本发明涉及吡咯并[3,2-d]嘧啶衍生物、其制备方法、药物组合物、和其于疾病的治疗和/或疗法中的用途。
本发明涉及吡咯并[3,2-d]嘧啶衍生物的用途，更特定而言涉及吡咯并[3,2-d]嘧啶衍生物在其中涉及类铎受体(toll-like-receptor)(tlr)的调节或激动的病毒感染、免疫或炎症病症的治疗中的用途。类铎受体是特征在于细胞外富含亮氨酸的结构域和含有保守区域的细胞质延伸的主要跨膜蛋白。固有免疫系统可通过这些在某些类型的免疫细胞的细胞表面上表达的tlr来识别病原体相关分子模式。外源病原体的识别激活吞噬细胞上细胞因子的产生和共刺激分子的上调。这导致t细胞行为的调节。
大部分哺乳动物物种具有10至15种类型的类铎受体。在人类和小鼠中共鉴别出13种tlr(简称为tlr1至tlr13)，且这些tlr中的许多的等效形式已在其他哺乳动物物种中发现。然而，在人类中发现的某些tlr的等效物并不存在于所有哺乳动物中。例如，编码与人类中的tlr10类似的蛋白质的基因存在于小鼠中，但似乎在过去的某一点已被反转录病毒损坏。另一方面，小鼠表达tlr11、12和13，其皆不在人类中呈现。其他哺乳动物可表达未在人类中发现的tlr。其他非哺乳动物物种可具有不同于哺乳动物的tlr，如由发现于河鲀(takifugupufferfish)中的tlr14所证实。这可使利用实验动物作为人类固有免疫模型的方法复杂化。
关于类铎受体的综述参见以下期刊论文。霍夫曼(hoffmann)，j.a.，自然(nature)，426，第33-38页，2003；阿基拉(akira)，s.、武田(takeda)，k.和卡伊绍(kaisho)，t.，免疫学年报(annualrev.immunology)，21，第335-376页，2003；尤勒维什(ulevitch)，r.j.，自然评论：免疫学(naturereviews:immunology)，4，第512-520页，2004。
先前已描述指示对类铎受体的活性的化合物，例如wo2000/006577中的杂环衍生物、wo98/01448和wo99/28321中的腺嘌呤衍生物，以及wo2009/067081中的嘧啶。
在治疗某些病毒感染时，可投与干扰素(ifn-α)的常规注射剂，在丙型肝炎病毒(hcv)的情形中就是如此。口服可用小分子ifn诱导剂提供降低免疫原性和便于投与的潜在优点。因此，新颖ifn诱导剂是治疗病毒感染的潜在有效新型药物。关于具有抗病毒作用的小分子ifn诱导剂的文献中的实例参见德克拉克(declercq)，e.；德斯坎普斯(descamps)，j.；德桑莫(desomer)，p.科学(science)1978,200,563-565。
也给予患者干扰素α与其他药物的组合来治疗某些类型的癌症。tlr7/8激动剂也因其能够诱导显著的th1反应而作为疫苗佐剂受到关注。
然而，仍迫切需要与现有技术的化合物相比，具有优选的选择性和改良的安全性概况的新颖类铎受体调节剂。
根据本发明，提供式(i)化合物
和其药学上可接受的盐、其溶剂合物或多晶型物，其中
r1是h、氟或甲基；
r2是h、卤素或c1-3烷基；
r3是任选地经一或多个独立地选自以下的取代基取代的c1-6烷基：芳氧基、杂环、卤素、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、c1-6烷基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、腈或c1-6烷氧基；
或其中
r3是任选地经一或多个独立地选自以下的取代基取代的烷基芳基：卤素、芳氧基、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、c1-6烷基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、磺酰胺、腈或c1-6烷氧基；
r4是任选地经一或多个独立地选自以下的取代基取代的c1-6烷基：羟基、c1-6烷基、c3-7环烷基、任选地进一步经c1-6烷基取代的c2-6烯基或芳基、和任选地进一步经c1-6烷基取代的c3-7环烷基；
或其中
r4是任选地经一或多个独立地选自以下的取代基取代的烷基芳基：卤素、芳氧基、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、c1-6烷基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、磺酰胺、腈或c1-6烷氧基。
