一种胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法与流程

本发明属于微生物活性成分提取分离技术领域。更具体地，涉及一种胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法。

背景技术

虾青素是一种普遍存在于自然界的天然类胡萝卜素，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎症、提高免疫力、呈色及促进生长等多种作用，并能预防糖尿病、心血管和神经退行性疾病。该物质现已广泛应用于食品、保健品、药品、化妆品、饲料及养殖业等行业，美国等国家已允许将其作为动物和鱼饲料中的食物色素使用，市场前景广阔。

目前，国际上对虾青素需求量很大。虾青素的来源主要有两种，一种是化学合成，另一种是生物提取，生物提取的原料主要有水产品废弃物、雨生红球藻、和红发夫酵母发酵物等。然而，水产品废弃物中的虾青素含量低，提取条件要求苛刻，生产成本高，产量少；雨生红球藻自养培养周期长，技术水平要求较高，生产工艺较复杂；红发夫酵母细胞内虾青素的生物合成受发酵条件的影响较大，发酵成本较高，提取产量较低。另外，目前生物提取的方法主要有超临界co2萃取法、化学溶剂提取法等，通过生物提取得到的粗提物，再进行皂化、分离纯化。目前分离纯化的方法主要为柱层析方法，柱层析的方法中根据固定相的不同，分为正相柱层析法与反相柱层析法，正相柱层析主要以硅胶作为固定相的填料，采用二氯甲烷-正己烷作为流动相，进行柱层析；反相柱层析主要以键合硅胶c18作为填料，采用甲醇-水作为流动相，进行柱层析。经过上述方法提取可得到纯度约为80％～90％的虾青素。

但是，由于现有提取分离方法的破壁、提取和分离工艺的限制，其制备得到的虾青素得率低、纯度低(≤90％)，而且这些技术，有些因为高压、减压、低温技术而大大增加分离纯化的成本，有些则因为采用高温、使用易残留有机溶剂等降低了虾青素的活性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法。该方法操作简便、高效，获得的虾青素得率高、纯度高，同时有利于减少对虾青素结构的破坏，生理活性好，可以进行大规模提取，容易实现工业化生产。

本发明的目的是提供一种胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法，包括以下步骤：

s1.采用酸热法将胶红酵母干菌体细胞破壁后，离心，弃上清液，洗涤，加入浸提液，于45～55℃提取2～4次，得到虾青素粗提液；其中所述浸提液为丙酮溶液，或者为乙酸乙酯与乙醇的混合液，或者为乙腈与甲醇的混合液；

s2.向虾青素粗提液中加入koh醇溶液，在4～50℃黑暗条件下皂化20min～7h后，得到皂化后的虾青素提取液；

s3.将虾青素提取液上样至硅胶柱层析中，以流动相进行梯度洗脱，分离得到虾青素成品；其中，所述流动相选自正己烷、二氯甲烷、丙酮、石油醚或乙酸乙酯中的一种或几种。

优选地，步骤s3中，所述流动相为正己烷、石油醚与乙酸乙酯的混合液，所述正己烷、石油醚与乙酸乙酯的体积比为5～7:1～2:1～2；或者所述流动相为正己烷与丙酮的混合液，所述正己烷与丙酮的体积比为2～7:1～3。

