一种抗PD-L1抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗体及其制备方法和应用，尤其涉及一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
随着生物医药技术的发展，肿瘤免疫治疗方法的优势日益突出，特别是因肿瘤免疫治疗能够激活或诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移，因此肿瘤免疫治疗及相关药品的开发已经成为近期的研究热点。肿瘤免疫治疗主要分为以下几种：传统细胞因子、多肽类药物、免疫检查点抑制剂、car-t细胞治疗，这几种方法本质上都是间接或直接激活人体t细胞，从而发挥t细胞抗肿瘤活性，清除肿瘤细胞。在有效的抗肿瘤免疫过程中，t细胞首先被t细胞受体(tcellreceptor，tcr)介导的抗原识别信号激活，同时众多的共刺激信号和共抑制信号精细调节t细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。肿瘤细胞可以利用此机制，异常上调共抑制分子及其相关配体，抑制t细胞激活，从而逃避免疫杀伤。针对免疫检查点的阻断是增强t细胞激活的有效策略之一，也是近些年抗肿瘤药物开发最热门靶点。目前临床研究较透彻的免疫检查点分子有：细胞毒性t淋巴细胞相关抗原(ctla-4)、细胞程序性死亡受体1(programmedcelldeath-1，pd-1)及程序性死亡配体1(programmeddeathligand-1，pd-l1)、程序性死亡配体2(programmeddeathligand-2，pd-l2)。pd-l1是pd-1的重要负性免疫调节因子，又称b7-h1，其作用时，肿瘤细胞表面的pd-l1配体与t细胞表面的pd-1受体结合，向细胞内传递调控信号，抑制t细胞的活化与增殖，甚至诱导t细胞的凋亡，使肿瘤细胞躲避免疫监视，发生免疫逃逸现象。由于肿瘤细胞能够持续高表达pd-l1，降低机体免疫应答能力，科学家通过研发阻断pd-1/pd-l1结合的抗体，阻断pd-1/pd-l1信号通路，激活衰竭的t细胞，增强免疫应答反应，加强对肿瘤的控制，这是介导肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。研究表明，很多人源肿瘤细胞和肿瘤相关抗原呈递细胞高水平表达pd-l1，从而逃避抗肿瘤免疫反应。研究开发阻断pd-1/pd-l1通路的药物，可以为多种癌症及其他t细胞耗竭相关的疾病提供新的治疗方法。因此，开发可阻断pd-1/pd-l1通路的药物，如pd-l1抗体，可以为多种癌症及其他相关疾病提供新的治疗方法。目前，美国fda批准上市的pd-1/pd-l1抗体药物已达5种，其中pd-1抗体药物有keytruda(pembrolizumab)、opdivo(nivolumab)，pd-l1抗体有tecentriq(atezolizumab)、bavencio(avelumab)、imfinzi(durvalumab)等。tecentriq(atezolizumab)，2016年，罗氏的tecentrip获fda批准用于尿路上皮癌(膀胱癌)的治疗，以及用于治疗靶向药、化疗失败的非小细胞肺癌患者，成为第一个上市的pd-l1抑制剂。因此，提供一种新型抗pd-l1抗体能够拓宽抗体药物的候选范围，并提供一种通过生物信息学设计发现抗体的方法，大大缩短抗体发现周期，提升对多种肿瘤免疫疾病的治疗希望，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种抗体及其制备方法和应用，尤其涉及一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用，通过生物信息学建模模拟分析、设计抗体序列，无需经过复杂繁琐的免疫反应，抗体设计出后通过分子生物学构建转入宿主细胞，在宿主细胞中表达后经纯化即可得到所述抗体，高效便捷，有巨大的市场价值和应用前景。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种抗pd-l1的抗体，所述抗体包括两类：抗体ⅰ和/或抗体ⅱ；所述抗体ⅰ包含轻链和重链，所述抗体ⅰ轻链可变部分包含互补决定区ⅰ-cdr-l1、ⅰ-cdr-l2和ⅰ-cdr-l3，分别选自如下氨基酸序列：ⅰ-cdr-l1为qx2x3x4x5t；ⅰ-cdr-l2为x7x8s；ⅰ-cdr-l3为lx12x13x14sx16x17ft；其中，x2＝d、e、n、q，x3＝g、a、v、i、l，x4＝g、a、v、i、l，x5＝q、n；x7＝g、a、v、i、l，x8＝s、t；x12＝q、y、n，x13＝y、f，x14＝g、a、v、i、l，x16＝s、t、y，x17＝f、p。ⅰ-cdr-l1指抗体ⅰ轻链可变部分互补决定区cdr1；ⅰ-cdr-l2指抗体ⅰ轻链可变部分互补决定区cdr2；ⅰ-cdr-l3指抗体ⅰ轻链可变部分互补决定区cdr3。所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h1、ⅰ-cdr-h2和ⅰ-cdr-h3，分别选自如下氨基酸序列：ⅰ-cdr-h1为gyx22x23x24x25yw；ⅰ-cdr-h2为iyx30x31x32sx34t；ⅰ-cdr-h3为tx37wx39x40x41x42x43hx45mx47h；其中：x22＝s、t，x23＝f、y，x24＝n、s、t、y、q，x25＝s、t、f；x30＝p、h、w，x31＝g、a、v、i、l，x32＝n、q、h，x34＝d、e；x37＝r、h，x39＝g、a、v、i、l，x40＝d、e，x41＝g、a、v、i、l，x42＝y、f，x43＝y、f，x45＝g、a、v、i、l，x47＝q、n、d、e。ⅰ-cdr-h1指抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区cdr1；ⅰ-cdr-h2指抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区cdr2；ⅰ-cdr-h3指抗体ⅰ重链可变部分互补决定区cdr3。所述抗体ⅱ包含轻链和重链，其中，所述抗体ⅱ轻链可变部分包含互补决定区ⅱ-cdr-l1、ⅱ-cdr-l2和ⅱ-cdr-l3，分别选自如下氨基酸序列：ⅱ-cdr-l1为sx52x53x54y；ⅱ-cdr-l2为x56x57s；ⅱ-cdr-l3为qx60rx62sx64x65yt；其中：x52＝s、t，x53＝g、a、v、i、l，x54＝y、t、s；x56＝y、t、s，x57＝y、t、s；x60＝n、q、y，x62＝f、t、s，x64＝y、f，x65＝p、h、w。ⅱ-cdr-l1指抗体ⅱ轻链可变部分互补决定区cdr1；ⅱ-cdr-l2指抗体ⅱ轻链可变部分互补决定区cdr2；ⅱ-cdr-l3指抗体ⅱ轻链可变部分互补决定区cdr3。所述抗体ⅱ重链可变部分包含互补决定区ⅱ-cdr-h1、ⅱ-cdr-h2和ⅱ-cdr-h3，分别选自如下氨基酸序列：ⅱ-cdr-h1为gyx70x71x72sx74v；ⅱ-cdr-h2为inx77x78x79dx81t；ⅱ-cdr-h3为ax84sx86x87x88x89x90y；其中：x70＝s、t、y、f，x71＝t、y、f，x72＝t、s，x74＝y、f、p；x77＝y、h、p，x78＝y、f，x79＝q、n、y，x81＝g、a、v、i、l；x84＝w、r、k，x86＝g、a、v、i、l，x87＝g、a、v、i、l，x88＝g、a、v、i、l，x89＝s、t、f，x90＝d、e。ⅱ-cdr-h1指抗体ⅱ的重链可变部分互补决定区cdr1；ⅱ-cdr-h2指抗体ⅱ的重链可变部分互补决定区cdr2；ⅱ-cdr-h3指抗体ⅱ重链可变部分互补决定区cdr3。所述抗体ⅰ的轻链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-l1包含氨基酸序列seqidno17、18、19、20、21、22、23、24之一。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-l1包含氨基酸序列seqidno.18、19、21、23之一。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-l2包含氨基酸序列seqidno.25、26、27、28、29、30之一。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-l2包含氨基酸序列seqidno.25、26、29、30之一。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-l3包含氨基酸序列seqidno.31、32、33、34、35、36、37、38之一。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-l3包含氨基酸序列seqidno.33、34、36、38之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h1包含氨基酸序列seqidno.39、40、41、42、43、44、45之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h1包含氨基酸序列seqidno.40、42、43、44、45之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h1包含氨基酸序列seqidno.40、42、44、45之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h2包含氨基酸序列seqidno.46、47、48、49、50、51、52之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h2包含氨基酸序列seqidno.46、48、49、51之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h3包含氨基酸序列seqidno.53、54、55、56、57、58、59、60、61、62之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h3包含氨基酸序列seqidno.53、54、57、59、62之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h3包含氨基酸序列seqidno.54、57、59、62之一。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-l1、ⅰ-cdr-l2和ⅰ-cdr-l3，分别包含如下氨基酸序列组合之一：seqidno17、26和38；seqidno17、24和35；seqidno.19、26和31；seqidno.19、29和34；seqidno.20、30和32；seqidno.21、30和32；seqidno.23、25和33；seqidno.22、29和38；seqidno.22、30和34；seqidno.21、28和33；seqidno.24、27和36；seqidno.18、29和37；seqidno.21、25和38；seqidno.18、25和34；seqidno.18、28和33；seqidno.23、30和35；seqidno.23、29和38。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分互补决定区ⅰ-cdr-h1、ⅰ-cdr-h2和ⅰ-cdr-h3，分别包含如下氨基酸序列组合之一：seqidno.40、52和53；seqidno.42、47和54；seqidno.45、49和55；seqidno.45、48和59；seqidno.39、51和55；seqidno.43、47和58；seqidno.42、49和56；seqidno.41、50和60；seqidno.44、48和62；seqidno.40、52和61；seqidno.43、51和57；seqidno.45、52和56；seqidno.44、46和57；seqidno.42、46和57；seqidno.43、48和62；seqidno.42、50和54；seqidno.45、46和61。优选地，所述抗体ⅰ轻链和/或重链互补决定区氨基酸序列包括与抗体ⅰ轻链和/或重链互补决定区氨基酸序列具有85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％及其以上同源性的氨基酸序列、且与抗体ⅰ所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。其中，所述同源性氨基酸序列包括与所述抗体氨基酸序列之间存在85-100％重复率的序列。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分氨基酸序列包含seqidno.107-seqidno.114之一。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分氨基酸序列包含seqidno.115-seqidno.122之一。优选地，所述抗体ⅰ轻链和/或重链互补决定区氨基酸序列包括经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与抗体ⅰ所示的轻链和/或重链互补决定区氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。优选地，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个。优选地，所述抗体ⅱ的轻链互补决定区ⅱ-cdr-l1包含氨基酸序列seqidno.63、64、65、66、67、68之一。优选地，所述抗体ⅱ的轻链互补决定区ⅱ-cdr-l1包含氨基酸序列seqidno.63、64、65、67之一。优选地，所述抗体ⅱ的轻链互补决定区ⅱ-cdr-l2包含氨基酸序列seqidno.69、70、71、72之一。优选地，所述抗体ⅱ的轻链互补决定区ⅱ-cdr-l2包含氨基酸序列seqidno.69、70、72之一。优选地，所述抗体ⅱ的轻链互补决定区ⅱ-cdr-l3包含氨基酸序列seqidno.73、74、75、76、77、78、79、80、81之一。优选地，所述抗体ⅱ的轻链互补决定区ⅱ-cdr-l3包含氨基酸序列seqidno.76、77、78、79、80、81之一。优选地，所述抗体ⅱ的重链互补决定区ⅱ-cdr-h1包含氨基酸序列seqidno.82、83、84、85、86、87、88之一。优选地，所述抗体ⅱ的重链互补决定区ⅱ-cdr-h1包含氨基酸序列seqidno.82、83、86、88之一。优选地，所述抗体ⅱ的重链互补决定区ⅱ-cdr-h2包含氨基酸序列seqidno.89、90、91、92、93、94、95之一。优选地，所述抗体ⅱ的重链互补决定区ⅱ-cdr-h2包含氨基酸序列seqidno.89、90、91、93之一。优选地，所述抗体ⅱ的重链互补决定区ⅱ-cdr-h3包含氨基酸序列seqidno.96、97、98、99、100、101、102、103、104之一。优选地，所述抗体ⅱ的重链互补决定区ⅱ-cdr-h3包含氨基酸序列seqidno.96、98、99、102之一。优选地，所述抗体ⅱ的轻链互补决定区ⅱ-cdr-l1、ⅱ-cdr-l2和ⅱ-cdr-l3，分别包含如下氨基酸序列组合之一：seqidno.63、69和76；seqidno.64、70和81；seqidno.65、71和77；seqidno.68、70和73；seqidno.67、72和76；seqidno.66、72和80；seqidno.64、72和77；seqidno.67、72和81；seqidno.63、70和79；seqidno.63、70和74；seqidno.64、69和75；seqidno.67、72和78；seqidno.63、70和80；seqidno.66、69和78；seqidno.65、71和79。优选地，所述抗体ⅱ的重链互补决定区ⅱ-cdr-h1、ⅱ-cdr-h2和ⅱ-cdr-h3，分别包含如下氨基酸序列组合之一：seqidno.82、89和96；seqidno.83、90和98；seqidno.84、95和103；seqidno.85、91和97；seqidno.88、92和102；seqidno.86、91和99；seqidno.87、94和100；seqidno.88、93和101；seqidno.88、90和99；seqidno.83、91和99；seqidno.82、93和102；seqidno.86、95和98；seqidno.86、91和104；seqidno.82、89和102；seqidno.84、93和96。优选地，所述抗体ⅱ轻链和/或重链互补决定区氨基酸序列包括与抗体ⅱ轻链和/或重链互补决定区氨基酸序列具有85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％及其以上同源性的氨基酸序列、且与抗体ⅱ所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。其中，所述同源性氨基酸序列包括与所述抗体氨基酸序列之间存在85-100％重复率的序列。优选地，所述抗体ⅱ的轻链可变部分氨基酸序列包含seqidno.123-seqidno.132之一。优选地，所述抗体ⅱ的重链可变部分氨基酸序列包含seqidno.133-seqidno.142之一。优选地，所述抗体ⅱ轻链和/或重链互补决定区氨基酸序列包括经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与抗体ⅱ所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。