一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药领域,涉及一种长链非编码rna(lncrna)模型及检测试剂盒，及其在预测胰腺癌病人不良预后风险方面的应用。
背景技术：
：根据最新流行病学调查，全球每年约250万人死于胰腺癌，死亡率位居恶性肿瘤第四位。近20年来我国胰腺癌的发病率持续增高，其死亡率位居恶性肿瘤第五位。在胰腺癌的治疗中，外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人意，其术后1年生存率不到20％，5年生存率仅为4％-7％。胰腺癌已经成为早期诊断最难、恶性程度最高、生存预后最差的肿瘤之一，是目前全世界肿瘤学研究的热点。胰腺癌发现时大部分已处于晚期，病死率高，其主要原因胰腺癌早期即有局部淋巴结或远处转移，85％的患者确诊时已失去手术根治的机会。目前其治疗策略制定和预后判断主要依赖tnm分期，然而其并不能精准反映患者所处的实际阶段和预后。临床上尚无高灵敏性、高特异性的分子诊断方法精准判断胰腺癌的预后。目前，公认lncrna是一类序列长度大于200nt的非编码rna；已有研究证实lncrna在基因调控及各种细胞功能中起着重要的作用；而lncrna在胰腺癌中的作用也被广泛关注。有研究表明，lncrna通过对目标基因表达的调控，影响胰腺癌的恶性进程。近年来，越来越多的研究证实了lncrna作为生物标记物预测肿瘤患者预后的可行性。基于现有技术的现状和基础，本申请的发明人拟提供一种预测胰腺癌患者预后的lncrna模型及检测试剂盒，用于检测胰腺癌患者不良预后的分子标记物。技术实现要素：本发明的目的是基于现有技术的现状和基础，提供一种预测胰腺癌患者预后的lncrna模型及检测试剂盒，用于检测一种能在胰腺癌组织中检测的、有较高预测准确度的、胰腺癌患者不良预后的分子标记物。本发明的另一个目的是提供上述模型的应用，对术后胰腺癌患者不良预后风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，改善患者预后。本发明提供了一种检测胰腺癌预后相关lncrna的模型包括样品采集rna提取lncrna测定和lncrna表达量加权计算四部分；所述的lncrna是筛选获得的、胰腺癌相关的17个lncrna。所述的筛选是对胰腺癌癌组织进行rna测序，并与和患者的临床随访信息相关联，利用单因素cox比例风险回归模型，计算每个lncrna与患者生存的关系，进而获得胰腺癌相关的17个lncrna。所述的17个胰腺癌相关lncrna如下表所示：lncrna名ensg00000272750.1ensg00000235078.1ensg00000270562.1ensg00000250413.1ensg00000249700.7ensg00000260070.1ensg00000232445.1ensg00000244198.4ensg00000271966.1ensg00000176236.6ensg00000279029.1ensg00000257534.1ensg00000257303.1ensg00000269906.1ensg00000276250.1ensg00000267015.1ensg00000271784.1表1相关序列参见http://www.gencodegenes.org网站。本发明提供了一种胰腺癌标志物，所述的胰腺癌标志物包括表1所述的lncrna。本发明还提供一种预测胰腺癌患者预后的lncrna模型，所述的模型包括表2所述的lncrna的表达权重。lncrna名权重系数(b)ensg00000272750.1-0.007894547ensg00000235078.1-0.198597798ensg00000270562.1-0.018438516ensg00000250413.1-0.021035564ensg00000249700.7-0.041273129ensg00000260070.1-0.015183685ensg00000232445.10.016172084ensg00000244198.4-0.084552592ensg00000271966.1-0.022991908ensg00000176236.6-0.121026448ensg00000279029.10.02416932ensg00000257534.1-0.014257028ensg00000257303.1-0.05251776ensg00000269906.10.007557004ensg00000276250.1-0.283657215ensg00000267015.10.117787771ensg00000271784.1-0.268003602表2本发明还提供了一种检测试剂盒，其中包括表3所述lncrna的特异性引物。所述的试剂盒中还包括抽提和/或鉴定rna的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成，说明书，等等。所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成。所述的扩增系统由含taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。表3本发明的模型的构建方法依次包括提取样本的rna、rna测序并筛选胰腺癌相关的lncrna等几个方面。该构建方法包括以下步骤：(1)提取并纯化胰腺癌组织的rna样本；(2)对胰腺癌癌组织进行rna测序，组成训练集，利用单因素cox比例风险回归模型，计算每个lncrna与患者生存的关系，筛选其中与患者生存相关的17个lncrna；(3)计算上述17个lncrna的表达权重，通过cox比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数，根据其中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。