宫颈小细胞癌相关的HPV整合基因位点及其应用的制作方法

本发明涉及生物诊断领域，尤其涉及一种宫颈小细胞癌相关的hpv整合基因位点及其应用。
背景技术：
：宫颈癌是全世界中青年女性(20-39岁)癌症死亡的第二大原因，其组织病理类型为鳞癌、腺癌、腺鳞癌及罕见难治类型宫颈癌(如：宫颈小细胞癌、宫颈透明细胞癌等)。随着早期筛查的卫生保障体系的逐步完善、科学家对宫颈癌发病机制的深入研究以及近10余年人乳头瘤病毒(hpv)疫苗的普及应用，全球宫颈癌发病率正逐年下降。持续性高危型人乳头瘤病毒(hr-hpv)感染被公认为宫颈癌发生的主要致病因子。然而近年来，我国宫颈癌发病率却明显反弹且发病高峰年龄趋于年轻化，可能原因为：1.随着我国人民性观念的逐渐开放，hpv感染更加泛滥；2.hpv疫苗在我国大陆地区获批上市时间较晚(二价、四价hpv疫苗分别于2016年7月、2017年5月才获得批准在临床使用)且hpv疫苗尚未纳入普通居民医疗保险范畴。fda推荐的hpv疫苗接种时间为9-26岁。显然，大批中国妇女已经超过了注射宫颈癌疫苗的推荐年龄，她们在不受疫苗保护的未来几十年中依然有较高风险罹患宫颈癌。因此，在我国，宫颈癌仍然是需要积极研究的重大疾病。经手术+放化疗的规范治疗，早期的常见类型宫颈癌(鳞癌、腺癌)的5年生存率已经能达到约70％。然而，一些罕见难治类型宫颈癌，由于其发病率极低、发病机制不明、容易误诊漏诊以及恶性度高、对放化疗不敏感，生存率依然没有得到有效改善，预后极差，亟待攻关。宫颈小细胞癌(small-cellcarcinomaofthecervix,sccc)是一种罕见但恶性程度极高的特殊宫颈癌类型，属于宫颈神经内分泌癌的一种，发病率为侵袭性宫颈癌的1％-2％。和宫颈鳞癌和腺癌相比，sccc在疾病早期就能出现较高的淋巴节转移率和血管间隙浸润率，大多数患者在治疗后数月就会迅速出现肿瘤复发。sccc的诊断标准和治疗方案均参考了肺小细胞癌的诊断和治疗经验：诊断标准为形态学(镜下肿瘤呈小圆形)+免疫组化染色(至少一项神经内分泌指标阳性，如cga、nse、syn、cd56)；标准治疗方案为手术+放化疗的综合治疗。但是，上述方案对sccc的疗效较差，5年生存率不足14％。由于其罕见性，大部分有关sccc的报道是病例个案报告和小规模临床疗效观察，目前尚无权威的针对sccc致病机制、hpv整合状态及整合机制的基础研究。既往发展的hpv整合位点的检测方法有southern杂交(cullenap等，jvirol，1991；65：606-612)、整合hpv病毒致癌基因转录子的扩增(klaesr等，cancerres，1999；59：6132-6136)、限制性酶切位点pcr(thorlandec等，cancerres，2000；60：5916-5921)、实时定量pcr(peitsarop等，jclinmicrobiol，2002；40：886-891)和dna原位杂交(evansmf等，jpathol，2004；202：1-4)。虽然这些方法都能对hpv整合位点进行检测，但均存在敏感度低、操作繁琐、耗时、需大量的样品、对结果判断不确定等缺点。随着高通量测序技术的迅速发展，捕获测序及全基因组测序成为精准检测hpv整合的有效方法(huz等，natgenet，2015，47:158-63)。目前，对于宫颈癌高危人群的检测方法及产品主要是针对有无高危型hpv感染进行检测，但并非所有的高危型hpv感染者都发生了宫颈癌，目前针对hpv的整合位点来检测常见类型宫颈癌高危人群的方法及产品正在研发中(cn104830869a)，尚无检测宫颈小细胞癌hpv整合位点的研究及产品。技术实现要素：本发明克服本领域常规检测宫颈小细胞癌无法获知是否有hpv整合的信息的缺陷，提供了一种用于诊断宫颈小细胞癌的生物标志物或含其的试剂盒及其应用。本发明的生物标志物组合及含其的试剂盒具有快速、精准、方便、假阳性率低等优点，具有重要的临床诊断意义。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为，用于诊断宫颈小细胞癌的生物标志物，所述生物标志物为以下基因家族：myc基因家族、nr4a基因家族或ankrd基因家族或其组合，或其所编码的蛋白，其中，所述生物标志物整合有hpv的部分序列或全部序列。本发明中，所述“部分序列”指比“全序列”短至少1个核苷酸或氨基酸的hpv的序列片段。在一具体实施例中，所述myc基因家族包括myc基因和mycn基因；所述nr4a基因家族包括nr4a2基因；所述ankrd基因家族包括ankd12基因。在一较佳实施例中，所述hpv为hpv16和/或hpv18。在一具体实施例中，所述生物标志物整合hpv的部分序列或全部序列。在一较佳实施例中，整合hpv的部分序列或全部序列如seqidno：97至seqidno：144所示。在一具体实施例中，所述生物标志物整合hpv的部分序列或全部序列产生断点，所述断点包括hpv断点及人基因组上的断点如以下表格所示。sccc肿瘤中，除了本发明hpv整合的生物标志物以外，还有其他生物标志物的报道，将已经报道的生物标志物与本发明的生物标志物组合在一起，将能更好地诊断sccc。因此，在一优选实施例中，所述生物标志物还包括insm1和/或ascl1。在一具体实施例中，以上所述的生物标志物，可以通过wgs、vcs或免疫组化检测。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为，如上所述的生物标志物在制备宫颈小细胞癌的诊断标志物或含其的试剂盒中的用途。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为，一种诊断宫颈小细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测如权利要求1-7任一项所述生物标志物的试剂。优选地，所述试剂为引物。更优选地，所述引物的扩增产物为如seqidno：97至seqidno：144所示的序列。