优选地，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个。本发明中，发明人从蛋白结构数据库中提取已知抗体的结构数据，通过cdr区分类，按照特征聚类后，构建结构数据库，随后将抗原与该数据库通过分子对接等方法，获取最优抗体序列，通过生物信息学建模模拟分析、设计抗体序列，无需经过复杂繁琐的免疫反应，抗体设计出后通过分子生物学构建转入宿主细胞，在宿主细胞中表达后经纯化即可得到所述抗体；所述的抗体是基于生物信息学建模模拟抗体结构靶点设计出的抗体序列，通过人工合成表达出抗体。优选地，所述抗体ⅰ的轻链可变部分的骨架区fr选自如下序列：ⅰ-fr-l1为seqidno.1:diqmtqspsslsasvgdrvtitcras。ⅰ-fr-l2为seqidno.2:lnwlqqkpgkaikrliy。ⅰ-fr-l3为seqidno.3:sldsgvpkrfsgsrsgsdysltisslqpedfatyyc。ⅰ-fr-l4为seqidno.4:fgqgtkleik。优选地，所述抗体ⅰ的重链可变部分的骨架区选自如下序列：ⅰ-fr-h1为seqidno.5:vqlvqsgaevkkpgasvkvsckas。ⅰ-fr-h2为seqidno.6:mhwvrqapgqglewmga。ⅰ-fr-h3为seqidno.7:synqkfkgrvtitavtsastaymelsslrsedtavyyc。ⅰ-fr-h4为seqidno.8:wgqgtlvtvs。优选地，其中，所述抗体ⅱ的轻链可变部分的骨架区选自如下序列：ⅱ-fr-l1为seqidno.9:tqspsflsasvgdrvtitcsas。ⅱ-fr-l2为seqidno.10:mhwfqqkpgkspklwiy。ⅱ-fr-l3为seqidno.11:nlasgvparfsgsgsgtsysltisslqpedfatyyc。ⅱ-fr-l4为seqidno.12:fgqgtkleik。优选地，其中，所述抗体ⅱ的重链可变部分的骨架区选自如下序列：ⅱ-fr-h1为seqidno.13:vqlvqsgaevkkpgasvkvsckas。ⅱ-fr-h2为seqidno.14:mhwvrqapgqglewmgy。ⅱ-fr-h3为seqidno.15:kynekfkgrvtitsdksastaymelsslrsedtavyyc。ⅱ-fr-h4为seqidno.16:wgqgtlvtvs。优选地，所述抗体还包括人恒定区。优选地，所述人恒定区包括igg1、igg2、igg3或igg4中的任意一种或至少两种的组合，优选为igg1、igg4。优选地，所述抗体还包括鼠恒定区。优选地，所述鼠恒定区包括igg1、igg2a、igg2b或igg3中的任意一种或至少两种的组合，优选为igg2a。优选地，所述抗体经糖基化修饰。优选地，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体或抗体变体中的任意一种或至少两种的组合。第二方面，本发明提供一种核酸，所述核酸编码如第一方面所述的抗体。第三方面，本发明提供一种载体，所述载体包含如第二方面所述的核酸。第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的核酸和/或第三方面所述的载体，表达如第一方面所述的抗体。优选地，所述宿主细胞为真核细胞和/或原核细胞。优选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞，进一步优选为人胚肾hek293细胞、猿猴cos细胞、骨髓瘤细胞或中国仓鼠卵巢细胞中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述原核细胞包括大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌或鼠伤寒沙门氏菌中的任意一种或至少两种的组合。具体地，载体和宿主细胞的选择例如可以是原核载体与原核宿主细胞。原核载体功能原件包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(rbs)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。原核表达宿主细胞，包括古细菌(archaebacteria)和真细菌(eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌；有用细菌的实例包括埃希氏菌属(escherichia)(如大肠埃希氏菌(e.coli))、芽孢杆菌属(bacilli)(如枯草芽孢杆菌(b.subtilis))、肠杆菌属(enterobacteria)、假单胞菌属物种(pseudomonasspecies)(如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescans)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形菌属(proteus)、志贺氏菌属(shigella)、根瘤菌属(rhizobia)、透明颤菌属(vitreoscilla)或副球菌属(paracoccus)；在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个具体实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主；在使用质粒如pbr322、pbr325、pacyc177或pkn410来提供复制子时，可用大肠杆菌、沙雷氏菌属(serratia)、沙门氏菌属(salmonella)物种可以作为宿主细胞。特别地，原核宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶；可通过构建蛋白水解酶缺陷型的菌株作为宿主细胞；也可在细胞培养过程中可以添加一定量的蛋白酶抑制剂，防止表达抗体的水解。具体的，载体和宿主细胞的选择例如可以是真核载体与宿主细胞。真核表达载体通常包括信号序列、复制起点、标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的任意一种或至少两种的组合。信号序列构件：在真核宿主中使用的载体还可在成熟蛋白质或多肽的n端包含编码信号序列或具有特异切割位点的其它多肽的插入，优先选择的异源信号序列是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的，在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gd信号，将这些前体区的dna连接到编码本发明的抗体的dna的读码框中。可选择的标志基因：表达和克隆载体可包含可选择标志基因，包括：赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；补足相应的营养缺陷；提供不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码杆菌(bacilli)的d-丙氨酸消旋酶的基因。启动子：表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与编码所需抗体序列的核酸可操作连接；所有真核基因都具有富含at区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处；在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是cncaat区，其中n可以是任何核苷酸，在大多数真核的3′端是aataaa序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polya)尾的信号，所有这些序列可以插入真核表达载体中。其它适于真核宿主的启动子包括phoa启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶启动子，色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，诸如tac启动子，然而，其它已知的细菌启动子也是适合的，细菌系统中使用的启动子还将含有可操作连接编码抗体多肽的dnashine-dalgarno(s.d.)序列。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(sv40))基因组获得的启动子、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、来自热休克启动子的启动子的控制，启动子需要与宿主细胞系统具有很好的相容性。增强子：载体中插入增强子序列可提高高等真核细胞对编码抗体dna的转录，通常使用来自真核细胞病毒的增强子，如sv40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。终止子：在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还包含终止转录和稳定mrna所必需的序列，这些区域包含在编码抗体的mrna的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。第五方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的抗体的方法，包括如下步骤：(1)设计如第一方面所述的抗体序列；(2)选择宿主细胞并构建含有步骤(1)得到的抗体序列的载体；(3)将步骤(2)得到的载体转化或转染到宿主细胞内，进行表达；(4)将步骤(3)表达的抗体进行分离纯化。优选地，步骤(1)所述抗体序列的设计方法包括如下步骤：(1’)抗原结构建模：通过把目标抗原蛋白质链与蛋白质序列数据库中的蛋白质链进行多序列比对，确定蛋白序列的同源区域；(2’)抗体结构建模：通过未知结构序列与已知三维结构抗体的比对，通过同源模建方法，产生优化的抗体同源模型，进行loop区模建及基于结构的比对并构建抗体结构模型；(3’)抗原、抗体结构优化：给模拟体系赋力场参数，初始结构检查及预处理、初始结构能量最小化；(4’)抗原、抗体对接：结合遗传算法搜索构象并优化，找到最佳抗体结合模式后，计算结合模式和亲和力，通过打分函数，得到最优抗体序列。具体地，抗体序列设计步骤如下：经过生物信息学建模分析，设计抗体结构，设计一系列抗体序列，抗体可变区由fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4组成，设计出两类抗体：抗体ⅰ、抗体ⅱ，抗体ⅰ、抗体ⅱ、阳性对照的部分氨基酸序列分别包含表1、表2、表3序列，抗体ⅰ、抗体ⅱ及阳性对照抗体的恒定部分氨基酸序列选自表4；抗体可变部分fr区序列分别选自表5，表1-5见实施例；依据此方法共设计2种抗体，分别为抗体ⅰ、抗体ⅱ。抗体ⅰ与人pd-l1抗原的结合能力很强，与阳性对照抗体具有相同的抗原结合表位；抗体ⅱ具有与人pd-l1抗原较强的结合能力，且其与阳性对照抗体具有不同的抗原结合表位。本文中所述“阳性对照”抗体是指豪夫迈·罗氏有限公司(f.hoffmann-larocheltd)公开的抗pd-l1抗体，阳性对照抗体轻链可变部分序列、重链可变部分序列分别如表3中seqidno.105与seqidno.106所示，轻链、重链恒定部分序列分别如表4中seqidno.143、seqidno.144所示。具体地，载体和宿主细胞的选择例如可以是原核载体与原核宿主细胞；原核载体功能原件包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(rbs)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。原核表达宿主细胞，包括古细菌(archaebacteria)和真细菌(eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌；有用细菌的实例包括埃希氏菌属(escherichia)(如大肠埃希氏菌(e.coli))、芽孢杆菌属(bacilli)(如枯草芽孢杆菌(b.subtilis))、肠杆菌属(enterobacteria)、假单胞菌属物种(pseudomonasspecies)(如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescans)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形菌属(proteus)、志贺氏菌属(shigella)、根瘤菌属(rhizobia)、透明颤菌属(vitreoscilla)或副球菌属(paracoccus)；在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主；在使用质粒如pbr322、pbr325、pacyc177或pkn410来提供复制子时，可用大肠杆菌、沙雷氏菌属(serratia)、沙门氏菌属(salmonella)物种可以作为宿主细胞。特别地，原核宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶；可通过构建蛋白水解酶缺陷型的菌株作为宿主细胞；也可在细胞培养过程中可以添加一定量的蛋白酶抑制剂，防止表达抗体的水解。具体的，载体和宿主细胞的选择例如可以是真核载体与宿主细胞。真核表达载体通常包括信号序列、复制起点、标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列中的任意一种或至少两种的组合。信号序列构件：在真核宿主中使用的载体还可在成熟蛋白质或多肽的n端包含编码信号序列或具有特异切割位点的其它多肽的插入，优先选择的异源信号序列是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的，在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gd信号，将这些前体区的dna连接到编码本发明的抗体的dna的读码框中。可选择的标志基因：表达和克隆载体可包含可选择标志基因，包括：赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；补足相应的营养缺陷；提供不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码杆菌(bacilli)的d-丙氨酸消旋酶的基因。启动子：表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与编码所需抗体序列的核酸可操作连接；所有真核基因都具有富含at区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处；在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是cncaat区，其中n可以是任何核苷酸，在大多数真核的3′端是aataaa序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polya)尾的信号，所有这些序列可以插入真核表达载体中。其它适于真核宿主的启动子包括phoa启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶启动子，色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，诸如tac启动子，然而，其它已知的细菌启动子也是适合的，细菌系统中使用的启动子还将含有可操作连接编码抗体多肽的dnashine-dalgarno(s.d.)序列。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(sv40))基因组获得的启动子、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、来自热休克启动子的启动子的控制，启动子需要与宿主细胞系统具有很好的相容性。增强子：载体中插入增强子序列可提高高等真核细胞对编码抗体dna的转录，通常使用来自真核细胞病毒的增强子，如sv40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子和腺病毒增强子。终止子：在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还包含终止转录和稳定mrna所必需的序列，这些区域包含在编码抗体的mrna的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。宿主细胞的选择和转化，按照常规的高等真核细胞组织培养流程培养，特别是脊椎动物宿主细胞，如用哺乳动物宿主细胞系的实例有经sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcccrl1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk，atccccl10)、中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr、小鼠塞托利(sertoli)细胞、猴肾细胞(cv1，atccccl70)、非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcccrl1587)、人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)、犬肾细胞(mdck，atccccl34)、牛鼠肝细胞(brl3a，atcccrl1442)、人肺细胞(w138，atccccl75)、人肝细胞(hepg2，hb8065)、小鼠乳瘤(mmt060562，atccccl51)、tri细胞、mrc5细胞、fs4细胞和人肝细胞。