一种从废弃烟叶中超声逆流和膜分离浓缩提取富集绿原酸的方法与流程

本发明涉及一种从废弃烟叶中超声逆流和膜分离浓缩提取富集绿原酸的方法，应用于废弃烟叶的绿原酸提取和茄尼醇的提取前对废弃烟叶的预处理，属于烟草化学领域。

背景技术：

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，又名3-咖啡酰奎尼酸，化学名3-o-咖啡酰奎尼酸，是植物体在有氧呼吸过中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸具有较强的药理活性，研究表明它对消化系统、血液系统均有药理作用，具有广泛的抗菌消炎、利胆、止血及增高白血球数量的作用。现在，在有的药品制剂中已经将其作为质量控制的指标之一。绿原酸不仅在医药工业，而且在食品、日用化工也有广泛的应用，是国际公认的“植物黄金”。从杜仲叶和二花叶中提取绿原酸，工艺十分成熟，但从烟叶中提取只有实验室工艺，少见工业化生产报道，烟叶原料中绿原酸的含量大于3％，在分离茄尼醇的前工序过程中获得，足见其生产成本更低。但由于绿原酸不耐高温和对酸碱的敏感以及液体浓缩过程长期受热导致绿原酸成分的破坏和结构变异，再加上烟草种成分复杂，影响绿原酸的分离和纯化，所以工业化生产茄尼醇时候，很少从烟叶中提取绿原酸，造成废弃烟叶的资源浪费。

超声逆流提取技术是利用超声波具有的机械效应、空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分。超声波还可以产生许多次级效应，如乳化、扩散、击碎、化学效应等，这些作用也促进了植物体中有效成分的溶解，促使目标有效成分进入介质，并于介质充分混合，加快了提取过程的进行，并提高了目标有效成分的提取率。超声逆流提取技术适用于植物有效成份的萃取，与传统水煮、醇回流提取工艺相比，超声波萃取具有如下突出特点：

1、无需高温。在40℃-50℃水温超声波强化萃取，无高温，不破坏中药材中某些具有热不稳定，易水解或氧化特性的药效成份；

2、常压萃取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便；

3、超声波能促使植物细胞破壁，萃取效率高，提取时间短；

4、提取溶液的量比传统减少50-60％，减少了溶液的浓缩量，也即大大缩短了热敏感成分的受热时间；

5、大型工业化装备成熟。

膜分离以及浓缩技术是在20世纪初出现，20世纪60年代后迅速崛起的一门分离新技术。膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、分子级过滤及过滤过程简单、易于控制等特征，因此，已广泛应用于食品、医药、生物、环保、化工、冶金、能源、石油、水处理、电子、仿生等领域，产生了巨大的经济效益和社会效益，已成为当今分离科学中最重要的手段之一。膜分离以及浓缩技术与传统浓缩相比具有以下特点：

1、在常温下进行，有效成分损失极少，特别适用于热敏性物质，如抗生素等医药、果汁、酶、蛋白的分离与浓缩；

2、无相态变化，回收的溶剂可直接重复使用；

3、无化学变化，典型的物理分离过程，直接除去大分子成分，有效成分富集度高；

4、选择性好，可在分子级别内进行物质分离，具有普通滤材无法取代的卓越性能；

5、适应性强，处理规模可大可小，可以连续也可以间隙进行，工艺简单，操作方便，易于自动化；

6、能耗低，其费用约为蒸发浓缩或冷冻浓缩的1/3-1/8；

7、适合工业化大生产。

烟草废弃物现状：我国烟草植物的种植面积和产量均居世界首位，烟草种植与产品加工在国民经济发展中发挥着重要的作用，烟草在我国农产品收入中，仅次于稻、麦、棉、大豆、玉米，居第六位。目前国内外种植的烟草主要用作卷烟。作为烟草生产大国，我国每年烟叶产量500万吨，其中约有近25％的烟叶、烟未等下脚料被废弃，不能用于卷烟生产。若对这些烟草进行资源化利用，不仅可以获得符合绿色卫生标准的天然化工原料，为企业挖潜改造提供可持续发展的契机，也可以减轻废弃烟草对土质和土壤结构改变的可能危害性，避免其中有害成分对地下水的污染。因此，加强废弃烟草的综合利用不但可以使这部分废物变为宝贵的资源，也能提高烟农的经济收入，更符合国家固体废弃物“资源化”的方针。绿原酸是重要的生理活性物质，烟草是最有潜力替代金银花、杜仲叶等生产绿原酸的生物质资源。