本发明所述模型的构建方法还可以包括rna质量控制：用光谱仪定量检测提取的总rna的浓度及质量。在本发明的一个实施例中，采用nanodrop2000作为光谱仪。可以对本发明所述的lncrna模型进行验证：获取独立的另一组胰腺癌患者癌组织，经过组织rna抽提并质检后，进行rna测序；依据表达水平对每个lncrna进行赋值后带入上述建立的rs公式内，计算每位患者的rs值；判断每位患者的患者生存时间；通过cox多因素比例风险回归模型对lncrna模型的预测效能进行评价。本发明提供了相应的试剂盒及引物，通过实时定量pcr检测试剂盒技术对胰腺癌病人术后的组织lncrna水平的检测，具有高通量、高敏感性和高均一性等特征。该方法简便、快速且经济实用。更具体的，本发明所述的lncrna模型构建与验证方法的步骤为:(1)收集胰腺癌患者的手术切除癌组织标本；(2)提取和纯化胰腺癌组织的rna样本；(3)rna质量控制：用nanodrop2000光谱仪定量(nanodroptechnologies,waltham,ma)检测提取的总rna的浓度及质量；(4)对胰腺癌癌组织进行rna测序，组成训练集，和患者的临床随访信息相关联，利用单因素cox比例风险回归模型，计算每个lncrna与患者生存的关系，进而筛选出与疾病生存相关的lncrna，所述的17个胰腺癌相关lncrna如下表所示：lncrna名ensg00000272750.1ensg00000235078.1ensg00000270562.1ensg00000250413.1ensg00000249700.7ensg00000260070.1ensg00000232445.1ensg00000244198.4ensg00000271966.1ensg00000176236.6ensg00000279029.1ensg00000257534.1ensg00000257303.1ensg00000269906.1ensg00000276250.1ensg00000267015.1ensg00000271784.1表1(5)计算上述17个lncrna的表达权重(如表2所示)，通过cox比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数(riskscore(rs))：其指数的计算公式如下：rs＝b1*x1+…+b17*x17，其中，x为每个lncrna在两分类方法中的赋值，b为每个lncrna的权重系数(如表2所示)；根据计算得出的rs值及其中位数，将患者划分为高危和低危，进而判断患者不良预后风险大小，同时通过cox多因素比例风险回归模型对所构建lncrna模型的预测效能进行评价；(6)将上述所得的lncrna模型及计算公式，在另外的胰腺癌患者组成独立的验证集中进行验证：经过组织rna抽提并质检后，利用rna测序检测如表1所示lncrna的表达量，依据表达水平对每个lncrna进行赋值后带入上述建立的rs公式内，计算每位患者的rs值及其中位数；依此判断每位患者的不良预后，通过cox多因素比例风险回归模型对lncrna模型的预测效能进行评价。本发明的模型，可以通过cox比例风险回归模型，计算每个患者生存的风险指数，根据计算得出的值和中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。所述的风险指数的计算公式是rs＝b1*x1+…+b17*x17；其中，x为每个lncrna在两分类方法中的赋值，b为每个lncrna的权重系数。lncrna名权重系数(b)ensg00000272750.1-0.007894547ensg00000235078.1-0.198597798ensg00000270562.1-0.018438516ensg00000250413.1-0.021035564ensg00000249700.7-0.041273129ensg00000260070.1-0.015183685ensg00000232445.10.016172084ensg00000244198.4-0.084552592ensg00000271966.1-0.022991908ensg00000176236.6-0.121026448ensg00000279029.10.02416932ensg00000257534.1-0.014257028ensg00000257303.1-0.05251776ensg00000269906.10.007557004ensg00000276250.1-0.283657215ensg00000267015.10.117787771ensg00000271784.1-0.268003602表2本发明还包括所述模型在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用，其中包括检测表1所列lncrna的特异性引物(表3)。所述的试剂盒中还包括抽提和/或鉴定rna的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成，说明书，等等。所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成。所述的扩增系统由含taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。表3本发明经过严格细致的研究，构建了一种预测胰腺癌患者预后lncrna模型；在预测96个月的病人生存中，所述lncrna均呈现出较好预测效能。本发明所述模型能够为患者肿瘤治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。临床治疗中，在胰腺癌患者诊断明确后，即可通过对上述lncrna的检测，快速判断患者不良预后风险，并根据结果选择合适的治疗方案，实现个体化治疗。附图说明图1是本发明实施例中训练组和验证组中lncrna模型对于预测胰腺癌患者不良预后的预测分析结果图，结果显示高风险组生存比低风险组显著差。