优选化合物是那些式(i)化合物，其中r3为ch2-芳基(经取代或未经取代)，且r1、r2和r4如上文所描述。
第二实施例是式(i)化合物，其中r3和r4均为任选地如上文所描述进一步经取代的ch2-芳基，且r1和r2如上文所描述。
其他优选实施例是那些式(i)化合物，其中r1为氟、r2为氢且r3和r4如上文所描述。
最优选化合物是具有以下化学结构的式(ii)化合物：
式(i)和(ii)化合物和其药学上可接受的盐、其溶剂合物或多晶型物具有作为药物、尤其作为类铎受体(尤其tlr7)活性的调节剂的活性。
在另一方面中，本发明提供药物组合物，其包含式(i)或(ii)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物以及一或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
另外，本发明的式(i)或(ii)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物或包含所述式(i)或(ii)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物的药物组合物可用作药剂。
本发明的另一方面在于，式(i)或(ii)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物、或包含所述式(i)或(ii)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物的所述药物组合物可相应地用于治疗其中涉及tlr7的调节的任何病症。
术语“烷基”是指含有指定碳原子数的直链或具支链饱和脂肪族烃。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“烷基芳基”是指含有指定碳原子数的经芳基取代的直链或具支链饱和脂肪族烃，其中“芳基”如下文所定义。
术语“烯基”是指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的如上文所定义的烷基。
术语“环烷基”是指含有指定碳原子数的碳环。
术语“烷氧基”是指单键键结至氧的烷基(碳和氢链)，如例如甲氧基或乙氧基。
术语“芳基”意指任选地包含一或两个选自n、o和s、尤其选自n和o的杂原子的芳香族环结构。所述芳香族环结构可具有5个、6个或7个环原子。具体而言，所述芳香族环结构可具有5个或6个环原子。
术语“芳氧基”是指芳香族环结构。所述芳香族单键键结至氧。
术语“杂环”是指为饱和或部分饱和且包括四氢呋喃、二噁烷或其他环醚的分子。含氮杂环包括例如氮杂环丁烷、吗啉、哌啶、哌嗪、吡咯烷等。其他杂环包括例如硫吗啉、二氧杂环戊烯基和环砜。
式(i)和(ii)化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐和碱盐。适宜酸加成盐是自形成非毒性盐的酸形成。适宜碱盐是自形成非毒性盐的碱形成。
本发明化合物也可以非溶合和溶合形式存在。术语“溶剂合物”在本文中用于描述包含本发明化合物和一或多种药学上可接受的溶剂分子(例如乙醇)的分子复合物。
术语“多晶型物”是指本发明化合物能够以一种以上的形式或晶体结构存在。
本发明化合物可以结晶或非晶形产品形式投与。其可通过诸如沉淀、结晶、冷冻干燥、喷雾干燥或蒸发干燥等方法以例如固体填料、粉末或膜形式获得。其可单独投与或与一或多种本发明其他化合物组合或与一或多种其他药物组合投与。通常，其将以结合一或多种药学上可接受的赋形剂的调配物形式投与。术语“赋形剂”在本文中用于描述除本发明化合物外的任何成分。赋形剂的选择主要取决于诸如以下等要素：具体投与模式、赋形剂对溶解度和稳定性的影响以及剂型的性质。
