中，动物可以选自由猪、小鼠和豚鼠组成的群组。本发明的一或多个实施例提供一种产生减毒圆环病毒的方法，所述方法包括使至 少一种选自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505组成的群组的病毒与福尔马林反应，从而获得 减毒圆环病毒。可以通过添加病毒到包括福尔马林的反应溶液中以及维持所述反应溶液来进行 反应。以反应溶液总重量计，福尔马林的量可以在0.2重量％到0.5重量％范围内。可以 在室温下进行反应。所述反应可以进行10到M小时。可以在每分钟100转的搅拌下进行 反应。本发明的一或多个实施例提供一种治疗或预防动物的圆环病毒感染的方法，所述 方法包括向所述动物投予有效量的组合物。可以使用所属领域内常用于投予免疫原性组合物的任何方法来投予组合物。组合 物可以口服投予或非经肠投予。举例来说，组合物可以经由诸如静脉内、肌肉内、口服、经 皮、粘膜、鼻内、气管内、直肠或皮下途径的途径投予个体。投药可以为全身投药或局部投 药。可以通过注射或输注进行投药。可以投予组合物一次或一次以上，例如，两次或两次以上。可以投予组合物两次。 举例来说，可以投予组合物一次并且在从第一次投予起2周后再次投予。动物可以选自由 猪、小鼠和豚鼠组成的群组。
“有效量”是指可有效地用于预防或治疗动物的PCV2感染的量。预防治疗除了预 防动物的PCV2感染以外，还包括去除和减少由PCV2感染引起的病变。有效量可以视动物类 型、疾病严重度、动物年龄和组合物的调配而变化。举例来说，有效量的PCV2 GC0504和PCV2 GC0505可以包括在单一剂量下各自为IO4 5TCID5tl或IO4 5TCID5tl以上(例如，104_ 5TCID5tl至Ij IO7.5TCID50UO4.5TCID50 至Ij IO6.5TCID50、或 IO6.0TCID50 至Ij IO7.0TCID50)的 PCV2 GC0504 禾口 PCV2 GC0505。组合物如上文所定义。动物可以为由PCV2感染引起病理病变的任何动物。例如， 动物可以选自由猪、小鼠和豚鼠组成的群组。本发明的一或多个实施例提供一种圆环病毒PCV2 GC0504，其包括具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的基因组。所述基因组可以具有由SEQ ID NO=I的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸组成的 ORFl核苷酸序列和与SEQ ID NO=I的核苷酸序列的1037th到1735th核苷酸互补的0RF2核 苷酸序列。ORFl核苷酸序列为正义链的并且可以编码复制酶蛋白。0RF2核苷酸序列为反义 链的并且可以编码衣壳蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分别地具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3的氨基酸序列。PCV2 GC0504可以包括以SEQ ID NO 1的基因组序列表示的任何病毒粒子。圆环 病毒PCV2 GC0504可以包括至少一种选自由具有SEQ IDNO 2和SEQ ID NO 3的氨基酸序 列的ORFl和0RF2组成的群组的氨基酸序列。圆环病毒PCV2 GC0504为PCV24a病毒。由于在宿主细胞中具有高增殖活性，故PCV2 GC0504可以有效地用于制备减毒圆 环病毒疫苗。举例来说，PCV2 GC0504可以通过以下步骤来制备将冊_15细胞培养于补充 有10%胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM) (900毫升DMEM、100毫升 10%胎牛血清(FBS)、100微克/毫升链霉素、200国际单位/毫升青霉素和100微克/毫 升卡那霉素)中形成单层；由此移除所述培养基；通过用胰蛋白酶处理来由此分离出冊-15 细胞；添加104_6TCID5tlA). 1毫升的PCV2到细胞悬浮液中以供接种；在37°C下静止培养所述 细胞3到4天；通过冻融三次来完全地破坏所述细胞；以及以每分钟2，500转的速度离心所 述细胞15分钟，从而获得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0504的平均含量等于或大于 IO5 6TCID5tl/毫升，例如在IO5.6到IO6 qTCID5q/毫升范围内。由此可见PCV2GC0504具有高增 殖活性。PCV2 GC0504为属于PCV2ja的病毒。减毒圆环病毒PCV2 GC0504可以针对各种PCMa病毒株具有免疫原性。