具体实施方式以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下面结合实施案例来具体说明本发明。实施例1lncrna模型的构建和分析一、研究对象：本实施案例的研究对象分别为:胰腺癌组织106例，构成训练集；胰腺癌组织71例，构成验证集,纳入及排除标准为：(1)病理确诊为胰腺癌，导管腺癌；(2)确诊时无其他肿瘤病史；(3)排除其他导管原位癌。二、实验方法(1)收集胰腺癌患者的手术切除癌组织标本(2)胰腺癌组织总rna的抽提和纯化将患者切除的胰腺癌旁组织与trizol试剂按比例75毫克：1ml混合，用匀浆器匀浆；将匀浆液在室温下孵育5分钟，按1：0.2的体积比加入氯仿，盖严，用手摇晃15秒钟，室温下孵育2.5分钟；于12000×g、4℃条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，取上层水相，按照每1mltrizol试剂加入0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，20℃下静置10分钟，于12000×g、4℃条件下离心10分钟，rna沉淀形成胶状物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照每1mltrizol试剂加入1ml的比例加入75％乙醇，振荡混匀；于7500×g、4℃条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥rna沉淀10分钟；用depcdepc(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过的水重新溶解rna；用nanodrop分光光度计检测rna浓度及a260/a280的比值，当a260/a280的比值为1.9-2.1时，进入下一步。(3)rna质量检测将10×mops(3-(n-吗啡啉)丙磺酸rna变性缓冲液)l0ml、0.1％depc(焦碳酸二乙酯)处理过的水70ml、37％甲醛20ml与rna琼脂糖1.0g混合制备甲醛变性琼脂糖凝胶；用depc处理过的水将10×mops缓冲液稀释成1×mops缓冲液配制电泳缓冲液；将步骤2.1中得到的rna样品5.5μl、10×mops缓冲液1.0μl、37％甲醛3.5μl以及去离子甲酰胺10.0μl混合，配成电泳样品，65℃孵育5分钟，冰上冷却；将电泳槽内注入电泳缓冲液，置入甲醛变性琼脂糖凝胶；电泳样品内加入2μl10×rna加样缓冲液以及0.1μleb(溴化乙锭)，混合均匀后加入上样孔内，电压100v条件下电泳30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照；当检验证实rna没有降解时，进一步进行研究。(4)将106例胰腺癌组织组成训练集，按照操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的rna样本进行全转录组测序。以测序内部参考基因表达为参照对结果进行标化处理。lncrna表达水平和患者的临床随访信息相关联，利用单因素cox比例风险回归分析，计算每个lncrna与患者生存的关系，进而筛选出与胰腺癌预后相关的lncrna(表1)。(5)计算上述17个lncrna的表达权重，训练集106例胰腺癌组织筛选出的lncrna表达权重如表2所示。通过cox比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数(riskscore(rs)：其指数的计算公式如下：rs＝b1*x1+…+b17*x17，其中，x为每个lncrna在两分类方法中的赋值，b为每个lncrna的权重系数；根据计算得出的rs值和中位数，将患者划分为高危和低危，进而判断患者不良预后风险大小。运用该预测模型对训练组106例胰腺癌患者进行不良预后预测分析(图1)，结果显示，模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的不良预后风险(训练组：hr＝8.32，95％ci:4.31-16.07，p＝2.3e-13)。实施例2lncrna模型的验证将上述所得的lncrna模型及计算公式，在另外71例胰腺癌患者中进行验证：71例胰腺癌患者组成独立的验证集，获取其癌组织，按照上述方法抽提rna并通过质量检测，进一步进行rna测序。依据表达水平对每个lncrna进行赋值后带入上述建立的rs公式内，计算每位患者的rs值及中位数；依此判断每位患者的不良预后风险；通过cox多因素比例风险回归模型对lncrna模型的预测效能进一步进行评价。运用该预测模型对验证组71例胰腺癌患者进行不良预后预测分析(图1)，结果显示，模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的不良预后风险(验证组：hr＝2.32，95％ci:1.13-4.74，p＝0.018)，可对患者不良预后进行准确预测。sequencelisting<110>复旦大学附属华山医院<120>一种预测胰腺癌术后生存的lncrna模型及检测试剂盒<130><160>34<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>ensg00000272750.1forwardprimer<400>1gctttcttctcatgggtagcg21<210>2<211>22<212>dna<213>ensg00000272750.1reverseprimer<400>2gccaagtgtaattcttaggcgg22<210>3<211>20<212>dna<213>ensg00000235078.1forwardprimer<400>3tcggccgcgctttatcttat20<210>4<211>20<212>dna<213>ensg00000235078.1reverseprimer<400>4tttgcttccgaaaacagcgg20<210>5<211>20<212>dna<213>ensg00000270562.1forwardprimer<400>5aaagtacttccccttgcggg20<210>6<211>20<212>dna<213>ensg00000270562.1reverseprimer<400>6aaggggcattacgcgaaaga20<210>7<211>20<212>dna<213>ensg00000250413.1forwardprimer<400>7agggccccacaagaacaaaa20<210>8<211>20<212>dna<213>ensg00000250413.1reverseprimer<400>8aagagaagtctcaggcgtgc20<210>9<211>17<212>dna<213>ensg00000249700.7forwardprimer<400>9gcctctgcttccaccac17<210>10<211>17<212>dna<213>ensg00000249700.7reverseprimer<400>10cagccagtcctccatcc17<210>11<211>20<212>dna<213>ensg00000260070.1forwardprimer<400>11aagtgctcccacaacttgct20<210>12<211>21<212>dna<213>ensg00000260070.1reverseprimer<400>12gtcttgtcagtcacctgtggt21<210>13<211>20<212>dna<213>ensg00000232445.1forwardprimer<400>13ggagccggtaggttttcaca20<210>14<211>19<212>dna<213>ensg00000232445.1reverseprimer<400>14ccccgccgatccaatttct19<210>15<211>21<212>dna<213>ensg00000244198.4forwardprimer<400>15tctatacaaactaatggaagg21<210>16<211>17<212>dna<213>ensg00000244198.4reverseprimer<400>16ctgacagaagggcaagt17<210>17<211>20<212>dna<213>ensg00000271966.1forwardprimer<400>17ctttctgatgggggtgcagt20<210>18<211>20<212>dna<213>ensg00000271966.1reverseprimer<400>18gacagcagttccgtgcacta20<210>19<211>19<212>dna<213>ensg00000176236.6forwardprimer<400>19gactcgagtttaggccccg19<210>20<211>20<212>dna<213>ensg00000176236.6reverseprimer<400>20gggctcaagattccctgcat20<210>21<211>20<212>dna<213>ensg00000279029.1forwardprimer<400>21cgccagacagaaggacaagt20<210>22<211>20<212>dna<213>ensg00000279029.1reverseprimer<400>22ggtgcagagtaagcctcctg20<210>23<211>20<212>dna<213>ensg00000257534.1forwardprimer<400>23atggggttgccactcaactt20<210>24<211>20<212>dna<213>ensg00000257534.1reverseprimer<400>24gaaaaccacccaaagctcgg20<210>25<211>20<212>dna<213>ensg00000257303.1forwardprimer<400>25tcaccttggttcccaagagc20<210>26<211>20<212>dna<213>ensg00000257303.1reverseprimer<400>26cctgatcagcacccttctcc20<210>27<211>20<212>dna<213>ensg00000269906.1forwardprimer<400>27atgatggccacaggaaggtg20<210>28<211>20<212>dna<213>ensg00000269906.1reverseprimer<400>28gccacaccagtggtacttga20<210>29<211>20<212>dna<213>ensg00000276250.1forwardprimer<400>29atacaacaggctccctggtc20<210>30<211>20<212>dna<213>ensg00000276250.1reverseprimer<400>30gatgagcgattggtgaccct20<210>31<211>20<212>dna<213>ensg00000267015.1forwardprimer<400>31cacatcatcgccacacatcg20<210>32<211>20<212>dna<213>ensg00000267015.1reverseprimer<400>32tgaatcccactcaggttgcc20<210>33<211>20<212>dna<213>ensg00000271784.1forwardprimer<400>33ccacctctcagttggtcgtc20<210>34<211>20<212>dna<213>ensg00000271784.1reverseprimer<400>34tgacccttccgactctgact20当前第1页12