本发明属于生物与新医药中轻工和化工生物技术的天然产物有效成份的分离提取技术，涉及植物提取物领域，具体为一种黑枸杞多糖的提取方法。
背景技术
枸杞目前广泛用于保健食品领域中。枸杞富含枸杞多糖、氨基酸、微量元素、维生素、牛磺酸等化学成分，具有独特的功能和疗效从而常常作为食品辅助添加剂使用。枸杞多糖作为黑枸杞重要的保健成分具有增加免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、促进发育、防治老年性白内障等多种药理作用和生理功能。目前食品中使用的枸杞多为枸杞粉末和全枸杞，消费者食用后难以对其中的活性成分进行完全的吸收，使得枸杞产品保健效果不明显。因此开发可食用的黑枸杞多糖提取物提高枸杞产品的保健效果具有重要的意义。
目前，植物中多糖提取方法多为有机溶剂提取法和酶解提取法，有机溶剂提取法消耗大量的有机溶剂，污染环境，而酶解提取法操作条件苛刻且纯化难度大。水浸提法操作简单，绿色环保以及得到的产物易纯化，但是水浸提法萃取效率低，开发高效的水浸提对实现绿色提取纯化植物多糖具有重要的意义。
技术实现要素：
为了提供可食用的黑枸杞多糖提取物且解决植物多糖提取技术中提取效率低，有机溶剂消耗大以及产物难纯化的问题，本发明提供了一种绿色高效的黑枸杞多糖的提取方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种黑枸杞多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过60目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理10-15min后，与水按1：50-70的质量体积比混合后，在45-60℃条件下浸提8-10h后过滤得滤液，将滤液经过超滤膜过滤除去大分子杂质；
（3）将经过超滤膜过滤后的滤液减压浓缩后，将浓缩液置于超临界流体装置中，经萃取纯化后，剩余的固体溶于水，制备得到黑枸杞多糖溶液；
（4）将固定相注满高速逆流色谱的螺旋管后开启直流电机，进样，进样后顺时针转动，转速调至400-500r／min，并以1.8-1.4ml／min的流量从首端泵入流动相后用自动收集仪收集出样口流出的液体；
（5）将流出的液体浓缩蒸干后利用乙醇重结晶后，冷冻干燥既得黑枸杞多糖的提取物。
优选的，步骤（1）中所述的黑枸杞微粉的粒径不大于5μm。
优选的，步骤（2）中所述的超滤膜的截留分子量的大小为10000。
优选的，步骤（3）中所述的浓缩液的密度为1.15-1.2g/ml;所述的超临界流体萃取条件为萃取压力为20-25mpa，co2流速为15-18l/h，萃取时间为25-30min。
优选的，步骤（3）中所述的黑枸杞多糖溶液中多糖浓度为200-300mg/ml。
优选的，步骤（4）中所述的固定相以及流动相的制备方法为：将正辛醇-四氢呋喃-水按5:8:10的体积比涡旋混合后，静置20-30min后，过分液漏斗后所得上相为固定相，下相为流动相。
优选的，步骤（4）中所述的高速逆流色谱分离时分离温度为30-35℃。
优选的，步骤（5）中所述的黑枸杞多糖的提取物中多糖含量不低于90%。
与现有技术相比，本发明所述的一种黑枸杞多糖的提取方法具有以下有益效果：本发明采用超微粉碎制备微粉后联合微波处理破坏黑枸杞中植物细胞壁，使得多糖化合物能快速浸出，提高提取效率；本发明联合超滤，超临界流体萃取，高速逆流色谱以及重结晶法对黑枸杞多糖进行纯化，使得制备的多糖纯度高，保健作用明显；采用正辛醇-四氢呋喃-水形成两相后将上相即超分子溶剂相作为高速逆流色谱中的固定相，超分子溶剂中的纳米聚集体的强吸附作用显著的提高了多糖的纯化效率。经本发明制备的黑枸杞多糖可以直接作为食品保健品的功能添加剂。
具体实施方式
【实施例1】
一种黑枸杞多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过60目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理12min后，与水按1：60的质量体积比混合后，在50℃条件下浸提8h后过滤得滤液，将滤液经过截留分子量为10000的超滤膜过滤除去大分子杂质；
（3）将经过超滤膜过滤后的滤液减压浓缩后至密度为1.15-1.2g/ml后，将浓缩液置于超临界流体装置中，在萃取压力为22mpa，co2流速为15l/h，萃取时间为25min条件下萃取纯化后，剩余的固体溶于水，制备得到黑枸杞多糖溶液；
（4）将正辛醇-四氢呋喃-水按5:8:10的体积比涡旋混合后，静置30min后，过分液漏斗后所得上相为固定相，下相为流动相;将固定相注满高速逆流色谱的螺旋管后开启直流电机，进样，进样后顺时针转动，转速调至500r／min，并以1.4ml／min的流量从首端泵入流动相后用自动收集仪收集出样口流出的液体；
