本发明涉及农业和动物检疫
技术领域：
：，具体涉及一种华支睾吸虫、东方次睾吸虫和（暂无中文名）holostephanusdubinini的检测方法，具体涉及一种华支睾吸虫、东方次睾吸虫和holostephanusdubinini的多重pcr检测方法。此外，本发明还涉及用于同时检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫和holostephanusdubinini的引物。
背景技术：
：：鱼源性吸虫（fishbornezoonotictrematodes,fbt）是食源性寄生虫的一类，主要通过鱼类传播，人和动物通过食入生的或未熟的含有吸虫囊蚴的鱼而感染，其中多种吸虫是对人类和动物造成严重危害的人兽共患寄生虫。华支睾吸虫（c.sinensis）、东方次睾吸虫（m.orientalis）和h.dubinini均属于鱼源性吸虫，其第一中间宿主为淡水螺，感染性囊蚴寄生在其第二中间宿主淡水鱼内，终末宿主可因食入含有感染性囊蚴的淡水鱼而感染。华支睾吸虫是鱼源性吸虫的代表虫种，全球约有3500万人感染华支睾吸虫病，主要分布于亚洲，是一种十分重要的人兽共患寄生虫。华支睾吸虫寄生于宿主的胆囊和肝胆管内，可引起宿主胆管炎、胆结石和肝硬化，还可诱发胆管上皮细胞癌，已被国际癌症研究机构分类为i类生物致癌物。东方次睾吸虫主要寄生于家禽和一些哺乳动物（包括人）的胆囊和胆管内，可引起与华支睾吸虫相似的临床症状。关于东方次睾吸虫病的报道较少，我国报道主要见于江苏省和福建省。由于其与华支睾吸虫的生活史和临床症状极其相似，临床上东方次睾吸虫病极易被误诊为华支睾吸虫病，因此，东方次睾吸虫是一种被忽视的人兽共患寄生虫。h.dubinini是一种主要感染禽类的吸虫，寄生于宿主的肠道，可引起宿主贫血，消瘦和共济失调等临床症状，关于该虫的报道较少，中国偶有关于h.dubinini感染禽类的报道。虽然三种吸虫成虫的形态易于区别，但寄生于淡水鱼体内的吸虫囊蚴形态极其相似，需要丰富临床经验的科研人员才可以进行区分，但形态学鉴定往往靠人为主观进行判断，容易造成误判。因此，依靠形态学鉴定这些吸虫囊蚴受到了很大的局限。随着分子生物学技术的发展，pcr技术已广泛应用于病原的快速检测领域。与常规检测技术相比，此种方法不仅缩短了检测时间，而且节约了人力和物力，为病原的快速诊断提供了可靠的依据。核糖体的内转录间隔区(its)和线粒体dna被证明是良好的遗传标记基因。核糖体its具有相对进化速度快，物种内具有保守性而物种间又存在特异性的优势。线粒体dna独立于核基因组，且具有较高的突变率和母系遗传特征，因此适合作为寄生虫分子分类、物种鉴定和系统进化的分子标记。目前国内外尚无有关利用多重pcr方法检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini囊蚴的报道。因此，本发明基于核糖体its序列及线粒体基因组设计特异性引物，用多重pcr方法检测这三种淡水鱼优势囊蚴，消除了常规检测中误检、漏检和耗时等问题，可直观地从基因水平同时检测到三种吸虫囊蚴的存在，为预防鱼源性吸虫病提供科学的参考依据，具有显著的社会公共卫生学意义。技术实现要素：本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种用于同时检测淡水鱼中三种常见吸虫囊蚴多重pcr引物及设计方法。本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于同时检测淡水鱼中三种常见吸虫囊蚴多重pcr检测方法，其具有简单、快速，敏感性高和特异性强的特点，避免了繁杂的形态鉴定与测序步骤，即可同时检测淡水鱼中华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini囊蚴。本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：在本发明的一方面，提供一种淡水鱼中华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini囊蚴的多重pcr检测方法，具体步骤包括：1、虫体dna提取；2、引物设计与筛选；3、多重pcr反应条件优化；4、多重pcr扩增特异性验证；5、多重pcr扩增敏感性验证；6、临床样品检测方法的可行性验证。步骤1中，所述的华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini囊蚴基因组dna提取方法为：从阿氏液中分别取出经鉴定的吸虫囊蚴的单囊蚴，按照omegabio-tek公司dna小剂量提取试剂盒说明书分别提取三种吸虫囊蚴的基因组dna，-20℃保存备用。