本发明属于化学领域，涉及一种多糖及在cik细胞培养方面的应用。
背景技术：
紫穗槐amorphafruticosa为豆科leguminosae多年生落叶灌木，别名棉槐、椒条、棉条、穗花槐。花，清热、凉血、止血；叶，微苦、凉，具有祛湿消肿功效，主治痈肿、湿疹、烧烫伤。原产美国东北部和东南部，系多年生优良绿肥，蜜源植物，耐瘠，耐水湿和轻度盐碱土，又能固氮。现我国东北、华北、西北及山东、安徽、江苏、河南、湖北、广西、四川等省区均有栽培。枝叶作绿肥、家畜饲料；茎皮可提取栲胶，枝条编制篓筐；果实含芳香油，种子含油率10％，可作油漆、甘油和润滑油之原料。栽植于河岸、河堤、沙地、山坡及铁路沿线，有护堤防沙、防风固沙的作用。近年来，对紫穗槐的化学成分和药理活性研究的逐步深入，发现很多活性成分，在抗肿瘤、抗病毒、保肝、杀虫等方面显示出潜在的药用价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种多糖及在cik细胞培养方面的应用。本发明通过下面的技术方案实现：技术方案一：一种用于促进cik细胞增殖的多糖，重均分子量为322.3kda。上述多糖的制备方法，包括如下步骤：步骤s1、紫穗槐叶粗多糖的制备将紫穗槐叶剪碎，用体积分数95％乙醇溶液浸泡24h，料液比1:40，过滤收集滤渣；滤渣用水于85℃提取3次，每次2h，料液比1:25，合并提取液，过滤收集滤液；滤液真空浓缩至原有体积1/5，加入5倍体积95％乙醇，静置24h，离心收集沉淀；沉淀用水复溶，冷冻干燥得到紫穗槐叶粗多糖；步骤s2、紫穗槐叶分级多糖f30的制备每10g紫穗槐叶粗多糖溶解于1l的去离子水中形成浓度为1％(w/v，g/ml)的多糖溶液，然后向溶液中缓慢滴加无水乙醇，并不断搅拌使溶液至乙醇浓度为30％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f30组分；f30组分即为所述多糖。上述多糖在cik细胞培养扩增方面的应用。技术方案二：一种用于促进cik细胞增殖的多糖，重均分子量为258.1kda。上述多糖的制备方法，包括如下步骤：步骤s1、紫穗槐叶粗多糖的制备将紫穗槐叶剪碎，用体积分数95％乙醇溶液浸泡24h，料液比1:40，过滤收集滤渣；滤渣用水于85℃提取3次，每次2h，料液比1:25，合并提取液，过滤收集滤液；滤液真空浓缩至原有体积1/5，加入5倍体积95％乙醇，静置24h，离心收集沉淀；沉淀用水复溶，冷冻干燥得到紫穗槐叶粗多糖；步骤s2、紫穗槐叶分级多糖f40的制备每10g紫穗槐叶粗多糖溶解于1l的去离子水中形成浓度为1％(w/v，g/ml)的多糖溶液，然后向溶液中缓慢滴加无水乙醇，并不断搅拌使溶液至乙醇浓度为30％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f30组分；然后向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇，直至混合溶液中乙醇浓度达到40％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f40组分；f40组分即为所述多糖。上述多糖在cik细胞培养扩增方面的应用。技术方案三：一种用于促进cik细胞增殖的多糖，重均分子量为153.2kda。上述多糖的制备方法，包括如下步骤：步骤s1、紫穗槐叶粗多糖的制备将紫穗槐叶剪碎，用体积分数95％乙醇溶液浸泡24h，料液比1:40，过滤收集滤渣；滤渣用水于85℃提取3次，每次2h，料液比1:25，合并提取液，过滤收集滤液；滤液真空浓缩至原有体积1/5，加入5倍体积95％乙醇，静置24h，离心收集沉淀；沉淀用水复溶，冷冻干燥得到紫穗槐叶粗多糖；步骤s2、紫穗槐叶分级多糖f60的制备每10g紫穗槐叶粗多糖溶解于1l的去离子水中形成浓度为1％(w/v，g/ml)的多糖溶液，然后向溶液中缓慢滴加无水乙醇，并不断搅拌使溶液至乙醇浓度为30％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f30组分；然后向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇，直至混合溶液中乙醇浓度达到40％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f40组分；再向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇，直至混合溶液中乙醇浓度达到50％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f50组分；最后向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇，直至混合溶液中乙醇浓度达到60％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f60组分；f60组分即为所述多糖。上述多糖在cik细胞培养扩增方面的应用。有益效果：本发明提供的紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f60均一性较高，且可以显著促进cik细胞的增殖，可以用于cik细胞培养添加剂提高cik细胞的增殖效率。附图说明图1为紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的hpgpc图谱；图2为紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f60对cik细胞的增殖促进作用。具体实施方式下面结合附图和实施例具体说明本发明实质性内容，但并不以此限定其保护范围。一、实验材料紫穗槐叶从东北林业大学林场苗圃采取，洗净阴干后备用。95％乙醇、无水乙醇购于南京化学试剂股份有限公司；gt-t551培养基、胎牛血清购于美国gibco公司；cd3mab购自北京同立源生物科技有限公司，il-2购自江苏金丝利药业有限公司。二、实验方法1、紫穗槐叶粗多糖的制备将紫穗槐叶剪碎，用体积分数95％乙醇溶液浸泡24h，料液比1:40，过滤收集滤渣；滤渣用水于85℃提取3次，每次2h，料液比1:25，合并提取液，过滤收集滤液；滤液真空浓缩至原有体积1/5，加入5倍体积95％乙醇，静置24h，离心收集沉淀；沉淀用水复溶，冷冻干燥得到紫穗槐叶粗多糖；2、紫穗槐叶分级多糖(f30、f40、f50、f60)的制备每10g紫穗槐叶粗多糖溶解于1l的去离子水中形成浓度为1％(w/v，g/ml)的多糖溶液，然后向溶液中缓慢滴加无水乙醇，并不断搅拌使溶液至乙醇浓度为30％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f30组分；然后向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇，直至混合溶液中乙醇浓度达到40％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f40组分；再向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇，直至混合溶液中乙醇浓度达到50％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f50组分；最后向收集的上清液中缓慢滴加无水乙醇，直至混合溶液中乙醇浓度达到60％(v/v，ml/ml)，静置24h，离心20min(4℃、10000×g)，沉淀复溶冻干得f60组分。