一种模拟眼内压的生物反应器的制作方法

本发明涉及一种模拟眼内压的生物反应器。

背景技术：

人体器官组织的结构和组成成分主要由基因决定，同时在发育过程中受环境因素影响不断进行修饰和重塑。目前大量研究工作已经发现，结缔组织的结构和组成成分随着其在体内承受的不断变化的机械压力而改变。在动物和体外模型的研究中发现，机械应力能够诱导包括骨骼、肌肉、筋膜、血管和角膜等器官组织结构发生变化，同时机械应力也是结缔组织在体内正常发育的重要因素。

血管组织是体内对机械应力变化作出反应改变的器官之一。在血管形成和发育过程中，血管直径的改变与血流量相关，压力改变引起管壁正切力变化，进一步诱导血管壁厚度、组成和微结构发生改变。兔子刚出生时，其升主动脉和肺动脉干的大小、重量和组成相同，一星期后血管重量和蛋白含量发生明显变化。两个月后，弹性蛋白和胶原蛋白在升主动脉管壁上沉积明显高于肺动脉干，而主动脉管壁内侧压力则是肺动脉干的6倍。兔子出生后，血管成纤维细胞能够根据管壁压力调节蛋白合成，适应不同血流量对管壁产生的压力，提示机械压力在血管发育过程中对细胞生长、分化和细胞外基质生成和排列等方面起重要作用。

研究发现，在母体内患有神经肌肉疾病的新生儿出生后，其长骨易发生骨折。而骨折和骨形成不足的原因则是胎儿在宫内运动减少，导致骨骼脆弱和关节挛缩。

在体外研究中同样发现机械压力对细胞生成和分泌细胞外基质的重要作用。动脉成纤维细胞生长在弹性膜上，循环拉伸膜可以促进胶原和粘多糖合成。成纤维细胞是如何对机械应力作出反应的，有实验将材料支架置于张力下，观察到细胞沿着应力方向排列，生成的胶原纤维沿应力方向沉积。在高压力环境下长期培养软骨细胞，可以提高再生软骨的机械强度、厚度、组织均匀性、细胞增殖能力和胶原蛋白交联水平，有效地促进了体外软骨基质的生成。

在鸡胚胎眼研究中发现，眼内压持续降低会减慢眼球和角膜发育速度。同时眼的正常曲率的形成也依赖于胚胎时期正常眼内压的存在。睫状体发育不全的基因突变小鼠，其房水生成减少，小鼠表现为低眼压，长期结果是眼球张力下降，眼球萎缩和组织破坏等。在人类中有一种疾病被称为眼球痨，是长期不正常低眼压的终末阶段，表现为眼球萎缩和眼球组织破坏。因此，眼球和角膜的正常发育，以及成年后眼球功能的正常发挥都依赖于眼内压的存在，表明眼内压对于眼球发育以及其功能维持起着关键作用。

目前组织工程角膜构建的方法主要是将细胞培养在平铺的材料表面，促进细胞在材料表面分泌细胞外基质，但是分泌的细胞外基质厚度有限，基质纤维的排列混乱，强度较低，构建的组织工程角膜透明度较低。已经报道的组织工程角膜构建技术均没有考虑到眼内压对组织工程角膜构建过程的影响。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种模拟眼内压的生物反应器，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种模拟眼内压的生物反应器，包括培养液储存瓶、压力控制组件、组织培养组件；

所述组织培养组件包括一主体和至少一组织培养单元；所述主体包括上盖和底座，所述底座内设有空腔，上盖盖合于底座的上部开口，所述上盖和底座包围形成组织培养室；所述组织培养单元设置于上盖，包括相互卡接的组织培养上扣与组织培养下扣，所述组织培养下扣于组织培养室连通，所述组织培养上扣与组织培养下扣的连接处用于安装组织工程角膜培养的支架材料；

所述培养液储存瓶通过压力控制组件与组织培养室连通。

在本发明一较佳实施例中，还包括溢流组件，所述溢流组件包括溢流杯，所述组织培养上扣开设有溢流孔，所述溢流孔与溢流杯间通过溢流管连接，用于收集培养组织上方溢出的培养基。