具体地，载体构建的步骤如下：将设计的一系列抗体氨基酸序列转变为对应的核酸序列，通过常规人工基因合成方法合成核酸片段，将经过扩增得到的dna片段经过连接或转化构建到载体上，得到载有抗体序列对应dna片段的载体。具体地，抗体表达的步骤如下：1)原核宿主细胞中抗体表达原核抗体表达，将构建好的载有目标dna片段的载体，转化(导入)原核宿主细胞(感受态细胞)，并在培养基中培养转化的宿主细胞。感受态细胞制备可采用氯化钙、聚乙二醇/dmso、或电击处理原核细胞的细胞壁，使细胞处于感受态，从而利于载体导入宿主细胞中；培养基可以选用lb培养基，或根据构建的载体选择合适的带有选择剂的培养基，如添加氨苄青霉抗性的培养基；选择合适的温度培养原核宿主细胞，如大肠杆菌培养温度约20℃至约39℃、更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃，培养基的ph主要取决于宿主生物体，一般在5-9范围内，大肠杆菌细胞(e.coli)ph6.5-7.5，更优选为6.9-7.1。2)真核细胞中抗体表达将构建的载有目标dna片段的载体，转入真核宿主细胞，如转染入真核细胞，如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾hek293细胞、猿猴cos细胞、骨髓瘤细胞等，经培养后收集清液中表达的抗体。3)抗体片段抗体片段可以通过化学试剂和基因工程的方法获得，化学试剂片段是通过打断铰链区的二硫键或者是用蛋白酶，包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，消化抗体后产生的，基因工程产生的片段提供大量的片段，每一个都能有特异性的结合区和功能特质。抗体片段可以是fab、fab'、(fab')2、fv，scfv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scfv、mimi抗体、fab2、fab3等；由于抗体片段比完整抗体更小，通常没有被糖基化，可以在原核表达系统中表达，节省时间和资金消耗。双特异性抗体，三特异性抗体和四特异性抗体在放射免疫治疗和体内的影像学诊断方面都有潜在的应用价值。具体地，抗体的分离与纯化的步骤如下：(1)表达抗体的分离表达到胞内的抗体蛋白，需要将宿主细胞经渗压震扰、超声、裂解等处理后，离心或过滤除去细胞，收集抗体清液；分泌到胞外的抗体蛋白，可将抗体清液直接离心或过滤分离出来，收集抗体清液。(2)抗体的纯化抗体的纯化，将收集到的抗体清液，通过免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相hplc、硅土或阳离子交换树脂、层析、sds-page、硫酸铵沉淀、凝胶过滤(如sephadexg-75)等方法纯化。抗体蛋白的纯化，还可采用将固定在固相载体上的proteina用于本发明全长抗体或抗体片段产物的免疫亲和纯化，由于proteina与抗体fc区具有很高的亲和力，从而能够将抗体或抗体片段结合到固定到固相载体上的proteina上，经过后续洗脱后，得到高纯度的单克隆抗体，载有proteina的柱子可以使用试剂如甘油包被，防止杂质的非特异附着，可通过清洗固相清除非特异粘附的杂质，最后可通过洗脱从固相载体上回收目的抗体或抗体片段蛋白。proteina的固相载体，proteina可以固定到具有玻璃或石英表面的柱子，如可控孔径玻璃柱或硅酸柱；proteina还可以固定到磁珠，经纯化的单克隆抗体4℃保藏备用。第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括第一方面所述的抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的载体或第四方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述组合物还包括药学上可接受的的载体、缓冲剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂以及其它生物活性物质。优选地，所述其他生物活性物质包括细胞毒剂、化疗剂、生长抑制剂、放射疗法剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂中的任意一种或至少两种的组合。当以抗体片段为活性成分时，优选特异性结合靶蛋白的结合结构域的最小抑制片段；例如，基于抗体的可变区序列，可以设计这样的抗体片段或甚至肽分子，其保留结合靶蛋白序列的能力，可以通过化学合成和/或重组dna技术产生所述肽。缓冲剂包括有机酸、无机酸、有机酸盐和无机酸盐，例如柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、醋酸盐；另外，缓冲剂可以由组氨酸和三甲胺盐构成，例如tris，缓冲剂的浓度控制在45-235mm范围，通过缓冲剂维持制剂的ph值，维持最佳ph值从而维持抗体的最佳活性或治疗效果。防腐剂包括氯化十八烷二甲基苄基铵；氯化六烃季铵；苯甲烃铵卤化物(如氯化物、溴化物、碘化物)，苄索氯铵；硫柳汞，苯酚，丁基或苄基醇；烃基对羟苯甲酸，例如甲基对羟苯甲酸或丙基对羟苯甲酸；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇，3-戊醇，和间甲酚，加入防腐剂，抑制微生物的生长。稳定剂又称张力剂，包括多羟基糖醇，优选的三羟基或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；稳定剂可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，减少分子内和分子间的相互作用，可以与可调整或维持组合物的液体张力，从而调整或维持组合物的液体张力。赋形剂，赋形剂包括可以充当一个或多个以下试剂的试剂：填充剂、溶解增强剂、稳定剂和抑制变性或对容器壁的附着的药剂；此类赋形剂包括：多羟基糖醇；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏四糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(如环己六醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水多聚体，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖；三糖，如棉子糖；多聚糖，如糊精和葡聚糖。非离子表面活性剂包括如聚山梨醇酯(20、40、60、65、80)，polyoxamers(184、188)，pluronic多元醇，triton，聚氧化乙烯山梨聚糖单醚(tween-20、tween-80)，lauromacrogol400，聚氧40硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油(10、50、60)，单硬脂酸甘油酯，脂肪酸糖酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素，非离子型表面活性剂可以帮助治疗剂溶解，以及保护治疗蛋白对抗搅动引起的聚集，其也容许制剂遭受剪切表面应力而不导致活性治疗蛋白或抗体的变性。另外，还可以使用阴离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠，丁二酸二辛基磺酸钠、二辛基磺酸钠；还可以使用阳离子表面活性剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵。抗体制剂的无菌化：可采用过滤除菌，保藏备用。其他生物活性物质，包括但不限于细胞毒剂、化疗剂、生长抑制剂、放射疗法剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂中的任意一种或至少两种的组合。细胞毒剂，指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质，包括放射性同位素(例如at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32和lu的放射性同位素)，化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)c，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂，酶及其片段，诸如溶核酶，抗生素，和毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药和下文记载了其它细胞毒剂。化疗剂，指可用于治疗癌症的化学化合物；化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkylsulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol))；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)cpt-11(伊立替康(irinotecan)，酰喜树碱，东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮(mechlorethamineoxidehydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1i和加利车霉素ω1i；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicina；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素c(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素d(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-l-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素c，霉酚酸(mycophenolicacid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷(azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(jhsnaturalproducts，eugene，or)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2'，2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是t-2毒素，蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如紫杉烷，包括帕利他塞(paclitaxel)(bristol-myerssquibboncology，princeton，n.j.)，不含克列莫佛(cremophor)，清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(americanpharmaceuticalpartners，schaumberg，illinois)和多西他塞(docetaxel)(-poulencrorer，antony，france)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)铂；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)任何上述物质的药剂学可接受的盐，酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如chop(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和folfox(奥沙利铂(eloxatintm)联合5-fu和亚叶酸的治疗方案的缩写)。别的化疗剂包括可用作抗体药物缀合物的细胞毒剂，诸如美登木生物碱(例如dm1)和auristatin(例如mmae和mmaf)。“化疗剂”还包括起调节，降低，阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(serm)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，ly117018，奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(erd)；起抑制或关闭卵巢作用的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(lhrh)激动剂，诸如和醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)，醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)，醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(tripterelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑，醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)，依西美坦(exemestane)，福美坦(formestanie)，法倔唑(fadrozole)，伏氯唑(vorozole)，来曲唑(letrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)，依替膦酸盐(etidronate)，ne-58095或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如pkc-α，raf，h-ras和表皮生长因子受体(egfr)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；rmrh；lapatinibditosylate(erbb-2和egfr双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为gw572016)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括抗体，诸如阿仑珠单抗(alemtuzumab)(campath)，贝伐珠单抗(bevacizumab)(genentech)；西妥昔单抗(cetuximab)(imclone)；帕尼单抗(panitumumab)(amgen)，利妥昔单抗(rituximab)(genentech/biogenidec)，帕妥珠单抗(pertuzumab)(2c4，genentech)，曲妥珠单抗(trastuzumab)(genentech)，托西莫单抗(tositumomab)(bexxar，corixia)，和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)(wyeth)；具有作为与本发明化合物组合的药剂的治疗潜力的别的人源化单克隆抗体包括：阿泊珠单抗(apolizumab)，阿塞珠单抗(aselizumab)，巴匹珠单抗(bapineuzumab)，bivatuzumabmertansine，莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)，西利珠单抗(cedelizumab)，培舍珠单抗(certolizumabpegol)，依库珠单抗(eculizumab)，依法珠单抗(efalizumab)，依帕珠单抗(epratuzumab)，厄利珠单抗(erlizumab)，非维珠单抗(felvizumab)，芳妥珠单抗(fontolizumab)，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)，英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumabozogamicin)，伊匹木单抗(ipilimumab)，拉贝珠单抗(labetuzumab)，林妥珠单抗(lintuzumab)，马妥珠单抗(matuzumab)，美泊利单抗(mepolizumab)，莫维珠单抗(motavizumab)，motovizumab，那他珠单抗(natalizumab)，尼妥珠单抗(nimotuzumab)，nolovizumab，numavizumab，ocrelizumab，奥马珠单抗(omalizumab)，帕利珠单抗(palivizumab)，帕考珠单抗(pascolizumab)，pecfusituzumab，pectuzumab，培克珠单抗(pexelizumab)，ralivizumab，雷珠单抗(ranibizumab)，reslivizumab，瑞利珠单抗(reslizumab)，resyvizumab，罗维珠单抗(rovelizumab)，卢利珠单抗(ruplizumab)，西罗珠单抗(sibrotuzumab)，西利珠单抗(siplizumab)，索土珠单抗(sontuzumab)，tacatuzumabtetraxetan，tadocizumab，他利珠单抗(talizumab)，特非珠单抗(tefibazumab)，托珠单抗(tocilizumab)，托利珠单抗(toralizumab)，tucotuzumab西莫白介素(celmoleukin)，tucusituzumab，umavizumab，乌珠单抗(urtoxazumab)，优特克单抗(ustekinumab)，维西珠单抗(visilizumab)，和抗白介素-12(abt-874/j695，wyethresearchandabbottlaboratories)，其为经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白的重组专有人序列全长igg1λ抗体。