出于投与目的，本发明化合物或其任一亚组可调配成多种药物形式。可引用通常用于全身性投与药物的所有组合物作为适宜组合物。为制备本发明的药物组合物，将有效量的任选地呈加成盐形式的具体化合物作为活性成分与药学上可接受的载剂组合于紧密混合物中，该载剂可采用众多种形式，这取决于投与所需的制剂形式。这些药物组合物合意地呈适于例如口服、经直肠或经皮投与的单一剂型。例如，在呈口服剂型的组合物的制备中，可采用任一常用药物介质，在口服液体制剂(例如悬浮液、糖浆、酏剂、乳液和溶液)的情形下采用例如水、二醇、油、醇等；或在粉剂、丸剂、胶囊和片剂的情形下采用固体载剂，例如淀粉、糖、高岭土、稀释剂、润滑剂、黏合剂、崩解剂等。因其易于投与，片剂和胶囊代表最有利的口服单位剂型，在该情形下明显采用固体药物载剂。也包括可在即将使用前转化成液体形式的固体形式制剂。在适于经皮投与的组合物中，载剂任选地包含渗透增强剂和/或适宜润湿剂，任选地与少量任何性质的适宜添加剂组合，该等添加剂不会对皮肤造成显著有害的影响。所述添加剂可促进投与至皮肤和/或可帮助制备所需组合物。这些组合物可以多种方式来投与，例如作为穿皮贴片、滴剂、软膏来投与。本发明化合物也可通过吸入或吹入借助业内用于通过这种方式投与的方法和调配物来投与。因此，本发明化合物通常可以溶液、悬浮液或干燥粉末形式投与肺。
尤其有利地调配呈单位剂型的上述药物组合物以便于剂量的投与和均匀性。如本文所使用的单位剂型是指适宜作为单一剂量的物理离散单位，每一单位含有经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性成分以及所需药物载剂。所述单位剂型的实例是片剂(包括刻痕或包衣片剂)、胶囊、丸剂、粉剂包、糯米纸囊剂、栓剂、可注射溶液或悬浮液等和其分离多倍剂。
传染病治疗技术人员将能够根据下文所呈现的测试结果确定有效量。通常，预期每日有效量将为0.01mg/kg至50mg/kg体重，更优选地0.1mg/kg至10mg/kg体重。可适当地在全天以适宜间隔以两个、三个、四个或更多个子剂量投与所需剂量。所述子剂量可调配成单位剂型，例如每单位剂型含有1至1000mg、且具体来说5至200mg活性成分。
投与的确切剂量和频率取决于所用的具体式(i)化合物、所治疗的具体病况、所治疗病况的严重程度、具体患者的年龄、体重和一般身体状况以及个体可服用的其他药剂，如所属领域技术人员所熟知。另外，明显地，可根据所治疗个体的反应和/或根据用本发明化合物开处方的医师的评估来降低或增加有效量。因此，上文所述的有效量范围仅为指导且并不打算在任一程度上限制本发明的范畴或使用。
实验部分
方案1.总反应方案
在方案1中，可在极性非质子溶剂(例如thf)中使用光延条件(mitsunobucondition)用醇官能化类型a化合物。在碱性条件下在1,4-二噁烷中使氨基甲酸甲酯裂解以形成中间体c。在极性非质子溶剂(例如nmp)中使用醇和碱(例如nah)置换c中的氯以形成类型d化合物。
中间体a的制备
将3-氨基-2-乙氧基羰基吡咯盐酸盐(25.8g，135.3mmol)分配于二氯甲烷和饱和nahco3之间。经mgso4干燥有机层，通过过滤去除固体，且将滤液的溶剂蒸发至干燥。将残余物与1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-异硫脲(32.1g，156mmol)和乙酸(39ml，677mmol)一起溶解于甲醇(500ml)中，且在室温下搅拌1小时。出现沉淀且继续搅拌过夜。添加甲醇钠(73.1g，1353mmol)。观察到放热反应且将反应混合物搅拌过夜。用乙酸使混合物达到ph5，且通过过滤分离沉淀，在过滤器上与水(2×350ml)、乙腈(350ml)和二异丙基醚(350ml)一起研磨。在烘箱中干燥所获得的n-(4-羟基-5h-吡咯并-[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸甲酯。
在室温下，将n-(4-羟基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基甲酸甲酯(25g，120mmol)分配于配备有顶置式搅拌器(300rpm)的500ml多颈烧瓶中的350ml乙腈中。添加pocl3(22.1ml，238.2mmol)，且然后在搅拌的同时将反应混合物加热至70℃。通过注射泵以0.2ml/min的流量逐滴添加二异丙基乙胺(41.4ml，240.2mmol)。
将反应混合物冷却至室温，且在45℃下倾倒至乙酸钠(78.8g，961mmol)于水(500ml)中的搅拌溶液中。蒸发有机物且在冰浴上搅拌并冷却剩余液体。通过过滤分离所形成的固体，用乙腈洗涤且与二异丙基醚一起研磨以提供中间体a，在真空下干燥。lc-msm/z＝227(m+h)
中间体b的制备
方法1.