在本发明一较佳实施例中，所述上盖开设有通孔，所述组织培养单元设置于通孔，所述通孔的数量不少于组织培养单元的数量。

在本发明一较佳实施例中，所述上盖在不套设组织培养单元的通孔上设有密封塞。

在本发明一较佳实施例中，所述组织培养下扣为设有外螺纹的管状，所述通孔设有与组织培养下扣相匹配的内螺纹，所述组织培养下扣与通孔旋接处还设有密封胶圈。

在本发明一较佳实施例中，所述组织培养上扣为与组织培养下扣直径相适配的管状；所述组织培养上扣与组织培养下扣均设有用于连接的齿形卡扣，所述齿形卡扣处以密封圈密封。

在本发明一较佳实施例中，所述组织培养单元数量为1-20。

在本发明一较佳实施例中，所述压力控制组件包括压力检测装置、压力控制系统、蠕动泵，所述压力检测装置设置于组织培养组件并与压力控制系统连接，所述压力检测装置实时采集组织培养室内的压力并将压力信号转变为电信号反馈至压力控制系统，所述压力控制系统通过调节蠕动泵以调节支架材料的压力。

在本发明一较佳实施例中，所述组织培养室设有与蠕动泵连接的培养液进口和与培养液储存瓶连接的培养液出口。

由于角膜基质结构高度规则、透明同时具有良好的机械韧性，体外模拟角膜基质生成具有挑战性，因此我们需要从角膜发育、角膜的物理、生物和力学特性等多方面综合考虑，模拟体内角膜发育环境，促进更加符合生理状态的组织工程角膜生成。

角膜的正常形状和眼内压对角膜基质细胞特性的维持、角膜结构和机械韧性的建立至关重要。因此模拟体内眼内压环境，对于体外构建功能性角膜替代物是必要的。机械压力可以激活或调解一些信号通路，从而进一步促进体内各种生长因子分泌，促进细胞增殖和细胞外基质生成，并且可以加强细胞外基质大分子之间的化学交联等。机械拉力同样可以改变蛋白酶如胶原酶和弹力酶活性促进某些降解过程，参与细胞外基质重塑等。

此外，不但角膜基质细胞生长在具有机械应力的环境下，角膜上皮和内皮细胞同样发育和生长在眼内压环境下。因此本生物反应器可更好地模拟体内角膜细胞与眼内压之间的相互作用关系，应用于构建组织工程角膜上皮和组织工程角膜内皮，或者组织工程全层角膜。通过提高装置内外的压力差，还可以模拟高眼压模型，用于研究青光眼导致的病理改变；还可用于其它眼部疾病如圆锥角膜的研究，用于研究疾病发病机理，以及筛选疾病治疗药物。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明通过不断循环的培养液，为角膜基质细胞、上皮细胞或内皮细胞提供与眼内压相似的机械压力，能够更好地保持角膜基质细胞特性、促进细胞外基质生成，促进角膜基质细胞以及细胞分泌的胶原纤维沿着应力方向伸展和排列，促进更加符合生理状态的组织构建、分化和成熟，提高组织工程角膜透明性和机械韧性，使组织工程角膜更加符合体内角膜生物学特征。本发明的生物反应器可以很好地模拟眼内压微环境，它不仅有助于体外细胞培养研究，而且可以用于组织工程角膜替代物的进一步开发和完善，为角膜修复和再生提供供体。

2.本发明操作简单，条件控制方便，实验可重复性高。

3.本发明利用蠕动泵对软管产生的驱动力，促进培养液不断地在培养液储存瓶和生物反应器内循环流动，有效减缓了蠕动泵的脉冲效应。通过压力引导角膜基质细胞按照既定方式生长、细胞外基质沿应力方向排列沉积，通过增加培养液的扩散压力促进物质交换、改善营养供应和代谢产物运输。

4.本发明可实现充分的营养供应和交换，压力控制组件可以促进培养液缓慢通过支架材料内部，保证了培养液在组织内部的微量循环流动，并且不断进行交换，同时保证了氧气和二氧化碳的正常供应。

5.本发明设置有溢流杯，有效回收利用培养液同时也避免了污染的风险。

附图说明

图1为本发明组织培养组件和溢流组件结构示意图。

图2为本发明生物反应器连接关系示意图，箭头为培养液流向。

图3为本发明培养细胞电镜照片。其中a，正常兔子角膜基质1000倍透射电镜照片；b，正常兔子角膜基质5000倍透射电镜照片；c，正常兔子角膜基质20000倍透射电镜照片；d，加压培养后角膜基质细胞分泌的细胞外基质1000倍透射电镜照片；e，加压培养后角膜基质细胞分泌细胞外基质5000倍透射电镜照片；f，加压培养后角膜基质细胞分泌细胞外基质20000倍透射电镜照片。