更优选地，所述正己烷、石油醚与乙酸乙酯的体积比为7:2:1。

更优选地，所述正己烷与丙酮的体积比为5:2。

优选地，步骤s1中，每次提取时间为25～35min。

更优选地，步骤s1中，于50℃提取3次；每次提取时间为30min。

优选地，步骤s1中，所述酸热法的条件为：向胶红酵母干菌体细胞中加入2～4mol/l的盐酸，混匀，室温静置30～50min，沸水浴1～5min进行破壁。

优选地，所述胶红酵母干菌体细胞与盐酸的料液比为0.1:3～7g/ml。

更优选地，所述胶红酵母干菌体细胞与盐酸的料液比为0.1:5g/ml。

优选地，所述盐酸的浓度为3mol/l。

优选地，室温静置40min，沸水浴3min进行破壁。

优选地，步骤s1中，所述胶红酵母干菌体细胞与浸提液的料液比为0.1:5～10g/ml。

更优选地，步骤s1中，所述胶红酵母干菌体细胞与浸提液的料液比为0.1:7g/ml。

优选地，步骤s1中，所述浸提液为乙酸乙酯与乙醇的混合液，所述乙酸乙酯与乙醇的体积比为0.5～3.5:1。

更优选地，所述乙酸乙酯与乙醇的体积比为2:1。

优选地，步骤s2中，所述koh醇溶液为koh乙醇溶液；所述koh醇溶液的浓度为10～20g/l。

更优选地，步骤s2中，所述koh醇溶液的浓度为20g/l。

优选地，步骤s2中，所述虾青素粗提液与koh醇溶液的体积比为1:0.6～2。

更优选地，步骤s2中，所述虾青素粗提液与koh醇溶液的体积比为1:2。

优选地，步骤s2中，所述皂化的条件为在20～40℃黑暗条件下皂化30～60min。

更优选地，步骤s2中，所述皂化的条件为在40℃黑暗条件下静置皂化30min。

优选地，所述胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法，还包括收集所述胶红酵母干菌体细胞的步骤：将胶红酵母发酵液离心后，弃上清液，用灭菌蒸馏水洗涤2～4次，将沉淀细胞于40～60℃(优选为50℃)烘干至恒重，即可得到所述胶红酵母干菌体细胞。

更优选地，所述离心的速率为2000～6000r/min，离心的时间为10～30min。

最优选地，所述离心的速率为4000r/min，离心的时间为20min。

优选地，所述胶红酵母发酵液的制备方法为：将胶红酵母种子液按4％～6％(优选为5％)接种于红酵母发酵培养基，25～35℃、130～150r/min振荡培养，即可得到所述胶红酵母发酵液。

优选地，所述胶红酵母种子液的制备方法为：将胶红酵母斜面保存菌种接种于红酵母种子培养基，25～35℃、130～150r/min振荡培养，即可得到所述胶红酵母种子液。

更优选地，所述振荡培养的条件为30℃、140r/min振荡培养48～72h。

优选地，所述胶红酵母为胶红酵母的诱变菌株zthy2(rhodotorulamuciladinosazthy2)。所用zthy2菌株从雷州半岛近岸海域分离获得，具有生长周期短、菌体细胞数量多、营养要求简单及虾青素含量高的优点，是一株理想的虾青素生产菌株。该菌株已于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2015296，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。

优选地，所述硅胶柱层析的硅胶粒径为200～300目。

优选地，所述胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法，还包括用高效液相色谱法测定虾青素含量。

更优选地，所述高效液相色谱的条件：

novapac18反向色谱柱(3.9mm×150mm，4μm)；

进样量为10μl；

流动相为：a液与b液的混合溶液，其中a液为甲醇-四氢呋喃-乙腈(53:36:11)，b液为水；

梯度洗脱条件：0～40min，a液比例为65％～100％；40～45min，a液比例为100％～65％；45～48min，a液比例为65％；

流速为1.0ml/min；

柱温为35℃；

检测波长为475nm。

本发明所述虾青素成品中的游离虾青素浓度为96.8％，提取得率为2.47mg/g(干菌体)。另外，实验发现本发明在提高分离速度的同时，有利于减少虾青素在破壁和皂化过程中的破坏，提取得到的虾青素成品活性好，能够提高畜禽的生产性能，改善鸡蛋品质，以及降低鸡蛋中胆固醇的含量。