本发明的一或多个实施例提供一种圆环病毒PCV2 GC0505，其包括具有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的基因组。PCV2 GC0505可以包括具有SEQ ID NO 4的核苷酸序列的基因组。所述基因组可 以具有由SEQ ID NO :4的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸组成的ORFl核苷酸序列和与 SEQ ID NO 4的核苷酸序列的1036th到1734th核苷酸互补的0RF2核苷酸序列。ORFl核苷 酸序列为正义链的并且可以编码复制酶蛋白。0RF2核苷酸序列为反义链的并且可以编码 衣壳蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分别地具有SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的氨基 酸序列。PCV2 GC0505可以包括以SEQ ID NO :4的基因组序列表示的任何病毒粒子。PCV2 GC0505可以包括至少一种选自由具有SEQ IDNO 5和SEQ ID NO 6的氨基酸序列的ORFl 和0RF2组成的群组的氨基酸序列。PCV2 GC0505为属于PCV2_2b的病毒。
由于在宿主细胞中具有高增殖活性，故PCV2 GC0505可以有效地用于制备减毒圆 环病毒疫苗。举例来说，PCV2 GC0505可以通过以下步骤来制备将冊_15细胞培养于补充 有10%胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM) (900毫升DMEM、100毫升 8%胎牛血清(FBQ、100微克/毫升链霉素、200国际单位/毫升青霉素和100微克/毫升 卡那霉素)中形成单层；由此移除所述培养基；通过用胰蛋白酶处理来由此分离出PK-15 细胞；添加IO4 6TCID5ciA). 1毫升的PCV2到细胞悬浮液中以供接种；在37°C下静止培养所述 细胞3到4天；通过冻融三次来完全地破坏所述细胞；以及以每分钟2，500转的速度离心所 述细胞15分钟，从而获得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0505的平均含量等于或大于 IO5 6TCID5tl/毫升，例如在IO5.6到IO6 qTCID5q/毫升范围内。由此可见PCV2 GC0505具有高 增殖活性。减毒圆环病毒PCV2 GC0505可以针对各种PCV2b病毒株具有免疫原性。PCV2 GC0504和PCV2 GC0505各自可以在猪细胞系中活体外或活体内复制。所述 细胞系可以为永生化细胞系。所述细胞系可以选自由猪肾上皮细胞系H(-15与SK、单骨髓 细胞系3D4/31和睾丸细胞系ST组成的群组。在此以序列表形式附上本文所述的核苷酸序列，此公开内容以引用的方式并入本 文中。将参考以下实例更详细地描述本发明。这些实例仅用于说明目的，而不作为对本 发明范围的限制。实例11.分离病毒和鉴定增殖活性使用 PCR和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay，IFA)从要 求在2005到2007之间的猪的样本分离出PCV。用PCV分离株感染PK-15细胞，并且加以培 养以测量增殖病毒粒子数目，并且接着选择具有最高增殖活性的PCV分离株。首先，在37°C下将冊-15细胞培养于补充有10%胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏 改良伊格尔培养基(DMEM) (900毫升DMEMU00毫升10%胎牛血清(FBS)、100微克/毫升 链霉素、200国际单位/毫升青霉素和100微克/毫升卡那霉素)中形成单层。接着，从具 有单层的冊-15细胞移除培养基，并且通过用胰蛋白酶处理来由此分离出PK-15细胞。添 加104 5TCID5Q/0. 1毫升的PCV2到含有病毒的细胞悬浮液中以供接种，并且在37°C下静止 培养细胞3到4天。冻融已培养的细胞三次以完全地破坏细胞，并且以每分钟2，500转的 速度离心细胞15分钟。使用PCR和IFA测量在由离心获得的上清液中PCV2的含量。结 果，鉴定出两种PCV2分离株具有高病毒含量。然后，将这两种分离株称为PCV2 GC0504和 PCV2GC0505。PCV2 GC0504 为 PCV2_2a 病毒并且具有 SEQ ID NO :1 的基因组序列。PCV2 GC0505为PCV24b病毒并且具有SEQ ID NO :2的基因组序列。