一种大量表达抗真菌蛋白的方法与流程

本发明涉及一种可大量表达抗真菌蛋白的方法。

背景技术：

天然抗菌剂种类非常多样化，其来源有来自微生物、植物及动物等，由于天然抗菌剂拥有天然无毒、广普及绿色环保等优势，近几年天然抗菌剂的开发已成为全球发展新药的新趋势。微生物源的抗菌剂除了包含在医疗上长期使用的抗生素之外，多肽类抗菌剂其具有无毒及高效的特，已成为目前研究的热点。多肽类抗菌剂包含有防御素、蜕皮素、黑芥子硫酸苷酶及转脂蛋白等小分子抗菌蛋白质，其中防御素具有反平行β折叠的桶状结构及6至8个半胱氨酸形成的二硫键，拥有较高的稳定性，作为开发药物一大优势。目前已自真菌中发现多种不同的防御素抗菌蛋白质，此类抗真菌蛋白质多从曲霉菌属、青霉菌属及新萨托菌属中克隆出来，因此，皆具有完整的基因序列，hagen等人(2007)的研究更发现抗真菌蛋白afp拥有几丁质结合域的保守氨基酸序列，会抑制细胞壁几丁质的合成，造成细胞壁的缺失。然而抗真菌蛋白pgafp则无此保守氨基酸序列，且根据之前的研究显示pgafp会干扰细胞信号转导与诱导细胞凋亡，显然抗真菌蛋白质在抑制真菌上具有不同的机理反应。

利用基因工程方法大量表达生产抗真菌蛋白质的研究较少，国内以萝卜抗真菌蛋白作为研究材料较多，在大肠杆菌中能成功表达出具有抑菌活性的蛋白质。徐军等人则是从巨大曲霉菌中将抗真菌蛋白基因转化至绿色木霉菌中，产生的抗真菌蛋白质同样具有抑制真菌的功效。国外在抗真菌蛋白异源表达上的研究不多，主要研究是将萝卜及绿色木霉抗真菌蛋白基因转化至酵母菌(saccharomycescerevisiae及pichiapastoris)，两种抗真菌蛋白质能分别在不同的酵母菌中表达。然而，wnendt等人(1994)自aspergillusgiganteus中发现的抗真菌基因(ncbiaccessionnumber:x60771)，将其基因转化到aspergillusniger，发现转化株的抗真菌蛋白表达产量极低，造成应用上的困难。

技术实现要素：

本发明根据aspergillusgiganteus的抗真菌基因序列(ncbiaccessionnumber:x60771)，选取成熟肽的外显子序列经过optimumgene^tmcodonoptimization软件进行大肠杆菌最适密码子的优化分析，将优化后的基因序列(seqidno：1)委托genedirex(美国)公司以人工合成方式获得，之后同样委托genedirex公司将优化后的基因(seqidno：1)与质粒pet23a(novagen，美国)进行接合反应，获得可以在大肠杆菌表达的质粒(seqidno：2)。此优化后的序列(seqidno：1)与原始的序列(ncbiaccessionnumber:x60771)相似度为84％，共有24个密码子经过修改优化(图1)，优化后的dna序列再建构于质粒pet23a上，获得一表达质粒pafp-opt(图2以及seqidno：2)。将质粒pafp-opt(seqidno：2)转化至大肠杆菌中，产生的蛋白质进一步以sds-page及蛋白质印迹(westernblotting)进行分析，从结果可发现经过优化后的序列在大肠杆菌中可以大量的表达(图3)。将表达纯化后的抗真菌蛋白以纸片扩散法(discdiffusionmethod)分析抗真菌能力，结果发现30μg的抗真菌蛋白对paecilomycesformosus(gim3.612)真菌具有明显的抑制作用，并且随着浓度增加，抑制真菌的透明圈就越明显(图4)。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1aspergillusgiganteus的抗真菌基因(ncbiaccessionnumber:x60771)及经过优化后基因(序列编号1)的dna序列比较差异，下划线字体为有差异的密码子。