步骤2中，所述的三种吸虫囊蚴引物设计与筛选具体为：应用生物学软件dnastar8.0、primerpremier6.0和oligo7.0对三种吸虫囊蚴种间的核糖体its基因序列及线粒体基因组序列进行比对分析，选择同源性较低的区域，设计华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini特异性引物。筛选确定最终实验所用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种的目标产物，并且在实施多重pcr过程中，多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见表1。表1三种吸虫囊蚴特异性引物序列信息步骤3中，所述的pcr反应条件优化具体方法为：反应体系为25μl，其中10×exbuffer2.5μl，dntp（2.5mmol）2μl，上、下游引物500nmol/l，根据多重pcr目的条带的亮度进行调整三对引物的加入量及比例，dna模板1μl，extaqdna聚合酶0.2μl，加入ddh2o调整总体积至25μl。对三对引物的浓度（100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l、400nmol/l、500nmol/l）及退火温度（49℃、50℃、51℃、52℃、53℃）进行优化。最终确定最佳的多重pcr反应体系为：25μl反应体系中10×exbuffer2.5μl，dntp（2.5mmol）2μl，三种吸虫囊蚴的引物（华支睾吸虫引物500nmol/l、东方次睾吸虫引物300nmol/l，h.dubinini引物300nmol/l）各0.5μl，dna模板（20ng/μl）各1μl，extaqdna聚合酶0.2μl，加ddh2o调整总体积至25μl。最佳pcr反应条件为：92℃预变性2min；92℃变性30s、51℃退火30s、72℃延伸30s、共30个循环；72℃终延伸7min。步骤4中，所述的多重pcr扩增特异性验证具体方法为：同时利用华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini三对引物，分别以华支睾吸虫、东方次睾吸虫、h.dubinini和三种模板的不同组合，以及鸭对体吸虫、舟形嗜气管吸虫、横川后殖吸虫和卷棘口吸虫的基因组dna为模板，按照步骤3中pcr反应体系与条件进行扩增，以评价该方法的特异性。步骤5中，所述的pcr敏感性验证具体为：利用nano-drop2000超微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）测定三种吸虫囊蚴dna质量浓度，统一稀释为相同质量浓度，再进行倍比稀释，质量浓度分别稀释成原液的10-1~10-5倍，按照步骤3中pcr反应体系与条件进行扩增，以评价该方法的敏感性。步骤6中，所述的临床样品检测方法的可行性验证具体为：将经形态学和分子生物学鉴定为三种吸虫囊蚴感染或混合感染阳性的淡水鱼样品，提取总基因组dna，按照步骤3中pcr反应体系与条件进行检测。在本发明的另一方面，还提供用于同时检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫、h.dubinini的引物，其序列为：华支睾吸虫的特异性引物：csf：5’-gttgctttcgtcttgtcgtgtt-3’(seqidno.1)；csr：5’-atcaaggacggcatcaaactac-3’(seqidno.2)；东方次睾吸虫的特异性引物：mof：5’-ttcgttgattgtttcgggattg-3’(seqidno.3)；mor：5’-aataaccaaagaacaggggaaa-3’(seqidno.4)；h.dubinini的特异性引物：hdf：5’-aatgattatgctcacaagtatg-3’(seqidno.5)；hdr：5’-tcatttgaaaacaacacagggg-3’(seqidno.6)。上述淡水鱼中三种常见吸虫囊蚴多重pcr检测方法具有如下优点：1.操作简单快速：本发明的多重pcr检测方法3小时内即可完成，省去了形态学鉴定或基因测序的琐过程，不仅缩短了检测时间，而且节约了人力和物力。2.结果直观：本发明设计的三对引物长度相同，均为22bp，gc含量和熔解温度（tm）相近，可有效的避免了引物间的错配和引物二聚体及发卡结构的形成，扩增的基因片段分别为508bp、311bp和203bp，因此，通过琼脂糖凝胶电泳可在一个电泳胶上显示出不同条带代表的虫种，直观地从基因水平检测三种吸虫囊蚴的存在。3.高敏感性和高特异性：本发明的多重pcr检测方法具有较好的敏感性，模板dna的最低检测浓度可达20ng/μl×10-4。同时，该方法具有较高的特异性，特异性地扩增出三种吸虫囊蚴，而对于相近的吸虫虫种扩增结果均为阴性，解决了常规检测中误检、漏检的问题。