本发明具有以下有益效果：

本发明以胶红酵母干菌体细胞为原料，采用酸热法进行破壁，以乙酸乙酯与乙醇的混合溶液作为浸提液，于45～55℃进行提取，同时在4～50℃黑暗条件下皂化20min～7h后，选择合适的流动相进行硅胶柱层析，制备的虾青素纯度和得率高，游离虾青素浓度为96.8％，提取得率为2.47mg/g(干菌体)。另外，本发明的破壁效果和皂化效果好，提取效率高，分离速度快，在提高分离速度的同时，有利于减少虾青素在破壁和皂化过程中的破坏，虾青素的提取率高、纯度高、活性高，获得了满意的纯化效果。而且，本发明提取分离方法简单，反应条件要求少，成本低，可大规模推广使用，为虾青素纯品的开发应用奠定基础。

附图说明

图1为虾青素标准曲线。

图2为虾青素标准品的hplc图谱。

图3为虾青素提取样品的hplc图谱。

图4为皂化的虾青素浓缩液的薄层层析模式图，其中a为koh+甲醇a法；b为koh+甲醇b法；c为koh+乙醇法。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中，虾青素生产菌株为胶红酵母的诱变菌株zthy2，该菌株已于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2015296，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。

红酵母种子培养基为：蛋白胨2％，酵母膏1％，葡萄糖2％，nacl2％，ph值自然。

红酵母发酵培养基为：蛋白胨2％，酵母膏2％，牛肉膏1％，葡萄糖2％，nacl2％，mnso40.025％，ph值自然。

实施例1一种胶红酵母干菌体细胞的制备方法

一种胶红酵母干菌体细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胶红酵母zthy2斜面保存菌种接种于红酵母种子培养基，30℃、140r/min振荡培养48h，得到胶红酵母种子液；

(2)将胶红酵母种子液按5％接种于红酵母发酵培养基，30℃、140r/min振荡培养72h，得到胶红酵母发酵液；

(3)将胶红酵母发酵液于4000r/min离心20min，弃上清液，用灭菌蒸馏水洗涤2次，将沉淀细胞于50℃温箱中烘干至恒重，得到胶红酵母干菌体细胞。

实施例2一种胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法

1、一种胶红酵母中虾青素提取及分离纯化的方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g实施例1的胶红酵母干菌体细胞，加入3mol/l盐酸5ml，混匀，室温静置40min，沸水浴中3min，迅速冷却，4000r/min离心10min，弃上清液，蒸馏水洗涤2次；加入7ml乙酸乙酯与乙醇的混合溶液(乙酸乙酯与乙醇的体积比为2:1)，于50℃水浴中提取30min，4000r/min离心15min，重复提取2次，得到虾青素粗提液；

(2)取5ml虾青素浓缩液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯5ml，再加入20g/l氢氧化钾的乙醇溶液10ml，于40℃黑暗条件下静置30min，加入适量饱和食盐水直至混合液出现分相，再于4℃冰箱中静置3h，收集上层有色的乙酸乙酯相，得到皂化后的虾青素提取液；

(3)用湿法装柱，以正己烷为装柱溶剂，将硅胶(200～300目)装填到配有玻璃活塞的层析柱中，将虾青素提取液上样至该硅胶柱层析中，以正己烷与丙酮的混合溶液(正己烷与丙酮的体积比为5:2)为流动相进行梯度洗脱，分离得到虾青素成品；

(4)用高效液相色谱法测定虾青素含量；其中，高效液相色谱的条件为：

novapac18反向色谱柱(3.9mm×150mm，4μm)；进样量为10μl；流动相为：a液与b液的混合溶液，其中a液为甲醇-四氢呋喃-乙腈(53:36:11)，b液为水；梯度洗脱条件：0～40min，a液比例为65％～100％；40～45min，比例为100％～65％；45～48min，a液比例为65％；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为475nm。