化疗剂还包括“egfr抑制剂”，其指结合egfr或以其它方式直接与egfr相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物，其另外还称作“egfr拮抗剂”，此类药剂的例子包括结合egfr的抗体和小分子；结合egfr的抗体的例子包括mab579(atcccrlhb8506)，mab455(atcccrlhb8507)，mab225(atcccrl8508)，mab528(atcccrl8509)及其变体，诸如嵌合化的225(c225或西妥昔单抗；)和重构的人225(h225)；imc-11f8，一种完全人的egfr靶向抗体(imclone)；结合ii型突变体egfr的抗体；结合egfr的人源化和嵌合抗体；和结合egfr的人抗体，诸如abx-egf或帕尼单抗(panitumumab)，abgenix/amgen)；emd55900；emd7200(matuzumab)，一种针对egfr且与egf和tgf-α二者竞争egfr结合的人源化egfr抗体(emd/merck)；人egfr抗体，humax-egfr(genmab)；称作e1.1，e2.4，e2.5，e6.2，e6.4，e2.11，e6.3和e7.6.3且描述在us6，235，883中的完全人抗体；mdx-447(medarexinc)；和mab806或人源化mab806。抗egfr抗体可与细胞毒剂缀合，由此产生免疫缀合物。egfr拮抗剂包括小分子。具体的小分子egfr拮抗剂包括osi-774(cp-358774，厄洛替尼(erlotinib)，genentech/osipharmaceuticals)；pd183805(ci1033，2-丙烯酰胺，n-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，pfizerinc.)；zd1839，吉非替尼(gefitinib)4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，astrazeneca)；zm105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，zeneca)；bibx-1382(n8-(3-氯-4-氟-苯基)-n2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8-二胺，boehringeringelheim)；pki-166((r)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(r)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7h-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；cl-387785(n-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；ekb-569(n-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(wyeth)；ag1478(pfizer)；ag1571(su5271；pfizer)；双重egfr/her2酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼(lapatinib)(gsk572016或n-[3-氯4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。化疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括前一段中提到的egfr靶向药物；小分子her2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从takeda获得的tak165；cp-724，714，一种口服erbb2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(pfizer和osi)；优先结合egfr但抑制her2和egfr过表达细胞二者的双重her抑制剂，诸如ekb-569(可从wyeth获得)；拉帕替尼(lapatinib)(gsk572016；可从glaxo-smithkline获得)，一种口服her2和egfr酪氨酸激酶抑制剂；pki-166(可从novartis获得)；泛her抑制剂，诸如卡奈替尼(canertinib)(ci-1033；pharmacia)；raf-1抑制剂，诸如可从isispharmaceutica1s获得的，抑制raf-1信号传导的反义药剂isis-5132；非her靶向tk抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼(可从glaxosmithkline获得)；多靶向酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(sunitinib)(可从pfizer获得)；vegf受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如瓦他拉尼(vatalanib)；mapk胞外调控激酶i抑制剂ci-1040(可从pharmacia获得)；喹唑啉类，诸如pd153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如cgp59326，cgp60261和cgp62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯基氨基)-7h-吡咯并[2，3-d]嘧啶类；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4，5-双(4-氟苯胺基)-酞酰亚胺)；含有硝基噻吩模块的tyrphostine；pd-0183805(warner-lamber)；反义分子(例如那些与编码her的核酸结合的反义分子)；喹喔啉类(美国专利no.5，804，396)；tryphostinszd6474(astrazeneca)；ptk-787(novartis/scheringag)；泛her抑制剂，诸如ci-1033(pfizer)；affinitac(isis3521；isis/lilly)；甲磺酸伊马替尼pki166(novartis)；gw2016(glaxosmithkline)；ci-1033(pfizer)；ekb-569(wyeth)；semaxinib(pfizer)；zd6474(astrazeneca)；ptk-787(novartis/scheringag)；inc-1c11(imclone)，雷帕霉素。化疗剂还包括地塞米松(dexamethasone)，干扰素，秋水仙素(colchicine)，别嘌醇(allopurinol)，氨磷汀(amifostine)，三氧化二砷(arsenictrioxide)，天冬酰胺酶(asparaginase)，活的bcg，贝伐珠单抗(bevacuzimab)，贝沙罗汀(bexarotene)，克拉屈滨(cladribine)，里本灵(clofarabine)，darbepoetinalfa，地尼白介素(denileukin)，右雷佐生(dexrazoxane)，阿法依伯汀(epoetinalfa)，厄洛替尼(elotinib)，非格司亭(filgrastim)，醋酸组氨瑞林(histrelinacetate)，ibritumomab，干扰素α-2a，干扰素α-2b，lenalidomide，左旋咪唑(levamisole)，美司钠(mesna)，甲氧沙林(methoxsalen)，奥普瑞白介素(oprelvekin)，palifermin，帕米膦酸盐(pamidronate)，培加酶(pegademase)，培门冬酶(pegaspargase)，peg非格司亭(pegfilgrastim)，培美曲塞二钠(pemetrexeddisodium)，普卡霉素(plicamycin)，卟吩姆钠(porfimersodium)，喹纳克林(quinacrine)，拉布立酶(rasburicase)，沙格司亭(sargramostim)，替莫唑胺(temozolomide)，vm-26，6-tg，托瑞米芬(toremifene)，tretinoin，atra，戊柔比星(valrubicin)，唑来膦酸盐(zoledronate)，和唑来膦酸(zoledronicacid)，及其药学可接受盐。化疗剂还包括氢化可的松(hydrocortisone)，醋酸氢化可的松(hydrocortisoneacetate)，醋酸可的松(cortisoneacetate)，替可的松匹伐酯(tixocortolpivalate)，曲安奈德(triamcinoloneacetonide)，曲安西龙醇(triamcinolonealcohol)，莫米松(mometasone)，安西奈德(amcinonide)，布地奈德(budesonide)，地奈德(desonide)，fluocinonide，fluocinoloneacetonide，倍他米松(betamethasone)，倍他米松磷酸钠(betamethasonesodiumphosphate)，地塞米松(dexamethasone)，地塞米松磷酸钠(dexamethasonesodiumphosphate)，氟可龙(fluocortolone)，氢化可的松-17-丁酸盐(hydrocortisone-17-butyrate)，氢化可的松-17-戊酸盐(hydrocortisone-17-valerate)，aclometasonedipropionate，戊酸倍他米松(betamethasonevalerate)，二丙酸倍他米松(betamethasonedipropionate)，泼尼卡酯(prednicarbate)，氯倍他松-17-丁酸盐(clobetasone-17-butyrate)，氯倍他松-17-丙酸盐(clobetasol-17-propionate)，己酸氟考龙(fluocortolonecaproate)，特戊酸氟考龙(fluocortolonepivalate)和醋酸氟甲叉龙(fluprednideneacetate)；免疫选择性抗炎肽(imsaid)，诸如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(feg)及其d-异构体形式(feg)(imulanbiotherapeutics，llc)；抗风湿药物，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)，环孢素(ciclosporin)(环孢霉素(cyclosporine)a)，d-青霉胺，金盐，羟氯喹，肿瘤坏死因子α(tnfα)阻断剂，诸如英夫利昔单抗(infliximab)阿达木单抗(adalimumab)certolizumabpegolgolimumab白介素-1(il-1)阻断剂，诸如阿那白滞素(anakinra)t细胞共刺激阻断剂，诸如abatacept白介素-6(il-6)阻断剂，诸如tocilizumab白介素-13(il-13)阻断剂，诸如lebrikizumab；干扰素α(ifn)阻断剂，诸如rontalizumab；β7-整联蛋白阻断剂，诸如rhumabbeta7；ige途径阻断剂，诸如抗m1prime；分泌型同三聚lta3和膜结合型异三聚lta1/β2阻断剂，诸如抗淋巴毒素α(lta)；混杂调查性药剂，诸如thioplatin，ps-341，丁酸苯酯，et-18-och3，或法尼基转移酶抑制剂(l-739749，l-744832；多酚，诸如槲皮素(quercetin)，白藜芦醇(resveratrol)，piceatannol，没食子酸表没食子儿茶精(epigallocatechinegallate)，茶黄素(theaflavin)，黄烷醇(flavanol)，原花青素(procyanidins)，白桦脂酸(betulinicacid)及其衍生物；自噬抑制剂，诸如氯喹；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol))；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；乙酰喜树碱，二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)，依替膦酸钠(etidronate)ne-58095，唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)和表皮生长因子受体(egf-r)；哌立福辛(perifosine)，cox-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如ps341)；cci-779；tipifarnib(r11577)；orafenib，abt510；bcl-2抑制剂，诸如oblimersensodiumpixantrone；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(sch6636，sarasartm)；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合。生长抑制剂，指在体外或在体内抑制细胞(例如其生长依赖于pdl1表达的细胞)生长和/或增殖的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于s期的细胞百分比的药剂；生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于s期以外的位置)的药剂，诸如诱导g1停滞和m期停滞的药剂，经典的m期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))，紫杉烷类(taxanes)，和拓扑异构酶ii抑制剂诸如蒽环类抗生素多柔比星(doxorubicin)((8s-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-l-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮，即(8s-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-l-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)，那些阻滞g1的药剂也溢出进入s期停滞，例如dna烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)，泼尼松(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-c；紫杉烷类(帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药；衍生自欧洲紫杉的多西他赛是帕利他赛(bristol-myerssquibb)的半合成类似物，帕利他赛和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。pd-l1抗体制剂还可以包含一种以上活性成分，活性成分之间的活性应不受负面影响，还可以包括活性成分细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。pd-l1抗体制剂还可以将活性成分包埋在处于胶体药物递送系统中，如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米粒子和纳米胶囊，或大乳剂中的微囊中。pd-l1抗体制剂的不稳定性，可通过无毒的水溶性多价金属盐增强，如ca2+，mg2+，zn2+，fe2+，fe3+，cu2+，sn2+，sn4+，al2+和al3+等多价阳离子；或这些阳离子形成的水溶性的盐类的阴离子，如与无机酸和/或有机酸形成的阴离子。通常选用的水溶性多价金属盐包括：卤族的无机酸金属盐(如氯化锌、氯化钙)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；脂肪族羧酸金属盐，如乙酸钙、醋酸锌、丙酸钙、羟乙酸锌、乳酸钙、乳酸锌和酒石酸锌；和芳香族羧酸金属盐，苯甲酸盐(如，苯甲酸锌)和水杨酸盐。抗体变体如糖基化变体、fc区变体、经半胱氨酸工程化改造的抗体变体、免疫缀合物，糖基化变体，改变抗体以提高或降低抗体糖基化的程度，可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。本发明提供一种pd-l1抗体制剂的制备方法，具体步骤如下：将具有一定纯度的抗体活性成分与任选的药学上可接受的载体、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂及其他生物活性物质按照一定比例混合后保存备用。载体、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂及其他生物活性物质的剂量及浓度对患者或接受者是无害的，包括缓冲剂，抗氧化剂，如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素e、焦亚硫酸钠；防腐剂，等渗剂，稳定剂，金属复合物，如zn-蛋白质复合物；螯合剂如edta和/或非离子表面活性剂。