在室温下，向a(500mg，2.2mmol)、苄基醇(0.28ml，2.6mmol)和三苯基膦(0.69g，2.6mmol)于无水thf(15ml)中的悬浮液中添加diad(0.64ml，3.3mmol)。在室温下将反应混合物搅拌30分钟。在减压下浓缩混合物。通过硅胶柱色谱使用庚烷至乙酸乙酯梯度(100-0至90-10)纯化产物。收集产物部分且在减压下浓缩。在二异丙基醚中研磨产物，通过过滤分离且在真空下干燥，以提供淡黄色固体状b。lc-msm/z＝317(m+h)
方法2使用树脂结合的三苯基膦。
在室温下，向a(700mg，3.1mmol)、苄基醇(0.39ml，3.7mmol)和三苯基膦树脂(2.6g，7.7mmol)于无水thf(21ml)中的悬浮液中添加diad(0.90ml，4.6mmol)。在室温下将反应混合物搅拌1h。经填充硅藻土(decalite)过滤混合物且用甲醇洗涤。在真空中浓缩滤液。在二异丙基醚中研磨产物，通过过滤分离且在真空下干燥，以提供淡黄色固体b。lc-msm/z＝317(m+h)
中间体c的制备
将b(738mg，2.3mmol)溶解于50ml玻璃管中的1,4-二噁烷(11ml)中，且添加naoh(5.6ml，1n水溶液)。将混合物加热至60℃并保持5h。将混合物冷却且在真空中浓缩。用水处理残余物且通过过滤分离沉淀并在真空下干燥，以提供固体状c。产物以原样用于下一步骤中。lc-msm/z＝259(m+h)
1和2的制备
方法1.
将中间体c(240mg，0.93mmol)、正丁基醇(3.2ml，35mmol)和二噁烷中的4nhcl(0.46ml，1.9mmol)置于7ml微波瓶中。将瓶密封且将混合物在微波中在120℃下加热10分钟。将混合物冷却且在真空中浓缩。用饱和nahco3溶液中和残余物且用二氯甲烷萃取。分离有机层，干燥(mgso4)，通过过滤去除固体且在减压下浓缩滤液。通过硅胶柱色谱使用二氯甲烷-甲醇100-0至95-5梯度纯化产物。收集最佳部分且在减压下浓缩。在二异丙基醚中研磨产物且通过过滤分离固体并在真空下干燥，以提供白色固体状1。
方法2.
将中间体c2(250mg，1.1mmol)和3-羟基甲基-5-甲基异噁唑(0.16ml，1.65mmol)溶解于7ml瓶中的nmp(3ml)中。在冰浴上冷却混合物且在n2下添加nah(66mg，1.65mmol，矿物油中的60％分散液)并在0-5℃下将混合物搅拌30分钟，且然后升温至室温并继续搅拌2h。然后通过制备型hplc(固定相：rpvydacdenalic1810μm，200g，5cm；流动相：水和ch3cn中的0.25％nh4oac溶液)纯化粗反应混合物，收集所需部分且在真空中浓缩。使产物自ch3cn结晶，通过过滤分离且在真空下干燥，以提供白色固体2。
表1.式(i)化合物和相应的分析数据。各化合物是根据实验部分中所描述的方法制备。
分析方法.
lcms一般程序
如相应方法中所指明使用lc泵、二极管阵列(dad)或uv检测器和柱进行高效液相色谱(hplc)测量。若需要，包括其他检测器(参见下文的方法表格)。
使流自柱通入配置有大气压离子源的质谱仪(ms)。以下在技术人员的知识内：设定调谐参数(例如扫描范围、采样时间……)以获得允许鉴别出化合物的标称单同位素分子量(mw)的离子。利用适宜软件进行数据获取。
化合物是通过其实验滞留时间(rt)和离子来描述。若在数据表中无不同规定，则所报告分子离子对应于[m+h]+(质子化分子)和/或[m-h]-(去质子化分子)。在该化合物不是直接可电离的情况下，指定该加合物的类型(即[m+nh4]+、[m+hcoo]-等)。对于具有多种同位素模式的分子(br、cl……)，所报告值是针对最低同位素质量所获得的值。所获得的所有结果均具有实验不确定性，这通常与所使用方法相关。
下文中，“sqd”意指单四极检测器，“msd”质量选择性检测器，“rt”室温，“beh”桥连乙基硅氧烷/二氧化硅杂化，“dad”二极管阵列检测器，“hss”高强度二氧化硅，“q-tof”四极飞行时间质谱仪，“clnd”化学发光氮检测器，“elsd”蒸发光扫描检测器，