4.引物灵活组合：本发明的多重pcr检测引物，可根据现地检测需要进行自由组合，为临床快速检测及虫种鉴定提供了重要的技术手段。与现有技术相比，本发明可以同时检测和鉴定淡水鱼三种常见吸虫囊蚴（华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini）。该方法操作简单快速，结果直观，且具有高敏感性和高特异性，传统的形态学鉴定方法与测序鉴定方法无法满足这些条件。另外，本发明设计的三对引物可根据需要灵活组合，进行联合检测。附图说明图1是本发明实施例中多重pcr扩增特异性验证的结果示意图。m：dl2000marker；1：华支睾吸虫+东方次睾吸虫+h.dubinini混合模板；2：华支睾吸虫+东方次睾吸虫混合模板；3：华支睾吸虫+h.dubinini混合模板；4：东方次睾吸虫+h.dubinini混合模板；5：东方次睾吸虫模板；6：华支睾吸虫模板；7：h.dubinini模板；8-11：鸭对体吸虫、舟形嗜气管吸虫、横川后殖吸虫、卷棘口吸虫dna模板；12：阴性对照。图2是本发明实施例中pcr敏感性试验验证的结果示意图。图2a是东方次睾吸虫单一pcr敏感性试验的结果示意图；图2b是华支睾吸虫单一pcr敏感性试验的结果示意图；图2c是h.dubinini单一pcr敏感性试验的结果示意图；其中，m：dl2000marker；1-5：10-1~10-5倍稀释的dna模板。具体实施方式下面通过具体实施例及附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。实施例1华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini囊蚴基因组dna的提取基因组dna的提取按照omegabio-tek公司dna小剂量提取试剂盒描述进行提取，方法如下：（1）将已鉴定的三种吸虫的单囊蚴分别置于无菌的1.5mleppendorf管中；（2）加入灭菌ddh2o反复洗涤三次后，弃去ddh2o；（3）加入200μllb1和20μlproteinasek，55℃水浴孵1~3h至消化完全；（4）12000r/min离心2min，转移上清置另一无菌1.5mleppendorf管中；（5）加入10μl10%lb2，涡旋震荡5s；（6）加入200μlbb，涡旋震荡5s，70℃孵育10min；（7）加入200μl无水乙醇，涡旋震荡5s；（8）将全部溶液加入吸附柱中，12000r/min离心1min，弃去收集管中液体；（9）加入500μl溶液cb，12000r/min离心1min，弃去收集管中液体；（10）加入700μl溶液wb1，12000r/min离心1min，弃去收集管中液体；（11）重复步骤（10）一次；（12）12000r/min离心3min，彻底去除残留的wb1；（13）将吸附柱置于另一无菌1.5mleppendorf管中，加入100μl的eb，室温静置5min后，12000r/min离心5min，洗脱dna；（14）洗脱的dna于-20℃保存备用。实施例2三种吸虫囊蚴多重pcr的引物设计与筛选应用生物学软件dnastar8.0、primerpremier6.0和oligo7.0对三种吸虫囊蚴种间的核糖体its基因序列及线粒体基因组序列进行比对分析，选择同源性较低的区域，设计华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini特异性引物。最终选择华支睾吸虫的线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位v（nad5）、东方次睾吸虫的线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位ii（nad2）和h.dubinini的核糖体内转录间隔区（its）分别设计特异性引物，送往生工生物工程(上海)有限公司进行合成，引物序列见表1。表1三种吸虫囊蚴特异性引物序列信息table1informationofspecificprimersequencesforthethreekindsoftrematodemetacercariae实施例3三种吸虫囊蚴多重pcr反应体系与条件多重pcr反应条件具体方法为：反应体系为25μl，其中10×exbuffer2.5μl，dntp（2.5mmol）2μl，上、下游引物500nmol/l，根据多重pcr目的条带的亮度进行调整三对引物的加入量及比例，dna模板1μl，extaqdna聚合酶0.2μl，加入ddh2o调整总体积至25μl。对三对引物的浓度（100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l、400nmol/l、500nmol/l）及退火温度（49℃、50℃、51℃、52℃、53℃）进行优化。