第七方面，本发明提供一种如第六方面所述的组合物在制备用于靶向治疗的药物和/或试剂盒的应用，优选为制备通过拮抗经pd-l1的信号传导来增强t细胞功能障碍的病症的药物和/或试剂盒中的应用。优选地，所述t细胞功能障碍的病症包括癌症和良性肿瘤。优选地，所述癌症包括非小细肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿、梅克尔细胞癌、肝癌、肾癌、唾液腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、神经胶质瘤、上皮瘤或脑癌中的任意一种或至少两种的组合。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明提供了一种新的抗pd-l1抗体及其制备方法和应用，该抗pd-l1抗体或抗体片段具有新的氨基酸序列；该抗pd-l1抗体或抗体片段可通过计算机辅助设计，利用生物信息学建模模拟分析、设计抗体序列，无需经过复杂繁琐的免疫反应，抗体设计后通过分子生物学构建转入宿主细胞，在宿主细胞中表达后经纯化，即可得到目标具有pd-l1抗原结合活性的pd-l1抗体；(2)本发明提供的抗体设计、发现工艺简洁高效，耗时短，成本低，易于操作，便于推广和应用。附图说明图1为本发明表达的部分抗体的sds-page电泳结果图；图2为基于proteina的动力学曲线，其中图2(a)-图2(c)依次为抗体抗体ⅰ、抗体ⅱ和阳性对照抗体；图3为基于anti-humanfc片段的动力学曲线，其中图3(a)-图3(c)依次为抗体抗体ⅰ、抗体ⅱ和阳性对照抗体；图4为抗体ⅰ、抗体ⅱ与阳性对照抗体对抗原表位的竞争结合曲线图，其中图4(a)为竞争结合曲线图，图4(b)为图4(a)的局部放大图；图5为人pd-l1抗原与生物感应器的结合动力学曲线，其中图5(a)nta生物传感器结合动力学曲线图(antigenbindingtontasensor)，图5(b)为his生物传感器结合动力学曲线图(antigenbindingtohissensor)。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1抗体设计抗体经过生物信息学分析设计，具体步骤如下：1、抗原结构构建：通过把目标抗原蛋白质链与蛋白质序列数据库(proteindatabank：pdb)中的蛋白质链进行多序列比对获得的，生成多序列比对的数据和索引文件，调用序列比对程序把目标蛋白质链的氨基酸序列与数据库中的蛋白质链进行多序列比对，确定蛋白序列的同源区域；2、抗体结构构建：通过未知结构序列与已知三维结构抗体的比对，通过同源模建方法，使用modeller软件构建抗体的初始模型，产生优化的抗体同源模型，再使用rosetta软件优化模型，进行loop区模建及基于结构的比对并构建抗体结构模型，为了验证模型结果，计算z-score分布图和ramachandran图，保证蛋白的大部分氨基酸落在ramachandran图的可允许区。3、抗原、抗体结构优化：(1)模拟体系赋力场参数；(2)初始结构检查及预处理；(3)初始结构能量最小化；通过gromacs4.5.7软件给模拟体系赋力场参数，初始结构检查及预处理、初始结构能量最小化；具体方法为通过propka程序设定接近生理环境(ph＝7.4)的蛋白质质子化状态，添加dppc、tip3p水模型、中和离子和0.15mol/l的kcl后，进行能量最小化后，得到水相优化的抗体结构，进一步可以根据步骤2的方法进行拉式图评估等，确定抗体结构的合理性。4、抗原、抗体对接结合遗传算法搜索构象并优化。首先确定抗原表位，将抗体和抗原进行对接找到最佳抗原抗体结合模式后，依据抗原表位与抗体分子的距离匹配原则，计算结合模式和亲和力，并对计算结果进行打分，评判抗原和抗体的结合程度，得到最优目标抗体序列；通过zdock软件，进行刚性分子对接，使用ace统计势能，结构互补和静电构成的打分函数对抗原和抗体的亲和力进行评估，结合抗原表位的信息，得到最优抗体序列。设计出的一系列抗体序列，抗体可变区(fv)由fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4组成，最终设计出两类抗体，分别为抗体ⅰ、抗体ⅱ，见表1和表2；经过计算机辅助设计，生物信息学建模分析，设计抗体结构，设计一系列抗体序列，抗体可变区由fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4组成，设计出两类抗体：抗体ⅰ、抗体ⅱ，抗体ⅰ、抗体ⅱ、阳性对照的部分氨基酸序列分别包含表1、表2、表3中氨基酸序列；抗体ⅰ、抗体ⅱ及阳性对照抗体的恒定部分氨基酸序列见表4；抗体ⅰ、抗体ⅱ的fr区序列见表5。表1表2表3表4表5依据此方法共设计2类抗体，分别为抗体ⅰ、抗体ⅱ。本文中所述“阳性对照”抗体是指豪夫迈·罗氏有限公司(f.hoffmann-larocheltd)公开的抗pd-l1抗体，阳性对照抗体轻链可变部分序列、重链可变部分序列分别如表3中seqidno.105与seqidno.106所示，轻链、重链恒定部分序列分别如表4中seqidno.143、seqidno.144所示。实施例2候选抗体在哺乳动物中的表达采用常规人工dna合成方法，合成设计出的一系列抗体(抗体ⅰ、抗体ⅱ)、阳性对照抗体的氨基酸序列对应的dna。以hek293(或cho细胞)为宿主细胞，以氨苄抗性的ptt5质粒作为载体，将设计的一系列(抗体ⅰ、抗体ⅱ)抗体的dna连接入载体，并将阳性对照抗体对应的dna连接入载体，完成表达载体构建，构建好的载体经基因测序确定构建正确的载体；将正确构建的载体(包括阳性对照)经瞬时或稳定转染，分别转染至hek293细胞(或cho细胞)，温育7天，初步分离收集并过滤上清液中表达的候选抗体。设计出的一系列(抗体ⅰ、抗体ⅱ)抗体经过表达，最终得到一系列候选抗体(抗体ⅰ、抗体ⅱ)以及阳性对照抗体。候选抗体表达采用的工艺步骤为抗体在哺乳动物细胞中表达的常规方法工艺。实施例3候选抗体分离纯化候选抗体(抗体ⅰ、抗体ⅱ)及阳性对照在宿主细胞中表达，经初步分离收集上清液中表达的抗体。将收集到的上清液经proteina磁珠分离纯化，再经sds-page电泳检测，每个候选抗体经sds-page分离后，分别在约70kda、30kda处得到2条清晰的电泳条带，可以初步判定抗体重链与轻链的表达。部分抗体(抗体ⅰ、抗体ⅱ)与阳性对照抗体的sds-page电泳图见图1，其中，自左向右，第一泳道为抗体ⅰ，第二泳道为抗体ⅱ，第三泳道为阳性对照，抗体ⅰ样品为抗体ⅰ-hx-2，抗体ⅱ样品为为抗体ⅱ-hx-15，最终得到纯度大于95％的抗体ⅰ、抗体ⅱ。候选抗体纯化采用的工艺步骤为常规方法工艺。实施例4候选抗体亲和力测定为了确定候选抗体与抗原的结合亲和力，采用生物膜干涉技术(fortebiooctet系统)开展抗原抗体亲和力测定实验，经定性分析确定抗原抗体结合常数、解离常数和亲和常数。阳性对照抗体为实施例1中所述的阳性对照抗体；人pd-l1抗原(购自北京义翘神州科技有限公司，即sinobiologicalinc，目录号#10084-h08h-100)；取经分离纯化的抗体ⅰ、抗体ⅱ样品，检测抗体抗体ⅰ、抗体ⅱ及阳性对照与人pd-l1的亲和力。(1)基于proteina的结合动力学测试采用proteina结合候选抗体ⅰ样品、候选抗体ⅱ样品、阳性对照抗体，形成proteina-候选抗体ⅰ样品、proteina-候选抗体ⅱ样品、proteina-阳性对照抗体复合物，加入人pd-l1抗原，通过fortebiooctet平台测定结合动力学曲线。通过测试结果可知，随着proteina-候选抗体与抗原不断结合，干涉光谱曲线向波长增加的方向移动，最终趋于稳定，候选抗体ⅰ样品、候选抗体ⅱ样品与人pd-l1抗原均有很强的结合活性。候选抗体ⅰ样品测试结果见图2(a)，候选抗体ⅱ样品测试结果见图2(b)、阳性对照抗体测试结果见图2(c)。图2中，每张图中有3条曲线，代表3个不同浓度，其中，抗体ⅰ样品选取抗体ⅰ-hx-2；抗体ⅱ样品选取抗体ⅱ-hx-15。(2)基于anti-humanfc的结合动力学测试采用anti-humanfc片段结合候选抗体ⅰ样品、候选抗体ⅱ样品、阳性对照抗体，形成anti-humanfc片段-候选抗体ⅰ样品、anti-humanfc片段-候选抗体ⅱ样品、anti-humanfc片段-阳性对照抗体复合物，加入人pd-l1抗原后，通过fortebiooctet平台测定结合动力学曲线。通过测试结果可知，随着anti-humanfc片段-候选抗体ⅰ样品、anti-humanfc片段-候选抗体ⅱ样品、anti-humanfc片段-阳性对照抗体分别与人pd-l1抗原不断结合，检测到的干涉光谱曲线向波长增加的方向移动。候选抗体ⅰ样品、候选抗体ⅱ样品、阳性对照抗体的检测结果分别见图3(a)、图3(b)、图3(c)，其中，抗体ⅰ样品选取抗体ⅰ-hx-2；抗体ⅱ样品选取抗体ⅱ-hx-15。通过测定的上述的动力学曲线，得到动力学常数，抗体ⅰ与人pd-l1抗原结合的的动力学常数如表6所示，抗体ⅱ人pd-l1抗原结合的动力学常数如表7所示。表6通过表6可知，抗体ⅰ经过亲和力测试，得到的抗体ⅰ的kd值在2.91×10-11～4.59×10-10之间，说明抗体ⅰ与人pd-l1抗原具有很强的亲和力，其中抗体ⅰ-hx-2与人pd-l1抗原的亲和力最强，其平衡解离常数为2.91×10-11，其与阳性对照的平衡解离常数非常接近。表7通过表7可知，抗体ⅱ经亲和力测试，得到的抗体ⅱ的平衡解离常数在1.49×10-10～3.71×10-9之间，说明抗体ⅱ样品与人pd-l1抗原也有较强的亲和力，其中，抗体ⅱ-hx-15的平衡解离常数为1.49×10-10，测试样品中抗体ⅱ-hx-15与人pd-l1的结合亲和力较强。上述表6、表7中，抗体ⅰ、抗体ⅱ各检测样品对应的氨基酸序列分别如表8、表9所示。表8抗体ⅰ轻链可变区重链可变区轻链恒定区重链恒定区抗体ⅰ-hx-1seqidno.107seqidno.115seqidno.143seqidno.144抗体ⅰ-hx-2seqidno.108seqidno.116seqidno.143seqidno.144抗体ⅰ-hx-3seqidno.109seqidno.117seqidno.143seqidno.144抗体ⅰ-hx-4seqidno.110seqidno.118seqidno.143seqidno.144抗体ⅰ-hx-5seqidno.111seqidno.119seqidno.143seqidno.144抗体ⅰ-hx-6seqidno.112seqidno.120seqidno.143seqidno.144抗体ⅰ-hx-7seqidno.113seqidno.121seqidno.143seqidno.144抗体ⅰ-hx-8seqidno.114seqidno.122seqidno.143seqidno.144阳性对照抗体seqidno.105seqidno.106seqidno.143seqidno.144表9抗体ⅱ轻链可变区重链可变区轻链恒定区重链恒定区抗体ⅱ-hx-10seqidno123seqidno133seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-11seqidno124seqidno134seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-12seqidno125seqidno135seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-13seqidno126seqidno136seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-14seqidno127seqidno137seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-15seqidno128seqidno138seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-16seqidno129seqidno139seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-17seqidno130seqidno140seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-18seqidno131seqidno141seqidno.143seqidno.144抗体ⅱ-hx-19seqidno132seqidno142seqidno.143seqidno.144阳性对照抗体seqidno.105seqidno.106seqidno.143seqidno.144实施例5pd-l1抗原表位结合竞争实验为了分析确定抗体ⅰ、抗体ⅱ与抗原的结合表位，采用生物膜干涉技术(fortebiooctet系统)开展抗原表位分析实验。阳性对照抗体，其氨基酸序列见表7或表8中阳性对照抗体序列；人pd-l1抗原(购自北京义翘神州科技有限公司，即sinobiologicalinc，目录号#10084-h08h-100)；抗体ⅰ样品选取抗体ⅰ-hx-2；抗体ⅱ样品选取抗体ⅱ-hx-15。采用生物膜干涉技术(fortebiooctet系统平台)，对候选抗体ⅰ、候选抗体ⅱ与阳性对照抗体开展抗原表位结合竞争实验。测试结果见图4(a)、图4(b)其中图4(b)为图4(a)局部放大图。由测试结果图分析如下：由图4(a)可知：0-360s阶段，活化阶段，加入缓冲液，形成基线；360-960s阶段，抗体装载阶段，加入抗体ⅰ、抗体ⅱ、阳性对照抗体，随着结合到生物传感器生物膜上的抗体分子不断增多，生物膜层厚度不断增加，干涉光谱曲线向波长增加的方向移动；960-1260s阶段，抗体解离阶段，加入缓冲液，有一部分结合到生物传感器生物膜上的抗体因结合力较弱被缓冲液带走，干涉光谱曲线向波长减小的方向移动，未被缓冲液带走的抗体与生物传感器结合力较强；1260-1320s阶段，抗体与生物膜结合达到稳定，形成稳定的结合曲线；1320-1580s阶段，抗体与抗原结合阶段，加入人pd-l1抗原，由于抗体ⅰ、抗体ⅱ、阳性对照抗体与人pd-l1抗原均有很强结合亲和力，随着时间的推移结合到抗体ⅰ、抗体ⅱ、阳性对照抗体上的抗原不断增多，干涉光谱曲线向波长增加的方向移动，最终趋于稳定；1580s及其以后阶段，为抗原表位竞争结合阶段，向各体系中分别加入阳性对照抗体，抗体ⅰ(见图4线a5)及阳性对照抗体(见图4线c5)的干涉光谱曲线波长不变，说明抗体ⅰ与阳性对照抗体未发生结合竞争抗原表位，即加入的阳性对照抗体与抗体ⅰ具有相同的抗原结合表位；加入阳性对照抗体后，抗体ⅱ的干涉光谱曲线随着阳性对照抗体的加入向波长增加的方向移动(见图4线b5)，说明新加入的阳性对照抗体与候选抗体ⅱ的上的抗原有结合，即阳性对照抗体能够与抗体ⅱ-抗原上的其他抗原表位结合，从而导致干涉光谱曲线波长增加，进一步说明抗体ⅱ与阳性对照抗体具有不同的抗原结合表位。为排除生物膜与抗原的结合对实验造成干扰，测定人pd-l1抗原与fortebiooctet平台的anti-his、nta生物传感器的结合能力，结果如图5(a)和图5(b)所示；由图5(a)和图5(b)可以看出，抗原与his、nta生物传感器均无结合能力，从而排除生物传感器与抗原结合对实验测定结果的干扰。综上所述，本发明提供一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用，通过生物信息学建模模拟分析、设计抗体序列，无需经过复杂繁琐的免疫反应，抗体设计出后通过分子生物学构建转入宿主细胞，在宿主细胞中表达后经纯化即可得到所述抗体ⅰ、抗体ⅱ，该方法高效、便捷；且抗体ⅱ与阳性对照抗体具有不同的结合表位，抗体ⅰ、抗体ⅱ有巨大的市场价值和应用前景。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。