2、结果

(1)虾青素的标准曲线见图1。由图1可知，虾青素在1～6μg/ml浓度范围内线性关系良好，一次回归方程为y＝3.182x+0.748，相关系数r²＝0.992。

(2)虾青素标准品及虾青素提取液的洗脱组分的hplc图谱见图2和图3。由图2和图3可知，虾青素标准品和虾青素提取样品在本试验条件下的保留时间均为12.013min，但提取样品在虾青素的峰值之后出现了两个极小的峰，推测为虾青素单酯及虾青素双酯；通过hplc测定出的峰面积结合虾青素的标准曲线一次性回归方程可得出虾青素提取样品中的游离虾青素浓度为96.8％。本发明虾青素的提取得率为2.47mg/g(干菌体)。另外，实验发现本发明提取得到的虾青素成品活性好，能够提高畜禽的生产性能，改善鸡蛋品质，以及降低鸡蛋中胆固醇的含量。

实施例3破壁方法及提取方的选择及优化

1、破壁方法及提取方法

分别采用酸热法、超声波裂解法、二甲基亚砜(dmso)+无水乙醇提取法对胶红酵母进行破壁，其中酸热法的浸提液分别有3种，分别是：丙酮溶液、乙酸乙酯+乙醇(2:1)混合溶液、乙腈+甲醇(7.5:2.5)的混合溶液。

3种破壁提取方法的具体步骤分别如下：

(1)酸热法：称取0.1g干菌体细胞于离心管中，加入3mol/l盐酸5ml，混匀，室温静置40min，沸水浴中3min，迅速冷却，4000r/min离心10min，弃上清液，蒸馏水洗涤2次，加入7ml浸提液，于50℃水浴中提取30min，4000r/min离心15min，重复提取2次；将上清液置于20ml刻度管中，用浸提液定容至15ml，得到虾青素粗提液；其浸提液分别有3种，分别是：丙酮溶液、乙酸乙酯+乙醇(2:1)混合溶液、乙腈+甲醇(7.5:2.5)的混合溶液。

(2)超声波裂解法：称取0.1g干菌体细胞于离心管中，加入蒸馏水2ml，混匀，反复冻融(-30℃冻存，37℃溶解)3次，再用超声波进行裂解(超声波的频率40khz，处理时间为10min，温度为室温)，在裂解液中加入乙酸乙酯5ml，在50℃水浴中提取3h，4000r/min离心15min，重复提取2次；将上清液置于20ml刻度管中，用乙酸乙酯定容至15ml，得到虾青素粗提液。

(3)二甲基亚砜(dmso)+无水乙醇法：称取0.1g干菌体细胞于离心管中，加入5ml已预热50℃的dmso，混匀，置于50℃水浴锅中5min，取出离心管并加入2ml无水乙醇，闭光静置提取15min，4000r/min离心15min，重复提取2次；将上清液置于20ml刻度管中，用无水乙醇定容至15ml，得到虾青素粗提液。

2、粗提液中虾青素含量的测定：

用可见分光光度计在476nm处检测虾青素粗提液的吸光值，直接用吸光值的大小定性反映胶红酵母粗提液中虾青素含量的高低。

3、结果

实验发现，发现不同的破壁方法对胶红酵母中虾青素的提取效果存在巨大差异。胶红酵母虾青素提取方法的比较结果见表1。由表1可知，采用酸热法进行破壁，同时采用乙酸乙酯+乙醇(2:1)混合溶液作为浸提液的酸热法提取的虾青素的吸光值最高，明显优于其他四种提取方法。说明应用乙酸乙酯+乙醇(2:1)混合溶液作为浸提液的酸热法较好。

表1胶红酵母虾青素提取方法的比较

实施例4皂化方法的选择

由于天然虾青素多以酯类的形式存在，而酯化形式的虾青素生物利用度较低，纯化和检测都较困难，故从胶红酵母中提取虾青素需要将粗提物中的虾青素酯皂化水解成游离虾青素。

1、虾青素浓缩液的皂化方法

在避光条件下，将虾青素粗提液15ml用真空旋转蒸发仪(温度为35℃，真空度为0.08mpa)浓缩至5ml，即为虾青素浓缩液。分别用以下3种方法对虾青素浓缩液进行皂化，获取游离虾青素，通过薄层层析跑点反映皂化的优劣程度。