公开号cn103739491a的中国专利介绍了一种富集烟草中绿原酸的方法，该方法是利用溶剂浮选技术分离富集烟草中绿原酸，加入混合有机溶剂作为萃取剂，改变萃取剂的极性，提高了绿原酸萃取率。

公开号cn1244539c的中国专利介绍了烟草作为制备绿原酸原料的应用及用烟草制备绿原酸的方法，将烟草作为原料制备绿原酸的方法包括以下过程：微波或超声波方法处理下用有机溶剂对原料进行浸提，经固液分离后所得液体即为粗制绿原酸产品。根据对产品品质的不同需要，还可将绿原酸粗产品进一步浓缩得到浓度较高的绿原酸产品，还可再经分离纯化得到精制的绿原酸产品。

公开号cn103204765a中国专利介绍了一种从废次烟叶中提取茄尼醇和绿原酸的方法，将废次烟叶于35℃～40℃用90～97％的乙醇水溶液回流提取后采用陶瓷膜过滤；(2)将提取液于38℃～42℃下减压浓缩得到干燥物；(3)干燥物用水溶解陶瓷膜过滤处理，滤液减压浓缩得到浓缩液，滤渣备用；(4)滤渣采用乙酸乙酯溶解，陶瓷膜过滤，上硅胶柱层析分离，用无水乙醇洗脱；洗脱液经浓缩至后结晶得到茄尼醇；(5)(3)步所得浓缩液上大孔树脂层析分离，采用55～65％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液经浓缩后将ph值调至3-3.5，结晶即得。

公开号cn1746149的中国专利介绍了一种由金银花粗提物制备高纯度绿原酸的方法：将金银花粗提物用去离子水溶解、充分搅拌，配制成金银花粗提物的水溶液，再加入乙醇进行醇沉，再过滤；将过滤液加热蒸去乙醇，剩余溶液将ph值调节至1～4，然后用含乙酸乙酯的混合溶剂进行多级逆流萃取；合并萃取液并浓缩回收乙酸乙酯，得到浓缩液s1；将浓缩液s1加水配制成水相；柱析步骤：将上述水相流过层析柱，随后用洗脱液进行洗脱，分段收集解吸液；将分段收集到的解吸液浓缩、结晶、干燥后得到绿原酸含量50～92％的产品。

公开号cn106496034a的中国专利介绍了一种同时从烟叶中提取分离绿原酸和芸香苷的方法，称取过60目筛的烟叶粉末样品200g，以料液比1∶20溶解于水中，温度50℃，搅拌提取120min。收集滤液用石油醚萃取除脂溶性杂质，即得绿原酸、芸香苷提取液。提取液上柱进行绿原酸及芸香苷的柱层析分离，先用5倍提取液体积的水洗脱，直至洗脱液中无糖检测出。用水洗脱后，改换洗脱液为不同浓度的乙醇梯度洗脱。分别收集10-15％浓度的乙醇洗脱液和30-40％浓度的乙醇洗脱液得到绿原酸溶液和芸香苷溶液。

公开号cn107602390a的中国专利介绍了一种从烟叶中提取绿原酸和东莨菪素的方法，烟叶原料经石油醚提取、过滤、减压蒸干得浸膏、乙酸乙酯萃取得萃取液，滤渣加水和乙醇提取、过滤得滤液经乙酸乙酯萃取，减压浓缩得萃取液，萃取液合并、上80～100目的硅胶柱，分别用水和乙酸乙酯进行洗脱，减压浓缩、结晶与重结晶，得绿原酸产品和东莨菪素产品，滤渣经150～180℃炭化，制粒得炭化物，可直接用于吸附剂使用。

公开号cn106117056a的中国专利介绍了一种从烟草废料中提取绿原酸的制备方法，本发明主要是以烟草废料为主要原料，利用无水乙醇对其进行超声萃取，得到滤液和滤渣，将滤渣进行酶解，得到烟草废料酶解液，将其进行分离，得到的上清液与滤液混合后，并利用co2超临界萃取，得到多酚类化合物溶液，最后利用液氮对其降温提取，即可得到绿原酸。本发明主要利用液氮冷冻提取，避免了绿原酸大量损失，提高了其提取率，提取率达到97％以上；且提取的绿原酸纯度较高，达到98％以上。