序列表<110>苏州泓迅生物科技股份有限公司<120>一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用<130>2018<141>2018-09-17<160>144<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>prt<213>人工合成()<400>1aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaser2025<210>2<211>17<212>prt<213>人工合成()<400>2leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile151015tyr<210>3<211>36<212>prt<213>人工合成()<400>3serleuaspserglyvalprolysargpheserglyserargsergly151015serasptyrserleuthrileserserleuglnprogluasppheala202530thrtyrtyrcys35<210>4<211>10<212>prt<213>人工合成()<400>4pheglyglnglythrlysleugluilelys1510<210>5<211>24<212>prt<213>人工合成()<400>5valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaser20<210>6<211>17<212>prt<213>人工合成()<400>6methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly151015ala<210>7<211>38<212>prt<213>人工合成()<400>7sertyrasnglnlysphelysglyargvalthrilethralavalthr151015seralaserthralatyrmetgluleuserserleuargsergluasp202530thralavaltyrtyrcys35<210>8<211>10<212>prt<213>人工合成()<400>8trpglyglnglythrleuvalthrvalser1510<210>9<211>22<212>prt<213>人工合成()<400>9thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaser20<210>10<211>17<212>prt<213>人工合成()<400>10methistrppheglnglnlysproglylysserprolysleutrpile151015tyr<210>11<211>36<212>prt<213>人工合成()<400>11asnleualaserglyvalproalaargpheserglyserglysergly151015thrsertyrserleuthrileserserleuglnprogluasppheala202530thrtyrtyrcys35<210>12<211>10<212>prt<213>人工合成()<400>12pheglyglnglythrlysleugluilelys1510<210>13<211>24<212>prt<213>人工合成()<400>13valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaser20<210>14<211>17<212>prt<213>人工合成()<400>14methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly151015tyr<210>15<211>38<212>prt<213>人工合成()<400>15lystyrasnglulysphelysglyargvalthrilethrserasplys151015seralaserthralatyrmetgluleuserserleuargsergluasp202530thralavaltyrtyrcys35<210>16<211>10<212>prt<213>人工合成()<400>16trpglyglnglythrleuvalthrvalser1510<210>17<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>17glnaspleuglyasnthr15<210>18<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>18glnasnileglyglnthr15<210>19<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>19glnasnilealaasnthr15<210>20<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>20glnaspvalglyglnthr15<210>21<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>21glngluileglyglnthr15<210>22<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>22glnasnglyileasnthr15<210>23<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>23glnaspileglyasnthr15<210>24<211>6<212>prt<213>人工合成()<400>24glngluileglyglnthr15<210>25<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>25alathrser1<210>26<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>26alaserser1<210>27<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>27glythrser1<210>28<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>28serthrser1<210>29<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>29valserser1<210>30<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>30valthrser1<210>31<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>31leuglntyralasertyrprophethr15<210>32<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>32leutyrphealaserserprophethr15<210>33<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>33leuglntyralaserserprophethr15<210>34<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>34leutyrtyralasertyrphephethr15<210>35<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>35leuglntyralaserserphephethr15<210>36<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>36leuasntyrileserserprophethr15<210>37<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>37leuglntyralaserthrphephethr15<210>38<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>38leutyrtyralaserthrprophethr15<210>39<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>39glytyrthrphethrsertyrtrp15<210>40<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>40glytyrsertyrtyrphetyrtrp15<210>41<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>41glytyrserphesersertyrtrp15<210>42<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>42glytyrthrtyrtyrphetyrtrp15<210>43<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>43glytyrserphethrthrtyrtrp15<210>44<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>44glytyrserphethrsertyrtrp15<210>45<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>45glytyrthrtyrasnphetyrtrp15<210>46<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>46iletyrproglyasnseraspthr15<210>47<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>47iletyrhisglyasnsergluthr15<210>48<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>48iletyrprovalhissergluthr15<210>49<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>49iletyrhisvalglnseraspthr15<210>50<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>50iletyrproglyglnsergluthr15<210>51<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>51iletyrtrpalahissergluthr15<210>52<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>52iletyrhisileasnseraspthr15<210>53<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>53thrargtrpglygluglytyrtyrhisalametasnhis1510<210>54<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>54thrhistrpalaaspalatyrphehisglymetasnhis1510<210>55<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>55thrhistrpleugluvaltyrphehisglymetasphis1510<210>56<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>56thrargtrpalagluleuphephehisalametasphis1510<210>57<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>57thrargtrpglyaspglytyrtyrhisalametasphis1510<210>58<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>58thrargtrpleuaspalaphetyrhisvalmetasphis1510<210>59<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>59thrhistrpvalgluvalphetyrhisalametgluhis1510<210>60<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>60thrhistrpileaspglytyrphehisvalmetasphis1510<210>61<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>61thrhistrpalagluglytyrtyrhisalametgluhis1510<210>62<211>13<212>prt<213>人工合成()<400>62thrhistrpileglualaphephehisleumetglnhis1510<210>63<211>5<212>prt<213>人工合成()<400>63serservalsertyr15<210>64<211>5<212>prt<213>人工合成()<400>64serthrvaltyrtyr15<210>65<211>5<212>prt<213>人工合成()<400>65serserglytyrtyr15<210>66<211>5<212>prt<213>人工合成()<400>66serseralasertyr15<210>67<211>5<212>prt<213>人工合成()<400>67serthrilethrtyr15<210>68<211>5<212>prt<213>人工合成()<400>68serserilesertyr15<210>69<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>69sertyrser1<210>70<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>70serthrser1<210>71<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>71thrthrser1<210>72<211>3<212>prt<213>人工合成()<400>72tyrthrser1<210>73<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>73glnglnargserserpheprotyrthr15<210>74<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>74glnasnargtyrsertyrprotyrthr15<210>75<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>75glnglnargsersertyrhistyrthr15<210>76<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>76glnasnargthrserphehistyrthr15<210>77<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>77glntyrargphesertyrtrptyrthr15<210>78<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>78glntyrargthrsertyrprotyrthr15<210>79<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>79glnglnargsersertyrprotyrthr15<210>80<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>80glnglnargpheserphehistyrthr15<210>81<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>81glntyrargsersertyrtrptyrthr15<210>82<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>82glytyrserthrserserpheval15<210>83<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>83glytyrtyrthrserserproval15<210>84<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>84glytyrtyrthrthrsertyrval15<210>85<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>85glytyrserphethrsertyrval15<210>86<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>86glytyrthrphethrsertyrval15<210>87<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>87glytyrphetyrthrsertyrval15<210>88<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>88glytyrphepheserserpheval15<210>89<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>89ileasntyrtyrasnaspalathr15<210>90<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>90ileasntyrphetyraspglythr15<210>91<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>91ileasnprotyrasnaspglythr15<210>92<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>92ileasntyrtyrasnaspalathr15<210>93<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>93ileasnhispheglnaspalathr15<210>94<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>94ileasnpropheglnaspilethr15<210>95<211>8<212>prt<213>人工合成()<400>95ileasnprotyrtyraspglythr15<210>96<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>96alatrpserglyalailepheglutyr15<210>97<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>97alaargserileglyilethrasptyr15<210>98<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>98alalysseralailealapheglutyr15<210>99<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>99alalysserglyglyileserasptyr15<210>100<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>100alatrpseralaalaleuserglutyr15<210>101<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>101alaargservalglyilethrasptyr15<210>102<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>102alaargseralaalaleuserglutyr15<210>103<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>103alaargserglyglyilepheasptyr15<210>104<211>9<212>prt<213>人工合成()<400>104alalysserleuvalglyserglutyr15<210>105<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>105aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalserthrala202530valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrseralaserpheleutyrserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrleutyrhisproala859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>106<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>106gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheseraspser202530trpilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alatrpileserprotyrglyglyserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargarghistrpproglyglypheasptyrtrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserser115<210>107<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>107aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspleuglyasnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyralaserserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleutyrtyralaserthrprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>108<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>108aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspileglyasnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyralathrserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleuglntyralaserserprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>109<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>109aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnasnilealaasnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyrvalserserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleutyrtyralasertyrphephe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>110<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>110aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglngluileglyglnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyrvalthrserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleutyrphealaserserprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>111<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>111aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnasnglyileasnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyrvalthrserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleutyrtyralasertyrphephe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>112<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>112aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglngluileglyglnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyrglythrserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleuasntyrileserserprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>113<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>113aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglngluileglyglnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyralathrserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleutyrtyralaserthrprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>114<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>114aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnasnileglyglnthr202530leuasntrpleuglnglnlysproglylysalailelysargleuile354045tyrserthrserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysleuglntyralaserserprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>115<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>115valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrsertyrtyrphetyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrhisileasnseraspthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095argtrpglygluglytyrtyrhisalametasnhistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>116<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>116valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrserphethrsertyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrproglyasnseraspthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095argtrpglyaspglytyrtyrhisalametasphistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>117<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>117valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrthrtyrtyrphetyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrhisglyasnsergluthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095histrpalaaspalatyrphehisglymetasnhistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>118<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>118valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrthrtyrasnphetyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrhisvalglnseraspthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095histrpleugluvaltyrphehisglymetasphistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>119<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>119valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrtrpalahissergluthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095histrpleugluvaltyrphehisglymetasphistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>120<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>120valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrserphesersertyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrproglyglnsergluthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095histrpileaspglytyrphehisvalmetasphistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>121<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>121valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrserphethrthrtyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrtrpalahissergluthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095argtrpglyaspglytyrtyrhisalametasphistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>122<211>118<212>prt<213>人工合成()<400>122valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrserphethrthrtyrtrp202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045alailetyrprovalhissergluthrsertyrasnglnlysphelys505560glyargvalthrilethralavalthrseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthr859095histrpileglualaphephehisleumetglnhistrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>123<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>123thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserservalsertyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrsertyrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglnasnargthrserphehistyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>124<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>124thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserthrvaltyrtyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrserthrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglntyrargsersertyrtrptyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>125<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