最优选地，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：1所示，下游核苷酸序列如seqidno：49所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：2所示，下游核苷酸序列如seqidno：50所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：3所示，下游核苷酸序列如seqidno：51所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：4所示，下游核苷酸序列如seqidno：52所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：5所示，下游核苷酸序列如seqidno：53所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：6所示，下游核苷酸序列如seqidno：54所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：7所示，下游核苷酸序列如seqidno：55所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：8所示，下游核苷酸序列如seqidno：56所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：9所示，下游核苷酸序列如seqidno：57所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：10所示，下游核苷酸序列如seqidno：58所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：11所示，下游核苷酸序列如seqidno：59所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：12所示，下游核苷酸序列如seqidno：60所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：13所示，下游核苷酸序列如seqidno：61所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：14所示，下游核苷酸序列如seqidno：62所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：15所示，下游核苷酸序列如seqidno：63所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：16所示，下游核苷酸序列如seqidno：64所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：17所示，下游核苷酸序列如seqidno：65所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：18所示，下游核苷酸序列如seqidno：66所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：19所示，下游核苷酸序列如seqidno：67所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：20所示，下游核苷酸序列如seqidno：68所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：21所示，下游核苷酸序列如seqidno：69所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：22所示，下游核苷酸序列如seqidno：70所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：23所示，下游核苷酸序列如seqidno：71所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：24所示，下游核苷酸序列如seqidno：72所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：25所示，下游核苷酸序列如seqidno：73所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：26所示，下游核苷酸序列如seqidno：74所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：27所示，下游核苷酸序列如seqidno：75所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：28所示，下游核苷酸序列如seqidno：76所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：29所示，下游核苷酸序列如seqidno：77所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：30所示，下游核苷酸序列如seqidno：78所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：31所示，下游核苷酸序列如seqidno：79所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：32所示，下游核苷酸序列如seqidno：80所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：33所示，下游核苷酸序列如seqidno：81所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：34所示，下游核苷酸序列如seqidno：82所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：35所示，下游核苷酸序列如seqidno：83所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：36所示，下游核苷酸序列如seqidno：84所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：37所示，下游核苷酸序列如seqidno：85所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：38所示，下游核苷酸序列如seqidno：86所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：39所示，下游核苷酸序列如seqidno：87所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：40所示，下游核苷酸序列如seqidno：88所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：41所示，下游核苷酸序列如seqidno：89所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：42所