番木瓜U6启动子基因及应用的制作方法

本发明属生物技术领域，涉及植物转基因技术领域，具体涉及番木瓜u6启动子基因的克隆和应用。

背景技术：

u6启动子是二型启动子，与真核生物rna聚合酶iii结合后，负责转录u6rna，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。u6启动子+1位是鸟苷酸。rna聚合酶iii启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有u6启动子，u6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带polya尾的序列，由rna聚合酶iii聚合u6启动子转录产生shrna,经剪切后产生成熟sirna，产生干扰效果；shrna的表达量取决于启动子的强弱，与同类的rna聚合酶iii的启动子h1相比，u6启动子启动能力更强，表达时间也长。

目前，在转基因技术领域，u6启动子多用在构建rnai表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，u6启动子也被开始广泛用于crispr/cas9系统中sgrna引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。u6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的u6启动子能取得更高的的启动效率。

前人研究表明，人u6启动子有几个明显的特点：1、具有tatabox，位于-30～-25bp，被poliii转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在近端序列元素pse(proximalsequenceelement)，该元件是snrna激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在远端序列元素dse(distalsequenceelement)；4、启动子下游存在5'-tttt-3'序列为poliii提供转录终止信号；5、pse和dse之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的g对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用u6启动子构建rnai表达载体时，u6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变pse和dse的间距，同时保留tatabox和+1位的g，在下游应有5'-ttttt-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。

番木瓜(caricapapaya)是中国和其它世界热带地区最重要的消费和出口热带水果之一，被世界卫生组织列为最有营养价值的十大水果之首。目前是世界上产量增幅最大的热带水果，年增长率达4％，已成为第四大热带、亚热带畅销水果。以prsv和番木瓜畸叶嵌纹病毒(papayaleaf-distortionmosaicvirus,pldmv)为代表的rna病毒是番木瓜生产上的最大限制因子，不抗病的品种几乎绝产，在物理和化学防治措施效果不佳与抗性品种缺乏的情况下，现代生物技术方法被大量引入prsv的防治工作。1998年抗prsv转基因番木瓜彩虹(rainbow)和日升(sunup)品种开始商业化应用，这代表第一次实际应用的转基因水果作物。番木瓜起源于南墨西哥和中美洲，属番木瓜科(caricaceae)，番木瓜属(caricapapayal.)，番木瓜科分为6个属35种(rayetal.,2014)，番木瓜属中没有找到抗病种质，几种野生型番木瓜比如c.cauliflora,c.pubescens，c.quercifolia对prsv有抗性，但它们与caricapapaya杂交不亲和。目前，实际利用的番木瓜抗病毒基因多数是来自病毒本身的基因，抗病策略主要利用rnai干扰的原理，u6启动子能很高效的启动转基因株系的rnai干扰，但u6启动子具有种属特异性，在番木瓜转基因技术中，最好使用番木瓜本身或接近物种的u6启动子，这样能取得更高的的启动效率。

番木瓜基因组小(372mb)，二倍体，生命周期短，产种子量高，树体不高，基因转化效率高，是理想的热带模式植物，对热带作物生物技术的研究越来越重要。目前还没有研究报道番木瓜u6启动子的克隆与应用。因此，番木瓜u6启动子的克隆和应用，必将推进这些植物相关技术领域的研究，具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了番木瓜u6启动子基因，通过gus染色瞬时表达验证，番木瓜u6启动子基因能高效的在番木瓜上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于番木瓜，用于启动功能基因表达，更可在植物转化时启动rnai发夹结构，在crispr/cas9系统中启动sgrna引导序列等特殊结构的表达等。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供番木瓜u6启动子基因，包括两种番木瓜u6启动子基因，分别具有序列表中seqidno:1、seqidno:2所示的核苷酸序列。