>125thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserservaltyrtyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrsertyrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglntyrargsersertyrprotyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>126<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>126thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserserilesertyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrserthrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglnglnargserserpheprotyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>127<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>127thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserthrilethrtyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrtyrthrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglnasnargthrserphehistyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>128<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>128thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserservalsertyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrserthrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglnglnargsersertyrprotyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>129<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>129thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserservalsertyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrserthrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglnasnargtyrsertyrprotyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>130<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>130thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserthrvaltyrtyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrsertyrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglnglnargsersertyrhistyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>131<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>131thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserseralasertyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrsertyrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglntyrargthrsertyrprotyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>132<211>102<212>prt<213>人工合成()<400>132thrglnserproserpheleuseralaservalglyaspargvalthr151015ilethrcysseralaserserserglytyrtyrmethistrpphegln202530glnlysproglylysserprolysleutrpiletyrthrthrserasn354045leualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythr505560sertyrserleuthrileserserleuglnprogluaspphealathr65707580tyrtyrcysglnglnargsersertyrprotyrthrpheglyglngly859095thrlysleugluilelys100<210>133<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>133valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrserthrserserpheval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasntyrtyrasnaspalathrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095trpserglyalailepheglutyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>134<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>134valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrtyrthrserserproval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasntyrphetyraspglythrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095lysseralailealapheglutyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>135<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>135valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrtyrthrthrsertyrval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasnprotyrtyraspglythrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095argserglyglyilepheasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>136<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>136valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrserphethrsertyrval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095argserileglyilethrasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>137<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>137valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrphepheserserpheval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasntyrtyrasnaspalathrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095argseralaalaleuserglutyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>138<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>138valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095trpserglyalailepheglutyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>139<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>139valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrphetyrthrsertyrval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasnpropheglnaspilethrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095trpseralaalaleuserglutyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>140<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>140valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrphepheserserpheval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasnhispheglnaspalathrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095argservalglyilethrasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>141<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>141valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrtyrthrserserproval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095lysserglyglyileserasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>142<211>114<212>prt<213>人工合成()<400>142valglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaser151015vallysvalsercyslysalaserglytyrtyrthrthrsertyrval202530methistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetgly354045tyrileasnhispheglnaspalathrlystyrasnglulysphelys505560glyargvalthrilethrserasplysseralaserthralatyrmet65707580gluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysala859095trpserglyalailepheglutyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valser<210>143<211>107<212>prt<213>人工合成()<400>143argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu151015glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe202530tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln354045serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser505560thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu65707580lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser859095provalthrlysserpheasnargglyglucys100105<210>144<211>328<212>prt<213>人工合成()<400>144seralaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysser151015argserthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasp202530tyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthr354045serglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyr505560serleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrlys65707580thrtyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasp859095lysargvalgluserlystyrglyproprocysproprocysproala100105110proglupheleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro115120125lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval130135140valaspvalserglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrval145150155160aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln165170175pheasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln180185190asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysgly195200205leuproserserileglulysthrileserlysalalysglyglnpro210215220arggluproglnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthr225230235240lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser245250255aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr260265270lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr275280285serargleuthrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphe290295300sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys305310315320serleuserleuserleuglylys325当前第1页12