lc-ms方法代码(流量以ml/min表示；柱温度(colt)以℃表示；运行时间以分钟表示)。
式(i)和(ii)化合物的生物活性
生物测定的描述
tlr7和tlr8活性的评价
在细胞报告基因测定中使用瞬时转染了tlr7或tlr8表达载体以及nfκb-luc报告基因构建体的hek293细胞对这些化合物激活人tlr7和/或tlr8的能力进行评估。
简言之，使hek293细胞于培养基(补充有10％fcs和2mm谷氨酰胺的dmem)中生长。对于在15cm培养皿中的细胞的转染，用胰蛋白酶-edta将细胞分离，用cmv-tlr7或tlr8质粒(1700ng)、nfκb-luc质粒(850ng)和转染试剂的混合物对细胞进行转染，并且在37℃下在湿润的5％co2气氛下孵育48h。然后将转染的细胞在pbs中洗涤，用胰蛋白酶-edta分离并且在培养基中重悬至1.25x105个细胞/ml的密度。然后将40微升的细胞分配至384孔板中的每孔中，在孔中已经存在200nl的化合物(在100％dmso中)。在37℃、5％co2下孵育6小时后，通过向每孔中添加15μl的steadyliteplus底物(珀金埃尔默公司(perkinelmer))并且在viewluxultrahts微板成像仪(珀金埃尔默公司)上进行读出来确定荧光素酶活性。从按一式四份进行的测量生成剂量反应曲线。对每个化合物的最低有效浓度(lec)值进行确定，该最低有效浓度值被定义为引发超出测定的标准偏差至少两倍的效应的浓度。
在384孔板中，使用化合物的类似稀释系列和每孔40μl的单独用cmv-tlr7构建体转染的细胞(1.25x105个细胞/ml)对化合物毒性进行平行确定。在37℃、5％co2下孵育6小时后，通过每孔中添加15μl的atplite(珀金埃尔默公司)并且在viewluxultrahts微板成像仪(珀金埃尔默公司)上读数来测量细胞活力。数据以cc50进行报告。
平行地，使用一种相似稀释系列的化合物(在100％dmso中的200nl的化合物)和每孔40μl的单独用nfκb-luc报告基因构建体转染的细胞(1.25x105个细胞/ml)。在37℃、5％co2下孵育后6小时，通过向每孔中添加15μl的steadyliteplus底物(珀金埃尔默公司)并且在viewluxultrahts微板成像仪(珀金埃尔默公司)上进行读出来确定荧光素酶活性。将计数器屏数据报告为lec。
isre启动子元件的激活
还通过测量由来自pbmc的条件培养基造成的干扰素刺激应答元件(isre)的激活而对这些化合物诱导ifn-i的潜力进行了评估。具有序列gaaactgaaact的isre元件高度响应于stat1-stat2-irf9转录因子，在ifn-i结合至它们的受体ifnar(clontech，pt3372-5w)时被激活。来自clontech(参考号631913)的质粒pisre-luc包含5个这种isre元件拷贝，随后是萤火虫荧光素酶orf。建立一种稳定转染pisre-luc(hek-isreluc)的hek293细胞系来分析pbmc条件细胞培养基。
简言之，从至少两个供体的血沉棕黄层使用标准的聚蔗糖(ficoll)离心方案来制备pbmc。将分离的pbmc重悬于补充有10％人ab血清的rpmi培养基中，并且将2x105个细胞/孔分配至含有化合物(70μl总体积)的384孔板中。孵育过夜后，将10μl的上清液转移至包含5x103hek-isreluc细胞/孔(30μl)(前一天铺板)的384孔板。经24小时孵育后，通过测定荧光素酶活性(使用40μl/孔steadyliteplus底物(珀金埃尔默公司)，并且用viewluxultrahts微板成像仪(珀金埃尔默公司)测量)而对isre元件的激活进行测量。每个化合物对hek-isreluc细胞的刺激活性被报告为lec值，该lec值定义为施用至pbmc导致荧光素酶活性至少超出测定标准偏差两倍的化合物浓度。lec进而指示在转移定义量的pbmc培养基时isre激活的程度。使用重组干扰素α-2a(罗扰素(roferon)-a)作为标准对照化合物。
表2.式(i)化合物的活性。
所有化合物均展示cc50>24μm。
na＝无法获得