一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属分子生物学和免疫学领域，具体涉及一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒及其应用。

背景技术

莱姆病（lymediease，ld）20世纪70年代发现的一种由伯氏疏螺旋体所引起的，以硬蜱为主要传播媒介的自然疫源性疾病。莱姆病可引起多系统、多器官损害，临床表现为游走性红斑、神经炎、心肌炎等，严重者可致残，甚至死亡。目前，世界上已有70多个国家报告发现莱姆病，且发病率呈上升趋势。1992年世界卫生组织将此病列为重点防治对象，该病已成为全球性的公共卫生问题。近年来国内每年有万余病例报道，其危害性日益受到人们的关注。调查发现，在我国至少28个省（市、自治区）的山林地区人群中有莱姆病的感染存在，17个省（市、自治区）的山林地区为莱姆病的自然疫源地。莱姆病临床表现多样，除有皮肤慢性游走性红斑、脑膜炎、颅神经炎、神经根炎、关节炎、慢性萎缩性肢皮炎等临床类型外，病原学、治疗学证实莱姆病螺旋体可引起人类精神异常，对人群危害严重，有“第二艾滋病”之称。莱姆病在我国分布相当广泛，该病已成为我国一种相当重要的虫媒传染病，应该给予高度重视。加强我国莱姆病防治研究，对保护我国人民健康具有极为重要的意义。

目前，伯氏疏螺旋体的实验室诊断主要为病原学检测、血清学检测和分子生物学检测等。病原学检测结果虽然可靠，但是操作起来麻烦，需要操作者较高的技术和多年的临床经验为依托；血清学检测主要为免疫荧光法、酶联免疫法等此类方法虽然快速，但缺乏特异性，易造成假阳性；分子生物学检测主要应用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，pcr）技术，该方法具有敏感、特异、自动化等优点，但也存在着检测单一易出现假阳性等问题。因此，准确并快速的检测方法就成为难点和重点。大量研究表明胶体金（colloidalgold）检测技术具有快速准确的特点。胶体金技术是氯金酸（haucl4）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态。很多学者证实胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变，应用于免疫组织化学中进行免疫组织化学定位，并日益成为科学研究和临床诊断的有力工具。

技术实现要素：

本发明目的是提供快速、准确检测伯氏疏螺旋体的一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒。

一种检测伯氏疏螺旋体的pcr引物，其核苷酸序列为：

f：5´-taatgaaaaagaatacattaagtg-3´

r：5´-ttaaggtttttttggactttctgc-3´。

一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，它包括：所述的一种检测伯氏疏螺旋体的pcr引物。

一种检测伯氏疏螺旋体的检测体系，它包括：所述的一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，其pcr反应体系为：

10×buffer（mg²⁺plus）2.5µl

dntp(各2.5mm)2µl

dna5µl

引物（20pmol/µl）1µl

takaraextaq(5u/µl)0.25µl

ddh2o补足25µl；

pcr反应条件：95℃预变性3min，95℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min；

所述的一种检测伯氏疏螺旋体的检测体系，还包括pcr-免疫胶体金试纸条、展开液；

所述的展开液，其成分为：浓度为10mmol/l的tris、体积分数为1%的bsa、体积分数为1%的1%tween20和浓度为0.05～0.50mol/l的naoh；

所述的pcr-免疫胶体金试纸条，它是将标准的通用兔源fitc抗体与胶体金颗粒交联，在颗粒表面形成包被的抗体，将抗地高辛抗体以线条状固定于膜上，分别形成检测线，质控线，制成试纸条。

本发明提供了一种检测伯氏疏螺旋体的pcr引物；一种伯氏疏螺旋体检测试剂盒，它包括：所述的一种检测伯氏疏螺旋体的pcr引物；同时提供了一种检测伯氏疏螺旋体的检测体系；在pcr-免疫胶体金试纸条检测方法中菌液稀释倍数为1/10⁸，检测带变色明显，可明确判断其阳性结果，可见使用pcr-免疫胶体金试纸条方法的菌液检测灵敏度更高；本发明将核酸检测中的聚合酶链式反应的高灵敏度、高特异性方法与免疫学检测中的免疫胶体金快速检测技术相结合，通过设计独特的引物，对提取的靶dna进行特异性扩增以及扩增产物在展开液中与试纸条条上固定的金标记抗体结合而形成稳定、可见的检测带及质控带，实现对伯氏疏螺旋体的快速检测。