公开号cn104086425a的中国专利介绍了一种同时提取并分离烟草绿原酸、茄尼醇、生物碱、芸香苷的方法，其步骤包括：步骤一、同时提取：将烟草原料粉碎，温度40～50℃，超声频率45khz，料液比10∶1条件下，用80％乙醇提取一次，抽滤或离心后，残渣再分别用80％、95％的乙醇各提取一次；三次提取液合并，获得烟草绿原酸、茄尼醇、烟碱、芸香苷的粗提液，烟草绿原酸、茄尼醇、烟碱、芸香苷的提取率均达100％；步骤二、分离：分离茄尼醇；分离绿原酸、芸香苷；分离烟碱。本发明实现了烟草绿原酸、茄尼醇、烟碱、芸香苷的同时高效提取，提取率均达到100％，通过简单的步骤将四者有效分离。

上述的发明专利存在一些缺陷：

1、用醇类溶剂作提取溶媒，尽管许多成分能够提取出来，但由于烟草成分复杂，势必增加单体成分后道工序的分离难度，不利于工业化大生产。超声有利于成分浸出，缩短提取时间，但是提取液的量很大，一般为物料的20到30倍量；烟草成分复杂，用一种溶媒提取出所有成分不太现实，提取工艺缺乏针对性；

2、含水乙醇做提取溶媒，在对提取液回收溶媒时，初期可以控制在较低温度下，但随着醇浓度的下降，回收溶液的沸点势必上升，高温会对绿原酸造成破坏，提高浓缩时的真空度会加大溶媒的损耗和废气尾气对环境的污染；

3、烟草的提取液直接上柱吸附分离，由于没有对液体进行预处理，解吸附时候，需要使用不同种类的洗脱剂，使用和回收洗脱剂的成本高。对于工业化生产来说，需要更多的柱子，造成设备投资过大，生产中的树脂用量大再生成本也增加，无疑加大生产成本；硅胶柱基本不能再生使用；

4、碱化提取液，分离烟碱可行，但是高浓度的碱液，导致绿原酸结构变化，使绿原酸的收率下降；有些工艺技术上可行，但是工业化大生产存在许多瓶颈问题。

技术实现要素：

本发明的目的针对从烟草中提取绿原酸的技术不足，采用超声逆流和膜分离、膜浓缩以及醇沉除杂，再用溶媒提取，起到富集作用，同时该技术也可用于烟叶提取茄尼醇对烟叶的前处理。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种从废弃烟叶中超声逆流和膜分离浓缩提取富集绿原酸的方法，包括如下步骤：

1、烟叶粉碎成粗粉，加入50％乙乙醇，超声逆流提取，固液比1∶10-15，提取温度40℃，提取时间30分钟，得到的提取液经高速离心机过滤，得到澄清的绿原酸提取液；

2、将步骤1得到的滤液，用截留5000分子量的超滤膜进行过滤，滤液再用截留200分子量的纳滤进行浓缩，纳滤透过液回到步骤1重复使用，纳滤未透过部分喷雾干燥得到棕黄色粉末；

3、将步骤2得到的粉末用酸性ph2-3的95％乙醇或者甲醇高速搅拌溶解，静止5小时，过滤，滤液回收溶媒重复使用，得到固形物；

4、将步骤3得到的固形物用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得到高含量的绿原酸提取物；

5、将步骤4得到的高含量的绿原酸提取物，用50％乙醇溶解，上大孔树脂lk2mgl柱，再用50％乙醇做洗脱剂，收集绿原酸溶液，浓缩，用95％乙醇或甲醇重结晶；

6、将步骤1得到的烟叶残渣用于提取烟碱及茄尼醇；

7、将步骤3得到的固形物碱化，蒸馏萃取得到烟碱。

本发明的有益效果是：在较低的温度下，最大程度地减少了绿原酸的分解，用50％乙醇做溶媒，采用超声逆流提取技术，减少了水溶性的提取溶出，同时提取溶液的量比传统方法大大减少，通过酸化溶媒，使烟碱成盐，并分离出与绿原酸物理性质溶解性能相类似的烟碱，易于绿原酸目标成分的富集化和下一步纯化，溶媒损耗小、能耗低、生产成本低，便于工业化大生产。该技术先对废弃烟叶中的绿原酸提取，既是对烟叶的资源充分利用，也是对烟草提取茄尼醇进行的一次前处理，减少了极性成分的物质量，有利于下一步茄尼醇的提取与纯化。