在培养基中复制PCV2 GC0504 和PCV2 GC0505,以便使其平均含量在IO5.6到IO7 0TCID50/毫升的范围内。经鉴定，PCV2 GC0504和PCV2GC0505的增殖活性比现有的PCV2高10倍以上。因此，至少一种选自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505组成的群组的病毒可以有效地提供制备减毒或灭活疫苗所需的病 毒。因此，使用所获得的PCV2(原液病毒(bulkvirus))来减毒以下病毒。在这点上，PCR为实时PCR。在实时PCR中，使用由Takara制造的SYBR绿作为试 剂。将通过稀释IO6 tlTCID5ci/毫升的PCV2 GC0505 10次而获得的样品用作模板，并且使用对 PCV2 的 0RF2 具特异性的引物(5' -TAGGTT AGG GCT GTG GCC TT-3'正向引物，SEQ ID NO 7 ；禾口 5' -CCG CACCTT CGG ATA TAC TG-3'反向引物，SEQ ID NO :8)。将样品维持在 94°C下10秒，在94°C下5秒，以及在60°C下40秒，并且重复此过程40次。预期扩增产物 为26;3bp。结果，以IOTCID5tl/毫升的浓度成功地检测出病毒(图1)。图1为说明各种浓度 的PCV2的实时聚合酶链式反应(PCR)结果的图。用实时PCR测得的Ct值与用IFA测得的病毒滴度之间的关系是以以下式1定义。式 1y = 4. 1291x+4. 458在式1中，y为Ct值，χ为IFA滴度(Iog10)，并且单位为TCID50/0. 1毫升。根据 式1，相关系数(R2)为0.9988，此指示可靠性为约99.9%。因为实时PCR显示出能够检测 10TCID50/1毫升的病毒浓度的高灵敏度并且得以快速进行，因此其可有效地用于测量病毒。使用夹心间接酶联免疫吸附试验(sandwich indirect enzyme-1 inkedimmunosorbent assay, ELISA) UlJfi PCV2 牛寺胃个生^#。首先，在包括2. 93克NaHC03、1. 59克Na2C03、1000毫升水和0. 5M碳酸盐缓冲液的 包被缓冲液(PH 9. 6)中稀释PCV2特异性抗体到5-10微克/孔的浓度，并且向ELISA板的 各孔添加100微升所稀释的溶液并在37°C下吸附于ELISA板持续2小时。用PBS-T洗涤吸 附有抗体的ELISA板三次。向各孔中添加200微升阻断缓冲液(BSA 1_2克、PBS 100毫升 1-2% BSA)并且将板维持在37°C下2小时。将板洗涤三次。接着，用PBS稀释PCV2抗原10 倍到20倍，将所稀释的溶液添加到各孔中，并且将板维持在37°C下1小时。将板洗涤三次。 接着，向抗原已敏化的板的各孔中添加通过用包括8. 0克NaCl、0. 2克无水KH2PO4U. 19克 无水Na2HPO4^O. 2克KCl和1000毫升水的稀释缓冲液(pH 7. 2-7. 4)稀释样品(血清)到 1 50的比率而获得的稀释样品(血清)，并且将板维持在37°C下1小时。用洗涤缓冲液 (Tween 200. 5毫升、PBS 1，000毫升0. 05% PBST)洗涤板五次，并且向板中添加100微升 已用稀释缓冲液稀释的抗GP IgG HRP结合物。将混合物维持在37°C下1小时。洗涤板五 次，并且向板的各孔中添加100微升的OPD底物。将板维持在室温下10分钟，并且向其中 添加50微升中止溶液(2. 5M ，然后在492纳米下测量吸光度。将所分离的PCV2 GC0504和PCV2 GC0505接种到具有单层的冊_15细胞，并且在 37°C下培养细胞72小时，以获得感染病毒的溶液。以每分钟2，500转的速度离心所述溶液 15分钟，并且将上清液或冻干上清液保存在等于或低于-80°C的温度下。2.病毒的减毒和制备包括减毒病毒的免疫原性组合物(2. 1)病毒的减毒在以上获得病毒原液的操作1中，将浓度为IO6 tlTCID5c/毫升或以上的原液病毒用 于减毒。在补充有10% FBS的DMEM(900毫升DMEMUOOml毫升10% FBSUOO微克/毫升 链霉素、200国际单位/毫升青霉素和100微克/毫升卡那霉素)中将福尔马林以0. 3% 的浓度添加到原液病毒中，并且将培养基维持在室温下M小时以减毒PCV2 GC0504和 PCV2GC0505。使用减毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505作为原液物质来制备免疫原性组合物。(2. 2)制备免疫原性组合物将操作(2. 1)中制备的PCV2 GC0504和PCV2 GC0505各自的浓度分别设定为 IO6 ciTCID5tl/毫升，并且以45 45的比率混合PCV2 GC0504和PCV2 GC0505。