该两种启动子基因序列还包括含有如seqidno.1、seqidno.2所示基因序列的其它序列。

启动子序列来自于番木瓜supercontig_179染色体。

本发明的另一目的在于提供番木瓜u6启动子基因在转基因技术领域中的应用。

本发明利用snrna序列在真核生物体内非常保守的序列特征，用拟南芥atu6启动子的snrna序列与番木瓜的基因组(caricapapayaasgpbv0.4)序列进行比对，通过比对序列结果设计多对引物，pcr克隆出番木瓜的2种u6启动子，并构建与gus基因融合表达载体转化番木瓜胚性愈伤，gus染色瞬时表达验证表明，克隆出的2种番木瓜u6启动子在番木瓜上具有很强的启动效率，能在番木瓜上很好的启动gus基因的表达。

附图说明

图1：从番木瓜dna上克隆出2种u6启动子序列。

图2：从番木瓜k、l序列上pcr出构建gus融合表达载体具有粘性末端的2种u6启动子序列。

图3：用于转化的pzmubi-gus(zmubis-hph)质粒载体图。

图4：用于转化的pcau6k-gus(cau6k-hph)质粒载体图。

图5：用于转化的pcau6l-gus(cau6l-hph)质粒载体图。

图6：番木瓜胚性愈伤转化pzmubi-gus、pcau6k-gus、pcau6l-gus载体后gus表达瞬时染色情况。ck是不经转化的愈伤，为空白材料，上排从左到右分别是农杆菌lba4404转化pzmubi-gus、pcau6k-gus、pcau6l-gus的情况，下排左到右分别是农杆菌gv3101转化pzmubi-gus、pcau6k-gus、pcau6l-gus的情况。

图7：pcau6k-gus、pcau6l-gus、pzmubi-gus载体转化番木瓜胚性愈伤后不同启动子、不同农杆菌gus瞬时表达差异性分析。l是pcau6l-gus载体染色情况，k是pcau6k-gus载体染色情况，ubi是pzmubi-gus载体染色情况。a以农杆菌gv3101进行转化，l、k与对照ubi启动子启动能力差异不显著；b以农杆菌lba4404进行转化，l、k与对照ubi启动子启动能力差异不显著；c启动子l在农杆菌gv3101和lba4404分别转化条件下，在5％显著水平，lb4404表达水平显著高于gv3101；d启动子k在农杆菌gv3101和lba4404分别转化条件下，差异不显著；e启动子ubi在农杆菌gv3101和lba4404分别转化条件下，差异不显著。

具体实施方式

番木瓜u6启动子的克隆和功能验证方法，其具体步骤如下：

1、利用u6启动子snrna序列的保守性，在https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥atu6启动子的snrna序列

(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与番木瓜的基因组(caricapapayaasgpbv0.4)序列进行比对(blast)。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95％的位置(contig_26951，supercontig_43，supercontig_179，supercontig_40)，下载这些位置的序列信息，并在http://seqtool.sdsc.edu/cgi/bw.cgi#！网站上对挑选出的序列进行boxshade(盒式)序列分析比对，找到这些启动序列的use位置和tata框位置。

2、番木瓜u6启动子的pcr克隆：在下载的u6启动序列use和tata框位置前寻找和设计引物，引物设计参考http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/网站，尽量选择能区别克隆目标启动序列的引物对。然后以番木瓜sunrise品系dna为模版，pcr克隆目标启动序列，pcr后跑胶观察，回收通过pcr克隆出的目标条带进行测序比对。最后能克隆出启动子序列，测序后符合预期启动序列的启动子序列位于supercontig_179染色体的不同位置上，克隆出启动子序列的位置、引物对及序列大小(见表1)。pcr试剂购于bbi生命科学有限公司，反应条件：95℃5min，94℃30s，53℃45s，72℃1min，32循环，72℃5min，4℃保存。