最终确定最佳的多重pcr反应体系为：25μl反应体系中10×exbuffer2.5μl，dntp（2.5mmol）2μl，三种吸虫囊蚴的引物（华支睾吸虫引物500nmol/l、东方次睾吸虫引物300nmol/l，h.dubinini引物300nmol/l）各0.5μl，dna模板（20ng/μl）各1μl，extaqdna聚合酶0.2μl，加ddh2o调整总体积至25μl。最佳pcr反应条件为：92℃预变性2min；92℃变性30s、51℃退火30s、72℃延伸30s、共30个循环；72℃终延伸7min。实施例4三种吸虫囊蚴多重pcr扩增特异性验证同时利用本发明设计的三对引物（见表1），分别以华支睾吸虫、东方次睾吸虫、h.dubinini和三种模板的不同组合，以及鸭对体吸虫、舟形嗜气管吸虫、横川后殖吸虫和卷棘口吸虫的基因组dna为模板，按照上述pcr反应体系与条件进行扩增。同时利用本发明设计的三对引物分别对华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini的模板进行pcr扩增，均扩增出单一特异性目的条带；同时利用三对引物分别对华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini的混合模板进行pcr扩增，扩增出3条特异性的目的条带；同时利用三对引物分别对华支睾吸虫与东方次睾吸虫、东方次睾吸虫与h.dubinini和华支睾吸虫与h.dubinini三种不同组合的模板进行pcr扩增，分别扩增出2条特异性目的条带；同时利用三对引物分别对华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini三种模板的不同组合进行pcr扩增，分别扩增出相应的特异性目的条带；同时利用三对引物对鸭对体吸虫、舟形嗜气管吸虫、横川后殖吸虫和卷棘口吸虫的模板进行pcr扩增，均未扩增出相应条带（见图1）。因此，三种吸虫囊蚴多重pcr扩增特异性试验证实了这三对引物具有很强的特异性，可用于同时检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini。实施例5三种吸虫囊蚴多重pcr扩增敏感性验证利用nano-drop2000超微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）测定三种吸虫囊蚴dna质量浓度，华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubininidna的质量浓度分别为：34.2ng/μl，30.8ng/μl和24.3ng/μl，将其统一稀释为20ng/μl。再将三种吸虫囊蚴模板进行倍比稀释，质量浓度分别稀释成原液的10-1~10-5倍，按上述条件进行多重pcr扩增，单一pcr对华支睾吸虫、东方次睾吸虫和h.dubinini的最小检出量分别为20ng/μl×10-4、20ng/μl×10-4、20ng/μl×10-5（见图2）。因此，三种吸虫囊蚴多重pcr扩增敏感性试验证实了这三对引物对模板浓度的敏感性较高，可满足检测到淡水鱼中一个囊蚴的存在。实施例6临床样品检测方法的可行性验证利用本发明建立的三种吸虫囊样多重pcr方法对随机地点采集的52尾淡水鱼样品囊蚴感染情况进行检测，结果显示东方次睾吸虫感染阳性3份，华支睾吸虫感染阳性16份，h.dubinini感染阳性13份，多数样品呈混合感染，上述检测的结果与利用形态学检测的结果一致。因此，应用多重pcr方法对临床样品进行检测验证试验证实了该方法的可行性。序列表<110>黑龙江省兽医科学研究所<120>淡水鱼中三种吸虫囊蚴多重pcr检测方法及检测用引物<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>华支睾吸虫(c.sinensis)<400>1gttgctttcgtcttgtcgtgtt22<210>2<211>22<212>dna<213>华支睾吸虫(c.sinensis)<400>2atcaaggacggcatcaaactac22<210>3<211>22<212>dna<213>东方次睾吸虫(m.orientalis)<400>3ttcgttgattgtttcgggattg22<210>4<211>22<212>dna<213>东方次睾吸虫(m.orientalis)<400>4aataaccaaagaacaggggaaa22<210>5<211>22<212>dna<213>h.dubinini<400>5aatgattatgctcacaagtatg22<210>6<211>22<212>dna<213>h.dubinini<400>6tcatttgaaaacaacacagggg22当前第1页12当前第1页12