向其中添加Motanide gel 到10% (w/w)的浓度，并且在室温下以每分钟100转的速度搅拌混合物1 小时以上。将所制备的免疫原性组合物的PH值维持在6. 0-8. 0范围内，并且将福尔马林的 浓度维持为等于或小于0.3重量％。除非另有说明，否则将在以下过程中使用在此制备的 免疫原性组合物。在下文中，免疫原性组合物也被称为“疫苗”。(3)鉴定减毒和稳定性(3. 1)鉴定减毒离心已减毒的样品，并且向透析膜添加适量样品。在4°C下用磷酸盐缓冲溶液 (PBS)以样品的100倍或以上的量透析样品过夜，以移除减毒试剂。将所得物质用于实验。使原代猪肾细胞或冊-15细胞在烧瓶(25平方厘米)中增殖以供组织培养。原 代细胞为已培养4-7天的细胞，并且经鉴定，PK-15细胞在实验之前未经PCVl感染。从增 殖细胞移除培养基，将1毫升样品接种到经组织培养的细胞中并在37°C下敏化1小时。接 着，向其中添加用于维持细胞的新培养基，并且进一步培养细胞7天以鉴定细胞病变效应 (cytopathiceffect, CPE)。当移除上清液时，使用IFA鉴定猪圆环病毒的增殖。结果，在原代猪肾细胞或H(-15细胞中未观察到由猪圆环病毒或任何其它 病毒引起的CPE。另外，在上清液中，未观察到针对小鸡和猪血细胞的血细胞凝集 (hemagglutination, HA)，并且用IFA未检测到病毒。(3. 2)鉴定稳定性使用体重在15-20克范围内的8只小鼠和体重在300-400克范围内的4只豚鼠。 另外，使用3到5周龄、未经PCV2相关疫苗接种并未暴露于PCV2的2只健康幼猪。将0. 5毫升(106_tlTCID5tl/毫升)的组合物经腹膜内接种到8只小鼠体内，将2毫升 (IO6 0TCID50/毫升)的组合物经肌肉内或皮下接种到4只豚鼠体内，并将2毫升组合物经腹 膜内接种到两只幼猪体内，并且在7天内观察这些动物是否活着。在将IO6 tlTCID5ci/毫升的 单一剂量接种到2只幼猪颈部右侧的肌肉中之后，观察此2只幼猪是否在1到2小时内具 有过敏反应或发烧现象以及是否在21天内存活并且无如化脓或坏死的副作用。作为分不 同组接种组合物到小鼠、豚鼠和幼猪体内的结果，它们在实验期间均活着并无任何副作用。(3. 3)抗体滴度向动物投予免疫原性组合物，并且测量血清的抗体滴度。使用夹心间接ELISA或 IFA测量抗体滴度。准备体重在300到350克范围内的10只豚鼠。其中的8只用作接种组，而其余2 只用作对照组。经皮下向接种组接种0.5毫升(106 tlTCID5ci/毫升)的组合物。在3周后， 抽取10只豚鼠的血液样品，并使用IFA或夹心间接ELISA测量其抗体滴度。使用夹心间接ELISA测量的抗体滴度是通过将接种组T的平均吸光度(0. D.)除 以对照组C的平均吸光度(O.D.)来计算。当所述T/C为2.0或以上，用IFA获得的接种组 的平均抗体滴度的T/C为1 倍或以上，并且对照组呈阴性时，可确定免疫原性组合物为适 当的。使用ELISA测量的抗体滴度展示于以下表1中。表 1编号组吸光度吸光度(T/C )1接种0. 889 Q丄对照0. 30/. yO接种0. 823· 4L对照0. 243接种0. 873_ 0对照0. 294接种0. 88O Q对照0. 30L · 7如表1所示，相较于对照组，免疫原性组合物具有适合于接种组(实验组)的免疫 原性。3.鉴定免疫原性组合物的有效性此处，测定在动物体内诱发免疫力所需的免疫原性组合物的最小量(最小免疫力 所需的抗原量)，并且鉴定当将免疫原性组合物接种到动物体内时例如诱导免疫力的能力 和体重增加率的有效性。除了使用IO3-5UO4-5UO5-5^P IO6-5TCID50/毫升的PCV2滴度以外，使用相同免疫原 性组合物来测量最小免疫力所需的抗原量G次重复)。使用免疫原性组合物来测量有效 性。使用幼猪进行测定最小免疫力所需的抗原量的实验。以2周的间隔分两次向对猪 圆环病毒呈阴性的15只3周龄幼猪接种抗原含量为103 5、IO4 5UO5 5和IO6 5TCID5tl/毫升的 PCV2疫苗，并将3只幼猪用作对照组。在接种之前以及在从第二次接种起2周后抽取幼猪 的血液样品，以测量PCV2的抗体滴度。使用幼猪测试免疫原性组合物的有效性。以2周的间隔分两次向对猪圆环病毒呈 阴性的4只3周龄幼猪接种免疫原性组合物，并且将2只幼猪用作对照组。在第二次接种 的2周、4周、2个月、3个月和4个月之后抽取幼猪的血液样品，并且使用ELISA测量PCV 抗体滴度以及使用IFA测量血清中和(serum neutralizing, SN)抗体滴度，此如上文所述 O^ort等人，2007 :Vet Microbiol 125，第M4-255页)。