3、紫穗槐叶分级多糖(f30、f40、f50、f60)的均一性检测采用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)对紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的均一性进行检测。利用agilent1260hplc进行分析，色谱条件：流动相为0.02％nan3溶液，流速0.6ml/min；色谱柱ultrahydrogeltmlinearcolumn(300mm×7.8mm)，ri2410示差检测器均一性检测；检测器温度和柱温均为35℃，样品浓度为1mg/ml，进样量为20μl。4、紫穗槐叶分级多糖(f30、f40、f50、f60)的分子量检测采用高效液相色谱联用多角度激光光散射(hpsec-malls)色谱系统分析紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的分子量。色谱条件：色谱柱：sb-804hq(shodexohpak，8.0mmid×300mml)和sb-806hq(shodexohpak，8.0mmid×300mml)串联。色谱柱和检测器温度均为35℃，流动相为含有0.02％的nan3的0.1mnano3溶液，流速0.6ml/min，样品浓度1mg/ml，进样量100μl，astra6.1软件采集并分析数据。5、紫穗槐叶分级多糖(f30、f40、f50、f60)的活性检测(1)cik细胞分离及原代培养采集健康志愿者血液20ml，平衡温度至室温。取50ml离心管，将血样转至离心管，生理盐水稀释至30ml，吹打均匀。将稀释后的血样缓缓加入另一管装有15ml淋巴细胞分离液的上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min(加速1，刹车0)。离心后血浆层与分离液之间有白膜层可见，分别收集上层血浆和中间白膜层至新的离心管。于收集白膜层的离心管中加入rpmi-1640至45ml，混匀，22℃，1000g离心10min(加速9，刹车9)。重复上一步骤两次，离心速度分别改为400g和201g，最后一次离心之前取20μl混匀的细胞悬液进行台盼蓝染色计数，参照《细胞计数sop》。离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/ml加含有500μg/lcd3mab，1000u/mlil-2和10％fbs的gt-t551培养基诱导培养成cik细胞。(2)cck-8检测细胞增殖活力将培养7d的cik细胞数调整至2×106个/ml，于96孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50μl，设实验组和对照组，实验组分为4组，分别加入紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60终浓度为5μg/ml的培养基(含10％胎牛血清的gt-t551培养基)各50μl，对照组使用不含分级多糖的培养基培养，另设置只含有培养基的空白组，置于细胞培养箱中处理细胞72h，加入10μlcck-8溶液，4h后用酶联免疫检测仪检测od450值a(吸光度的大小与活细胞的数量呈正比)。根据所测od值计算细胞增殖率，细胞增殖率＝(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)×100％。以对照组增殖率为100％。三、实验结果1、紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的均一性紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的hpgpc图谱如图1所示，f30、f40、f50、f60均只含有一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄，表明紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的均一性较好。2、紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的分子量紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的分子量测定结果如表1所示。表1紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的分子量测定结果样品重均分子量(mw)/kda数均分子量(mn)/kda紫穗槐叶分级多糖f30322.3285.9紫穗槐叶分级多糖f40258.1217.5紫穗槐叶分级多糖f50208.8135.2紫穗槐叶分级多糖f60153.268.43、紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60的活性紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60对cik细胞的增殖促进作用如图2和表2所示。与对照组相比，紫穗槐叶分级多糖f30、紫穗槐叶分级多糖f40、紫穗槐叶分级多糖f60可以显著促进cik细胞的增殖，紫穗槐叶分级多糖f50无明显促进作用。表2紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f50、f60对cik细胞的增殖促进作用组别细胞增殖率对照组100％紫穗槐叶分级多糖f30(179.3±7.9)％紫穗槐叶分级多糖f40(165.1±8.6)％紫穗槐叶分级多糖f50(96.5±7.5)％紫穗槐叶分级多糖f60(184.2±9.2)％本发明提供的紫穗槐叶分级多糖f30、f40、f60均一性较高，且可以显著促进cik细胞的增殖，可以用于cik细胞培养添加剂提高cik细胞的增殖效率。上述实施例的作用在于具体介绍本发明实质内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明保护范围局限于具体实施例。当前第1页12