具体实施方式

实施例1

请查阅图2，本实施例的一种模拟眼内压的生物反应器，包括培养液储存瓶93、压力控制组件、组织培养组件；

所述组织培养组件包括一主体和3个组织培养单元17；使用耐高温、高压、无毒、具有生物相容性的材料(包括但不限于塑料、玻璃、不锈钢和聚碳酸酯等)，可以循环使用，同时保证了无菌环境。

所述主体包括上盖5和底座11，所述底座11内设有空腔，上盖5盖合于底座11的上部开口，所述上盖5和底座11包围形成组织培养室13；所述组织培养室13设有与压力控制组件连接的培养液进口61和与培养液储存瓶93连接的培养液出口62。

所述组织培养单元17设置于上盖5，所述上盖5开设有通孔15，所述通孔15的数量不少于组织培养单元17的数量，本实施例中所述通孔15数量为3。

所述组织培养单元17包括相互卡接的组织培养上扣1与组织培养下扣4，所述组织培养下扣4于组织培养室13连通，所述组织培养上扣1与组织培养下扣4的连接处罩设有用于角膜培养的支架材料；本实施例的支架材料采用多层羊膜-角膜基质细胞系统。所述组织培养下扣4为设有外螺纹的管状，所述通孔15设有与组织培养下扣4相匹配的内螺纹，所述组织培养下扣4与通孔15旋接处还设有密封胶圈3。

所述培养液储存瓶93通过压力控制组件与组织培养室13连通。所述组织培养上扣1为与组织培养下扣4直径相适配的管状；所述组织培养上扣1与组织培养下扣4均设有用于连接的齿形卡扣，所述齿形卡扣处以密封圈密封。齿形卡扣之间稍微咬合在一起时即可密封，避免上下连接旋紧时支架材料被挤破，保持材料完整性的同时保证了生物反应器的密封性。

所述培养液储存瓶93的水平放置位置高于组织培养组件。本实施例的压力控制组件压力检测装置、压力控制系统97、蠕动泵91，所述压力检测装置设置于组织培养组件并与压力控制系统97连接。使用压力检测装置动态监测实时采集组织培养室13内的压力，并将压力信号转变为电信号反馈至压力控制系统97，压力控制系统97根据设置好的压力调节步进电机驱动，改变出液口软管面积，从而控制组织培养室13内的压力，因此提供的压力达到了可控和标准化。本实施例的压力检测装置为压力传感器，压力控制系统97为计算机内部控制程序，所述蠕动泵91的转速为0.5～5ml/min，优选为1ml/min。本生物反应器用重力作用提供主要动力，蠕动泵91使用较小转速来驱动培养液循环，这样小的转速所产生的微小脉冲在到达生物反应器之前已经被缓冲消失，所以可以给组织工程支架提供稳定的应力。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于：本实施例的生物反应器还包括溢流组件，所述溢流组件包括溢流杯7和杯盖71，所述组织培养上扣1开设有溢流孔2，所述溢流孔2与溢流杯7间通过溢流管8连接。

利用本实施例进行模拟眼内压的细胞培养操作如下：

1、将生物反应器在高温高压环境下灭菌；

2、在超净台内，将细胞培养载体材料-角膜基质细胞系统平铺在组织培养下扣4表面，组织培养上扣1的齿形卡扣与组织培养下扣4的齿形卡扣错开，将组织培养上扣1在载体表面旋动，上下齿形卡扣咬合在一起时即可；

3、将组织培养组件与培养液储存瓶93和蠕动泵91连接，打开蠕动泵91、使培养液充满组织培养室13、排气，载体-角膜基质细胞系统在培养液作用下呈现一定曲率；

4、连接溢流杯7，定期换液，放置在95％湿度、37℃的co2培养箱内可以稳定运行至少8周，无培养液渗漏和污染，生成具有一定厚度、机械韧性同时透明的组织工程角膜基质替代物；

5、培养8星期后取材，用透射电镜观察角膜基质细胞分泌细胞外基质的超微结构，详见图3，结果显示其由正相交排列的胶原纤维排列成多层纤维薄片结构；

6、进一步观察此组织工程角膜替代物的可行性，对兔子进行前板层角膜移植，观察角膜基质替代物术后的透明性、是否上皮化、与周围组织的融合程度等。

本领域技术人员可知，当本发明的技术参数在如下范围内变化时，可以预期得到与上述实施例相同或相近的技术效果：当上盖5的通孔15数量多于组织培养单元17数量时，所述上盖5在不套设组织培养单元17的通孔15上设有密封塞，灵活运用于单个或多个培养系统。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。