使用ELISA获得的抗体滴度指示 所有抗体均由抗原诱导产生，并且SN抗体滴度指示血清中和抗体滴度为在血清中存在的 抗体之间能够中和病原体(如病毒)的抗体水平。另外，测量免疫原性组合物对幼猪体重增加率的影响。在第一次接种之前、在第二 次接种之前、在从第二次接种起2周后以及在从第二次接种起6周后，测量幼猪的体重，以 鉴定体重增加率。作为测量最小免疫力所需的抗原量以及使用ELISA测量第二次接种后的抗 体滴度的结果，在IO3 5 TCID5tl/毫升下鉴定出抗体滴度的变化。然而，当抗原含量大于 IO4-5TCID50/毫升时，相较于对照组，抗体滴度显著增加(ρ < 0. 05)(表2)。表 2视PCV2含量而定的免疫原性(ELISA)
权利要求
1.一种用于治疗或预防动物的圆环病毒感染的组合物，所述组合物包含至少一种选自 由减毒圆环病毒PCV2GC0504和PCV2GC0505组成的群组的减毒病毒。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中PCV2GC0504包含具有SEQIDNO 1的核苷酸序 列的基因组。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中PCV2GC0505包含具有SEQIDNO 4的核苷酸序 列的基因组。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中PCV2GC0504和PCV2GC0505是通过与甲醛反应而被减毒。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中PCV2GC0504和PCV2GC0505的量在单一剂量下 分别在 IO4-5TCID50 到 IO6-5TCID50 范围内。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中用于预防和治疗圆环病毒感染的所述圆环病毒 是选自由PCVh和PCV2b组成的群组。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中用于预防和治疗圆环病毒感染的所述圆环病毒 包含 PCMa 和 PCV2b。
8.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含兽医学上可接受的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述赋形剂是莫他尼德凝胶。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述赋形剂的量以所述组合物总重量计，在 5%到15%范围内。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述动物是选自由猪、小鼠和豚鼠组成的群组。
12.—种产生减毒圆环病毒的方法，所述方法包含使至少一种选自由圆环病毒 PCV2GC0504和PCV2GC0505组成的群组的病毒与福尔马林反应，从而制备减毒圆环病毒。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述福尔马林的量以反应溶液总重量计，在0.2 重量％到0.5重量％范围内。
14.一种治疗或预防动物的圆环病毒感染的方法，所述方法包含向所述动物投予有效 量的根据权利要求1至11中任一权利要求所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述动物是选自由猪、小鼠和豚鼠组成的群组。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物是以口服或非经肠方式投予。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物是以注射方式投予。
18.一种圆环病毒PCV2 GC0504，其包含具有SEQ ID NO=I的核苷酸序列的基因组。
19.一种圆环病毒PCV2 GC0505，其包含具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的基因组。
全文摘要
本发明提供一种在宿主细胞内具有高复制能力的2型猪圆环病毒(PCV2)和其用途。
文档编号C12N7/06GK102145165SQ20101019849
公开日2011年8月10日 申请日期2010年6月7日 优先权日2010年2月4日
发明者姜普圭, 宋錞燮, 朴奉均, 金慧权 申请人:绿十字兽医药品株式会社