附图说明

图1螺旋体琼脂凝胶电泳结果；其中，m：dl2000，1：伯氏疏螺旋体，2：阿氏疏螺旋体，3：伽氏疏螺旋体，4：空白对照；

图2莱姆病螺旋体pcr-胶体金应用验证检测结果；1、莱姆病螺旋体；2、钩端螺旋体；3、空白对照。

具体实施方式

实施例1引物的设计与合成

特异性检测引物的设计，确定靶基因后，从genebank下载所有靶基因的序列，用生物软件进行序列比对，截取最一致的序列设计引物，将设计好的引物在genebank上进行blast比对，验证引物的保守性。引物由生工生物工程（上海）有限公司。

设计了多对引物，经试验摸索后，最终确定的检测引物如下：

莱姆病螺旋体ospcf：5´-taatgaaaaagaatacattaagtg-3´

r：5´-ttaaggtttttttggactttctgc-3´。

实施例2菌株模板库的建立

按传统的培养方法增菌培养菌株；取菌株的细菌培养液1ml，采用细菌基因组dna提取试剂（promega）提取细菌dna，保存于-20℃备用以待检测；所建立的参考菌株dna模版库，用于特异性、灵敏度和精密度等试验。

实施例3pcr通用扩增

以完全相同的模板，对各个引物对进行相同条件反应，选出反应效果最佳的引物；然后进行taq酶、引物用量和循环条件优化，直至得出如下的最佳pcr通用反应体系和反应条件，反应体系如下：

10×buffer（mg²⁺plus）2.5µl

dntp(各2.5mm)2µl

dna5µl

引物（20pmol/µl）1µl

takaraextaq(5u/µl)0.25µl

ddh2o补足25µl

pcr反应条件：95℃预变性3min，95℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min；反应结束4℃反应产物，取5µlpcr产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

依据影响pcr反应条件的因素分别在预变性时间、tm、循环次数、所需酶浓度，引物浓度进行优化最终得上述条件，将pcr扩增3种菌株产物各取5µl，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。

实施例4检测试纸条的制备及检测实验

将标准的通用抗体fitc抗体（兔源）与胶体金颗粒交联，在颗粒表面形成包被的抗体，将抗地高辛抗体以线条状固定于膜上，分别形成检测线，质控线，制成试纸条；

用于核酸序列检测的展开液，其成分为：10mmol/ltris、1%bsa、1%(v/v)tween20以及浓度为0.05～0.50mol/l的naoh，该展开液可以减少引物二聚体对实验结果的干扰。

使用建立的pcr-免疫胶体金检测试纸条方法对伯氏疏螺旋体及空白对照(ddh2o)进行检测的结果如图2所示；伯氏疏螺旋体的检测试纸条质控带与检测带均为红色，为阳性结果；钩端螺旋体和空白对照只有质控带显示红色，为阴性结果。

实施例5特异性实验

用pcr-标准电泳的方法和pcr-免疫胶体金试纸条方法同时对伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、莫氏立克次体进行检测的结果一致。伯氏疏螺旋体的检测带为红色，结果为阳性，其他菌均只有质控带为红色，结果为阴性；说明该方法特异性良好，可以从蜱中特异性检出莱姆病螺旋体。

实施例6灵敏度和精密度实验

利用建立起来的pcr反应体系对试验菌株进行扩增，使用ddh2o作为空白对照；同时将伯氏疏螺旋体过夜培养菌液做菌落计数，并将菌液以1、1/10、1/10²、1/10³、1/10⁴、1/10⁵、1/10⁶、1/10⁷、1/10⁸、1/10⁹的比例稀释后，制作dna模板按已建立的pcr体系进行扩增。

取5µlpcr产物用于琼脂糖凝胶电泳；凝胶电泳条件为：1×tbe缓冲液，电压100v，电泳时间30min；同时分别取3µl用于核酸试纸条检测，取3µl样品点于样品垫。加入到97µl展开液中进行检测5min后观察结果。

过夜培养的莱姆病螺旋体菌液10倍系数稀释，并制作dna模板，同时用pcr-标准琼脂糖凝胶电泳和pcr-免疫胶体金试纸条方法进行检测，结果一致；琼脂糖凝胶电泳结果在菌液1/10⁶倍稀释后条带明显模糊，电泳结果已无法判断；而在pcr-免疫胶体金试纸条检测方法中菌液稀释倍数为1/10⁸,检测带变色明显，可明确判断其阳性结果，可见使用pcr-免疫胶体金试纸条方法的菌液检测灵敏度更高。

将本发明的试纸条检测方法用于实际检验工作中，与现有其他检测方法进行比较，验证检测方法的实用性和可靠性；同时，也将以往从实际检测样品中分离鉴定并保留的微生物阳性分离株，采用本发明建立的方法进行验证，以比对方法的准确性。