附图说明

图1，一种从废弃烟叶中超声逆流和膜分离浓缩提取富集绿原酸的方法的工艺流程图。

图2、图3，提取绿原酸溶媒的选择，50％乙乙醇和60％乙醇提取液的检测茄尼醇hplc指纹图谱，因为60％乙醇提取液含有茄尼醇，大于50％乙乙醇不适合做绿原酸提取溶媒。图4、图5、图6，50％乙醇超声0.5小时、1小时、1.5小时的提取液绿原酸hplc指纹图谱，证明0.5小时已经达到提取目的，时间越长，反而绿原酸含量下降；图7，烟叶提取物富集绿原酸的hplc检测图谱，图8茄尼醇90％标样hplc检测图。

具体实施方式

用本发明的实施实例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限制本发明。

绿原酸的检测方法：高压液相岛津lc-15c，分离柱采用thermoc18硅胶柱(5.0μm，4.6mmi.d.×250cm)，流动相＝乙腈∶0.3％磷酸水＝20∶80，波长：327，流速：1ml/min，进样量：20ul，温度：35℃。

茄尼醇的检测方法：高压液相岛津lc-15c，分离柱采用thermoc18硅胶柱(5.0μm，4.6mmi.d.×250cm)，流动相＝乙腈∶异丙醇＝13∶7，波长：210nm，流速：1ml/min，进样量：20ul，柱温：30℃。

实施例1

1、将干燥的烟叶粉碎成粗粉60公斤，加50％乙醇720升超声逆流提取30分钟，提取温度45℃，板框压滤机过滤，得到提取液650升，提取液经高速离心机过滤，得到澄清的绿原酸提取液；

2、将步骤1得到的提取液，经5000分子量的卷式膜超滤，超滤液再经200分子量纳滤膜浓缩，得到113公斤液体，减压真空浓缩得到58公斤浸膏，喷雾干燥得到15.7公斤干粉；

3、将步骤2得到的干粉加10倍量ph2盐酸甲醇，高速2000转/分搅拌30分钟，静止，醇沉6小时，纳滤回收甲醇回用，再经过减压真空浓缩得到9.5公斤浸膏；

4、将步骤3得到的浸膏加10倍量乙酸乙酯，高速2000转/分搅拌30分钟，过滤，滤液回收乙酸乙酯，干燥粉碎，得到绿原酸提取物1.4公斤，绿原酸含量52.7％。

5、将步骤4得到的高含量的绿原酸提取物，用50％乙醇溶解，上大孔树脂lk2mgl柱，再用50％乙醇做洗脱剂，收集绿原酸溶液，浓缩，用甲醇重结晶，得到含量为91.2％绿原酸0.68公斤；

6、将步骤1得到的烟叶残渣用于提取烟碱及茄尼醇；

7、将步骤3得到的固形物碱化，蒸馏萃取得到烟碱。

实施例2

1、将干燥的烟叶粉碎成粗粉60公斤，加50％乙醇780升超声逆流提取60分钟，提取温度40℃，板框压滤机过滤，得到提取液720升，提取液经高速离心机过滤，得到澄清的绿原酸提取液；

2、将步骤1得到的提取液，经5000分子量的卷式膜超滤，超滤液再经200分子量纳滤膜浓缩，得到128公斤液体，减压真空浓缩得到61公斤浸膏，喷雾干燥得到16.8公斤干粉；

3、将步骤2得到的干粉加10倍量ph2盐酸95％乙醇，高速2000转/分搅拌30分钟，静止，醇沉10小时，纳滤回收乙醇回用，再经过减压真空浓缩得到11.25公斤浸膏；

4、将步骤3得到的浸膏加10倍量乙酸乙酯，高速2000转/分搅拌30分钟，过滤，滤液回收乙酸乙酯，干燥粉碎，得到绿原酸提取物1.6公斤，绿原酸含量50.4％。

5、将步骤4得到的高含量的绿原酸提取物，用50％乙醇溶解，上大孔树脂lk2mgl柱，再用50％乙醇做洗脱剂，收集绿原酸溶液，浓缩，用甲醇重结晶，得到含量为90.2％绿原酸0.72公斤；

6、将步骤1得到的烟叶残渣用于提取烟碱及茄尼醇；

7、将步骤3得到的固形物碱化，蒸馏萃取得到烟碱。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。