图2抗真菌蛋白表达质粒，pafp-opt(序列编号2)为含有序列编号1的大肠杆菌表达质粒。

图3抗真菌蛋白在大肠杆菌的基因表达，进行sds-page分析，泳道1为pafp-opt质粒转化大肠杆菌中粗提取的蛋白质，泳道2-8为利用ni柱纯化，加入洗涤液后依序每1.5毫升收集含有抗真菌蛋白的洗涤液。黑色箭头即为表达生产出的抗真菌蛋白。

图4不同浓度的抗真蛋白利用纸片扩散法针对真菌paecilomycesformosus(gim3.612)进行抗菌分析。

具体实施方式

实施例1抗真菌基因合成

根据aspergillusgiganteus的抗真菌基因序列(ncbiaccessionnumber:x60771)，选取成熟肽的外显子序列经过optimumgene^tmcodonoptimization(金斯瑞生物科技，南京，中国)软件分析后，获得一经大肠杆菌最适密码子优化后的基因序列编号1(seqidno.1)，委托genedirex公司(美国)以人工合成方式合成序列编号1，并将序列编号1接合于pet23a(novagen,美国)的sali及xhoi限制酶切位(委托genedirex进行接合)，获得质粒序列编号2(seqidno.2)包含有序列编号1(seqidno.1)。

序列编号1(seqidno.1)

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序列编号2(seqidno.2)

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实施例2转化和表达

2.1转化

将建构好的质粒(序列编号2)取3μl与100μl的大肠杆菌感受态细胞(e.colic43(de3))混合，置于冰上30min，之后将混合的质粒及感受态细胞置于42℃恒温水浴中热休克90s，再置于冰上10min，于混合物中加入lb液体培养基1ml，放入37℃培养1小时，取出培养后的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的lb平板培养基进行筛选及蛋白质表达。

2.2抗真菌蛋白表达及纯化

将序列编号2表达质粒转化入e.colic43(de3)的菌株，以lb培养基培养过夜，再将其稀释50倍转入lb培养基至od600达到约0.6，之后利用异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-thiogalactoside，iptg)(0.5mm，最后浓度)诱导基因表达，于25℃下培养24小时，以离心的方式收集菌体。将得到的菌体回溶于nativebuffer(50mmnah2po4,500mmnacl,ph7)，并以超声波加以震碎破坏细胞，再以离心方式取得上清液，之后根据ni-ntapurificationsystem(invitrogen,美国)流程，以含有镍离子的树脂进行蛋白质纯化，纯化后得到的蛋白质再利用sds-page进行分析，并以考马斯蓝(coomassiebrilliantblue)染色。

实施例3蛋白质透析及浓缩

将纯化好的蛋白质置入透析袋中(6dialysismembrane,1kda)(生工生物工程股份有限公司，上海，中国)，透析袋放入烧杯，并加入2公升透析液(25mmnah2po4,250mmnacl,ph7)，每隔12小时更换一次透析液，共透析2天的时间，以去除纯化过程中含有的咪唑(immidazole)。透析完的蛋白质以冷冻干燥的方式进行浓缩。

实施例4抗真菌能力分析

利用纸片扩散法(discdiffusionmethod)针对真菌paecilomycesformosus(gim3.612)进行分析，评估其抑制真菌功效。真菌以马铃薯葡萄糖肉汤培养基(potatodextrosebroth,pdb)于室温下进行培养，真菌培养两天后，将培养液涂抹于马铃薯葡萄糖固体培养基(potatodextroseagar,pda)，取出直径6mm大小的圆形纸片置于含有真菌paecilomycesformosus的pda培养基上，把纯化后的抗真菌蛋白质加入直径6mm圆形纸片中于室温下继续培养，观察抑菌透明圈的形成。

结果见图4。可见，30ug即有抑菌效果。

序列表

<110>厦门医学院

<120>一种大量表达抗真菌蛋白的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>153

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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