示，下游核苷酸序列如seqidno：90所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：43所示，下游核苷酸序列如seqidno：91所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：44所示，下游核苷酸序列如seqidno：92所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：45所示，下游核苷酸序列如seqidno：93所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：46所示，下游核苷酸序列如seqidno：94所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：47所示，下游核苷酸序列如seqidno：95所示；或，所述引物的上游核苷酸序列如seqidno：48所示，下游核苷酸序列如seqidno：96所示。在一较佳实施例中，所述的试剂盒还包括dna提取试剂和pcr扩增用试剂。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：1、使用本发明的生物标志物或含其的试剂盒，能够辅助诊断宫颈小细胞癌，或者筛出有进展为宫颈小细胞癌风险的癌前病变人群从而进行重点监测。2、在人群中进行宫颈癌普筛时，使用本发明的生物标志物或含其的试剂盒能更有针对性的筛出宫颈小细胞癌患者及高危人群，可以更灵敏地诊断或减少工作量。综上，本发明所述的利用hpv整合位点为生物标志物检测小细胞宫颈癌高危人群的标志物组合及含其的试剂盒具有快速、精准、方便、假阳性率低等优点，具有重要的临床诊断意义。附图说明图1sccc中hpv整合分析图中反映了150个样本中hpv病毒所整合基因家族的比率。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1样本准备与处理组织dna提取试剂盒(qiaampdnaminikit)购买自qiagen公司。选择16例宫颈小细胞癌患者癌灶组织及癌旁对照组织作为样本。1)取25毫克宫颈组织切碎，置于1.5毫升管中，加入180微升溶液bufferatl，震荡混匀；2)加入20微升蛋白酶k(proteinasek)，震荡，56℃水浴直到宫颈组织完全溶解；3)低速离心甩下管顶液体，加5微升100毫克/毫升rnaasea，震荡15秒；4)加入200微升溶液bufferal，震荡15秒，70℃水浴10分钟；5)简短离心，加入200微升无水乙醇，间断震荡15秒；简短离心，转入2毫升spincolumn，转速为8000转/分，离心1分钟，弃离心液体；6)加入500微升溶液bufferaw1，转速为8000转/分，离心1分钟，弃离心液体；7)加入溶液bufferaw2，转速为14000转/分，离心3分钟，弃离心液体；8)将spincolumn吸附柱空转1分钟，充分离去酒精；9)加入bufferae洗脱dna，洗脱的dna存于1.5毫升管中，保存在-80℃冰箱中，获得1微克的宫颈组织的基因组dna。实施例2高通量病毒整合检测对16对新鲜冰冻组织进行wgs测序。将实施例1中提取的宫颈组织的基因组dna样品从-80℃冰箱中取出，放在加有干冰的保温箱中，送到深圳华大基因科技有限责任公司进行wgs测序。以下为16对样品wgs测序结果，结果显示，hpv16/18整合在基因myc、mycn、nr4a2和ankd12中，其样本百分比如表1所示。表2显示了hpv基因组插入人基因组后，人基因组和hpv的断点。表1.16对样品wgs测序结果基因样本百分比基因myc31.25％基因mycn6.25％基因家族myc合计37.5％基因nr4a26.25％基因ankd126.25％实施例3利用pcr扩增和sanger测序验证hpv整合位点设计扩增所述整合位点的上下游引物，按以下表2体系配制反应体系。表2.pcr反应体系每管分别混匀，在标准的pcr扩增仪，使用表3程序扩增：表3.pcr扩增程序将扩增后得到的pcr产物送至公司进行sanger测序。相关基因的整合信息及引物序列如下表所示。表4.生物标志物整合位点、整合序列和引物序列实施例4高通量测序法验证大量临床样本对150例ffpe标本成功进行hpv病毒捕获测序(vcs)，进行hpv整合分析(见图1)具体地，hpv整合热点在3个基因家族中有显著富集，且均与肿瘤发生密切相关，分别为：myc家族(样本百分比为37.04％，鳞癌腺癌中仅为9.7％)，nr4a家族(样本百分比为6.17％)、ankrd家族(样本百分比为4.94％)。有趣的是，hpv18倾向于整合在myc家族中，而hpv16倾向于整合在nr4a家族基因中(p<0.01，图1)。表5.hpv在大规模临床样品中的整合情况基因家族样本百分比基因家族myc37.04％基因家族nr4a6.17％基因家族ankrd4.94％hpv基因组插入后，人基因组和hpv的断点和引物序列参见表4。本发明发现：hpv18是sccc中最主要的感染类型(83.3％)，同时也是最主要的整合类型(63.3％)。上述结果与最常见的宫颈鳞癌有显著差异(鳞癌中hpv16为最主要感染和整合型别)。据文献报道，hpv18在不同宫颈病变组织中(例如宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌组织)的检出率无显著性差异，因此hpv18和sccc的关系是本发明首次发现，且其关联性和其它指标相比效果好很多。实施例5临床样本的阳性检出率金标准-病理学诊断：1.形态酷似小细胞肺癌，细胞体积小，呈大小较一致的短梭形或圆形细胞、胞浆少、核深染、染色质呈粗颗粒状，无核仁或核仁不明显，核分裂相多见。2.免疫组化至少表达1种神经内分泌标志物，如：cga、syn、cd56和nse等(albores-saavedraj,gerselld,gilkscb,etal.terminologyofendocrinetumorsoftheuterinecervix:resultsofaworkshopsponsoredbythecollegeofamericanpathologistsandthenationalcancerinstitute.archpathollabmed.1997jan；121(1):34-9.kajiwarah,hirabayashik,miyazawam,etal.immunohistochemicalexpressionofsomatostatintype2areceptorinneuroendocrinecarcinomaofuterinecervix.archgynecolobstet,2009,279(4):521～525)。