(1)koh+甲醇a法：取5ml虾青素浓缩液，置于离心管中，加入10g/l氢氧化钾的甲醇溶液3ml，于4℃黑暗条件下静置7h，10000r/min、4℃离心15min，收集上清液，即为皂化后的虾青素提取液，进行薄层层析鉴定。

(2)koh+甲醇b法：取2.5ml虾青素浓缩液，置于刻度试管中，加入10g/l氢氧化钾的甲醇溶液2.5ml，于20℃黑暗条件下振荡60min；皂化后的溶液用甲醇定容至10ml，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液即为皂化后的虾青素提取液，进行薄层层析鉴定。

(3)koh+乙醇法：取5ml虾青素浓缩液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯5ml，再加入20g/l氢氧化钾的乙醇溶液10ml，于40℃黑暗条件静置30min，加入适量饱和食盐水直至混合液出现分相，再于4℃冰箱中静置3h，收集上层有色的乙酸乙酯相，即为皂化后的虾青素提取液，进行薄层层析鉴定。

2、结果

(1)薄层层析展开剂为正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7:1:2)溶液时，薄层层析结果的模式图见图4。理想的比移值应该在0.2～0.8之间，由图4可知，比移值在0.321位置上，水解液的点明显加深、加大，为游离虾青素的跑点；而比移值在0.768位置上，水解液的点明显变浅、变小，且此点已接近比移值的最大值，判定此点为虾青素脂的跑点。3种皂化方法比较，koh+乙醇法所得到的游离虾青素最多，跑点最为明显，分离度也最高。

(2)皂化液的种类、碱的浓度、皂化温度、皂化时间均对皂化效果有着显著的影响。本发明用氢氧化钾的乙醇溶液作为虾青素脂皂化液，在4～50℃黑暗条件下皂化20min～7h后，得出的样品较好，在提高反应速度的同时，有利于减少虾青素在皂化过程中的破坏，经高效液相色谱检测的皂化得到的游离虾青素比率为35％。

实施例5薄层层析鉴定及展开剂的选择

1、方法

(2)薄层层析所使用的展开剂分别是：正己烷+二氯甲烷+丙酮(5:2:2)溶液、正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7:2:1)溶液、正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7:1:2)溶液、正己烷+丙酮(7:3)溶液、正己烷+丙酮(5:2)溶液、石油醚+丙酮(2:1)溶液和甲醇+乙腈(3:1)溶液等六种组合展开剂。

(2)根据比移值、分离度和分离个数进行比较，从而选出最适合的展开剂。计算公式：比移值＝b/a；分离度＝2d/(w1+w2)；式中，a：原点到展开剂前沿的距离(cm)；b：原点到各类斑点中心的距离(cm)；d：相邻两斑点中心的距离差；w1、w2：相邻两斑点的宽度。

2、结果

薄层层析所用展开剂组合、展开时间、比移值及分离度的结果见表2。由表2可知，正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7:2:1)溶液与正己烷+丙酮(5:2)溶液的分离度较大，而正己烷+丙酮溶液的比移值适中，展开时间也较为理想。因此，本试验采用正己烷+丙酮(5:2)混合溶液作为柱层析的流动相(洗脱剂)。将皂化后的虾青素提取液滴加于层析柱硅胶表面，用薄层层析选择出的最佳展开剂(正己烷+丙酮(5:2)溶液)为洗脱剂，收集不同的洗脱组分。

表2薄层层析展开剂的比较

上述实施例3～5表明，胶红酵母干菌体细胞的最佳破壁方法是酸热法，浸提溶剂为乙酸乙酯与乙醇(2:1)混合溶液，皂化液为koh的乙醇溶液(20g/lkoh)，皂化条件是40℃、30min；最佳展开剂和洗脱剂是正己烷与丙酮(5:2)混合溶液。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。