一种同时检测呼吸道多种病原的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测技术，尤其是涉及一种能同时检测呼吸道多种病原的试剂盒。

背景技术

呼吸道感染是世界范围内最常见的传染病之一，是影响人类健康的重要问题。呼吸道感染包括上呼吸道感染和下呼吸道感染，能够引起呼吸道感染的病原体很多，包括细菌、病毒、支原体、衣原体等，这些病原体引起的症状接近，依靠临床症状进行区分较为困难。

在多种多样的呼吸道病原体中，嗜肺军团菌、人偏肺病毒、博卡病毒是三种重要的病原体。嗜肺军团菌能够引起肺炎症状，偏肺病毒多数和其他病毒合并感染，会导致症状加重；博卡病毒主要感染儿童，能够引起儿童急性呼吸道感染，如能及时检测出这三种病原体，即能辅助医生进行诊断，使医生的治疗更加有针对性和目的性。

目前主要的诊断方法有病毒分离培养、血清学诊断、免疫学诊断等传统诊断方法以及分子生物学诊断。临床使用时，这些传统的诊断方法具有一定的局限性：病毒分离培养耗时长、操作复杂要求高、检测效率低下；血清学诊断具有费时费力且敏感度低的缺点。相比于传统的诊断方法，分子生物学诊断方法尤其是实时荧光定量pcr技术具有敏感度高、特异性好、检测时间短的优点，更能满足临床诊断的需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于结合实时荧光定量pcr技术及多重pcr技术，提供一种能同时检测呼吸道嗜肺军团菌、博卡病毒、人偏肺病毒三种病原的试剂盒，极大的简化了实验过程，提升了检测效率，并节约了检测成本。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的同时检测呼吸道多种病原的试剂盒，包括pcr反应液，所述反应液中包括针对嗜肺军团菌、博卡病毒、人偏肺病毒基因组保守区的引物，所述引物的序列如下：

嗜肺军团菌上游引物（seqidno.1）：agccaggcgttgttgtattg，

嗜肺军团菌下游引物（seqidno.2）：gcaaagcttctgtccatcca，

嗜肺军团菌探针（seqidno.3）：tggtaagccagcaacgttccaggt；

人偏肺病毒上游引物（seqidno.4）：cagtacacaataaagagagatgtaggaacaac，

人偏肺病毒下游引物（seqidno.5）：agaatttctccacacaacagtgttatttc，

人偏肺病毒探针（seqidno.6）：acagcagtgacaccctcatcattgcaaca；

博卡病毒上游引物（seqidno.7）：gagaggctcgggctcatatca，

博卡病毒下游引物（seqidno.8）：tgaggtcttcgaagcagtgcaa，

博卡病毒探针（seqidno.9）：caggaacacccaatcagccacctatcg。

所述pcr反应液包括pcr反应液a和pcr反应液b，

其中pcr反应液a的组分为：0.4mkoac、0.1mtricine、0.12mmdntps、40%甘油、5%dmso、6mmmg（oac）2，三种病原体的上下游引物各0.16µm、探针各0.08µm。

pcr反应液b的组分为：反转录酶和taq酶。

所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为depc水，所述阳性质控品为由人偏肺病毒、博卡病毒靶标序列的假病毒及嗜肺军团菌靶标序列的质粒按照1:1:1比例混合的混合物。

本发明的优点在于利用多重实时荧光定量pcr检测技术，实现了同时检测嗜肺军团菌、博卡病毒、人偏肺病毒三种呼吸道病原的目的，简化了实验过程，能够极大的提升检测效率，大大节约检测成本，同时能够辅助医生进行诊断，使医生的治疗更加有针对性和目的性。

附图说明

图1为三种病原同时阳性扩增的曲线。

图2为人偏肺病毒阳性的扩增曲线。

图3为嗜肺军团菌阳性的扩增曲线。

图4为博卡病毒阳性扩增曲线。

图5为阴性对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。如无特殊说明，本发明实施例中所用的检测仪器和检测试剂均为常规市售产品

实施例1制备能同时检测呼吸道嗜肺军团菌、博卡病毒、人偏肺病毒三种病原的试剂盒

1、配制pcr反应液a：准确称量38.25µl1mkoac，11.25µl1mtticine，36µl甘油，4.5µldmso，1.08µlmmmg（oac）2，30µl10mmdntps，三种病原体的上下游引物各8µm、探针各4µm。加水778.92µl，混匀备用。

2、配制pcr反应液b：10µl反转录酶中加入90µltaq酶，震荡混匀混匀。

、阴性质控品：depc水。

4、阳性质控品：嗜肺军团菌、人偏肺病毒、博卡病毒培养物1:1:1混合；稀释1000倍，分装1ml。

实施例2标本处理

取临床阳性的样本各一例按照核酸提取说明书进行提取。

样本核酸提取采用qiagenallprepdna/rnaminikit（货号：80204），操作参照说明书进行。

质控品处理同样本处理。

实施例3检测

pcr检测的反应体系为25µl，包括pcr反应液b2µl，pcr反应液a18µl,待检模版5µl，待检模板为从标本中提取的总核酸。

实时荧光pcr设备：安捷伦mx3005p。

pcr检测的反应程序为：45℃30min；95℃10min；94℃变性15sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，40个循环。

三种病原同时阳性扩增的曲线如图1所示，三种病原分别扩增与阳性对照的曲线如图2~4所示，阴性对照结果如图5所示。图中可以看出，阴、阳性对照品在控，可同时检测三个病原体且不存在非特异性反应。三例临床样本检测结果为阳性，证明本试剂盒能够正常检测这三种病原体。

结果分析阈值线：300。

基线：3-15。

结果显示：本发明试剂盒可以在3小时内同时检测出嗜肺军团菌、人偏肺病毒、博卡病毒三种病原，极大地节约了检测成本和检测试剂，并且具有操作简单实用性强的特点，能够产生良好的经济效益和社会效益。

序列表

<110>郑州安图生物工程股份有限公司

<120>同时检测呼吸道多种病原的试剂盒

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