以金标准检出的sccc样本中，实施例4所述的整合位点真阳性检出率为50％(wgs数据)和47％(vcs数据)，而在普通类型宫颈癌中，阳性率仅为10％。由此可见，本发明的生物标志物可以与金标准检测方法相结合，由于金标准方法步骤繁琐、时间成本高，先使用本发明的生物标志物极大地降低了操作时间。此外，也可以在明确诊断为宫颈癌的样本中，用此试剂盒协助诊断其亚型sccc。现有的诊断手段是特定的免疫组化指标阳性，我们的发明为协助诊断该类型宫颈癌提供了新的方法。此外，在已经检测到宫颈癌或者癌前病变(cin)的样本中使用本发明的生物标志物或含其的试剂盒，能够辅助诊断宫颈小细胞癌，或者筛出有进展为宫颈小细胞癌风险的癌前病变人群从而进行重点监测。因为所述癌前病变病人具有更高的患癌风险，应该早期进行干预，如行宫颈锥切手术，而现有的指南对癌前病变的分级诊治主要从病理形态学角度出发，没有从分子生物学改变的角度说明哪些癌前病变的人可以继续观察随访，哪些需要立即干预。此外，在人群中进行宫颈癌普筛的时候，应用该试剂盒能更有针对性的筛出宫颈小细胞癌患者及高危人群，可以更灵敏地诊断或减少工作量，而传统检测sccc的方法的确无法获知hpv整合的信息。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>武汉凯德维斯生物技术有限公司<120>宫颈小细胞癌相关的hpv整合基因位点及其应用<130>p180113917c<160>144<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物1<400>1ggaaacagcagtaatggctt20<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物2<400>2gcttctgtccttgtttgctt20<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物3<400>3tgcctacctatggtacattgaa22<210>4<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物4<400>4gacagtataccccatgctgc20<210>5<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物5<400>5ttctgaacaccctgtccttt20<210>6<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物6<400>6gatccagaaggtacagacgg20<210>7<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物7<400>7gcagagctagagacagcaca20<210>8<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物8<400>8gtccacaatgatgcacaagt20<210>9<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物9<400>9cggtacaagtgacaatagcaa21<210>10<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物10<400>10aacccaacaatagcagaagg20<210>11<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物11<400>11attgcgaagtagtgttgcag20<210>12<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物12<400>12caaaaatagatgaaggggga20<210>13<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物13<400>13tttaacctcctcttgggatg20<210>14<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物14<400>14tttctgaggacgttagggac20<210>15<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物15<400>15gtcaggctggtcttgaactc20<210>16<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物16<400>16tgaaagaccaaagatgtccc20<210>17<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物17<400>17acccttctttcctccactct20<210>18<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物18<400>18aacccaacaatagcagaagg20<210>19<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物19<400>19tggtgggatacatgacaatg20<210>20<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物20<400>20tctaactgctgcttgtgtgg20<210>21<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物21<400>21ttccggttgaccttctatgt20<210>22<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物22<400>22ccgtccattattgaagttcc20<210>23<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物23<400>23atccccttgaacattcacac20<210>24<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物24<400>24ggagacacacctgagtggat20<210>25<211>20<212>dna<213>art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