（5）将流出的液体浓缩蒸干后利用乙醇重结晶后，冷冻干燥既得黑枸杞多糖的提取物。
【实施例2】
一种黑枸杞多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过60目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理10min后，与水按1：55的质量体积比混合后，在50℃条件下浸提11h后过滤得滤液，将滤液经过截留分子量为10000的超滤膜过滤除去大分子杂质；
（3）将经过超滤膜过滤后的滤液减压浓缩后至密度为1.15-1.2g/ml后，将浓缩液置于超临界流体装置中，在萃取压力为23mpa，co2流速为17l/h，萃取时间为30min条件下萃取纯化后，剩余的固体溶于水，制备得到黑枸杞多糖溶液；
（4）将正辛醇-四氢呋喃-水按5:8:10的体积比涡旋混合后，静置30min后，过分液漏斗后所得上相为固定相，下相为流动相;将固定相注满高速逆流色谱的螺旋管后开启直流电机，进样，进样后顺时针转动，转速调至450r／min，并以1.5ml／min的流量从首端泵入流动相后用自动收集仪收集出样口流出的液体；
（5）将流出的液体浓缩蒸干后利用乙醇重结晶后，冷冻干燥既得黑枸杞多糖的提取物。
【实施例3】
一种黑枸杞多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将黑枸杞在真空干燥箱中干燥后，粉碎过60目筛后，将过筛后的粉末再利用粉碎机粉碎后，过100目筛后得黑枸杞微粉；
（2）将黑枸杞微粉在微波下处理12min后，与水按1：65的质量体积比混合后，在50℃条件下浸提12h后过滤得滤液，将滤液经过截留分子量为10000的超滤膜过滤除去大分子杂质；
（3）将经过超滤膜过滤后的滤液减压浓缩后至密度为1.15-1.2g/ml后，将浓缩液置于超临界流体装置中，在萃取压力为25mpa，co2流速为157l/h，萃取时间为30min条件下萃取纯化后，剩余的固体溶于水，制备得到黑枸杞多糖溶液；
（4）将正辛醇-四氢呋喃-水按5:8:10的体积比涡旋混合后，静置30min后，过分液漏斗后所得上相为固定相，下相为流动相;将固定相注满高速逆流色谱的螺旋管后开启直流电机，进样，进样后顺时针转动，转速调至500r／min，并以1.5ml／min的流量从首端泵入流动相后用自动收集仪收集出样口流出的液体；
（5）将流出的液体浓缩蒸干后利用乙醇重结晶后，冷冻干燥既得黑枸杞多糖的提取物。
黑枸杞多糖含量的测定：
标准曲线绘制：
分别取葡萄糖标准储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml去离子水定溶至50ml，配成浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的标准溶液，取2ml标准溶液于锥形瓶中，加入0.2%（g/ml）的蒽酮-硫酸试液（80%的浓硫酸）8ml，沸水浴10min，迅速冷却至室温后，在625nm处测量其吸光值，以标准品溶液浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），进行线性回归，线性回归方程为y=8.1x+0.015，r=0.999。
黑枸杞多糖含量的测定：
将实施例1-3制得的黑枸杞多糖配置成0.06mg/ml的溶液,取2ml溶液于锥形瓶中，加入0.2%（g/ml）的蒽酮-硫酸试液（80%的浓硫酸）8ml，沸水浴10min，迅速冷却至室温，后在625nm处测量其吸光值，并按标准曲线测量其浓度并计算其含量，计算多糖收率，结果见表1。从表1中可以看出经本发明制备的黑枸杞多糖纯度高达90%以上。
表1.实施例1-3中所得黑枸杞多糖的含量及其收率
黑枸杞多糖抗氧化活性测量：
采用dpph法测量黑枸杞多糖的抗氧化活性，取10ml具塞试管，加入2ml（0.05、0.1、0.5、1、2和5mg/ml）的维生素c以及实施例1-3所得的黑枸杞多糖后，分别加入0.2mmol/ldpph溶液（无水乙醇配制）2ml摇匀，在黑暗室温条件下反应30min后，于517nm处测定吸光度。采用2ml无水乙醇与2ml去离子水的混合液调零，以去离子水代替样品溶液做空白对照，每组做三次平行。维生素c做阳性对照，利用下列公式计算其清除率,结果见表2。
表2.实施例1-3中所得黑枸杞多糖以及维生素c的dpph清除能力。
从表2可以看出，本发明提取得到的黑枸杞多糖在低浓度时其抗氧化能力强于维生素c，结果表明本发明的黑枸杞多糖具有良好的保健效果。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。