表1：克隆出番木瓜2个u6启动子的引物序列及克隆位置与大小

3、番木瓜u6启动子与gus基因融合植物表达载体构建：以带gus基因的pzmubi-gus(zmubis-hph)质粒(见图1)为骨架质粒(hygr植物筛选基因，kanr菌落筛选基因)，质粒由美国donalddanforthplantsciencecenter的thomasp.brutnell实验室提供；以表1克隆的papaya179-1(k)和papaya179-2r(l)u6启动子序列为模版，设计带骨架质粒gus基因启动子粘性末端的引物对(见表2)pcr克隆目标启动子序列，通过酶切连接将质粒gus基因前的zmubi启动子替换为克隆的番木瓜u6启动子，构建番木瓜u6启动子与gus基因融合植物表达载体。图4为用于转化的pcau6k-gus(cau6k-hph)质粒载体图。图5为用于转化的pcau6l-gus(cau6l-hph)质粒载体图。融合植物表达载体通过dna测序检测目标启动序列构建情况。pcr使用北京博迈德生物技术有限公司的2×taqpcrmastermix，反应条件：94℃3min，94℃30s，50℃30s，72℃1min，34循环，72℃5min，4℃保存。

表2：番木瓜2个u6启动子与gus基因融合表达载体的构建引物及克隆位置与大小

4、番木瓜u6启动子农杆菌转化验证：将u6启动子与gus基因融合植物表达载体pcau6k-gus(见图2)，pcau6l-gus(见图3)，以及对照质粒pzmubi-gus(zmubis-hph)转化到农杆菌lb4404或gv3101菌株，以番木瓜幼苗茎段诱导的胚性愈伤为转化外植体材料，进行农杆菌转化，共培养6天后取出胚性愈伤进行gus染色观察，从gus基因的gus染色表达情况评估克隆的u6启动子的启动能力和表达活性。gus染色液按照常规方法配制x-gluc母液和x-gluc基液，然后按比例混合后储存于4℃冰箱备用，取用于检测的组织块，加入gus染色液中37℃过夜染色，倒掉染色液，70％酒精脱色1～3次，95％的酒精脱色1～2次，观察gus染色情况(见图6)。最后收集胚性愈伤在体视显微镜下观察拍照。同时，取同等重量的每种愈伤gus染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值(见表3)。数据、图标处理在excel2010下进行,通过sigmaplot10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。从分析结果可知，以农杆菌gv3101进行转化，目标载体启动子l、k与对照ubi启动子启动能力差异不显著(图7a)；以农杆菌lba4404进行转化，目标载体启动子l、k与对照ubi启动子启动能力差异不显著(图7b)；启动子l在农杆菌gv3101和lba4404分别转化条件下，在5％显著水平，lb4404表达水平显著高于gv3101(图7c)；启动子k在农杆菌gv3101和lba4404分别转化条件下，差异不显著(图7d)；启动子ubi在农杆菌gv3101和lba4404分别转化条件下，差异不显著(图7e)。

表3pcau6l-gus、pcau6k-gus、pzmubi-gus载体转化番木瓜胚性愈伤后gus瞬时表达染色液od620测定

备注：l是pcau6l-gus载体染色情况，k是pcau6k-gus载体染色情况，ubi是pzmubi-gus载体染色情况。

本发明第一次克隆了番木瓜u6启动子，并在番木瓜上验证了其启动功能，为番木瓜及相近物种转基因研究提供了很好的启动子工具。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>番木瓜u6启动子基因及应用

<160>2

<210>1

<211>212

<212>dna

<213>番木瓜(caricapapaya)的u6启动子基因序列

<400>1

cgggcatctaccattagttattagttattcatgtttatgggcgaacaacgggaattaaac60

ctacacgtggttatagcgtttgttttttcgcatccgattttgtctgcatcggccggtggc120

cgaatttatggaacgcccacagaaatcgtcccacaatgtttagggccaaagaaaatctaa180

gctttatataaggtatctccgcttctccaata212

<210>2

<211>703

<212>dna

<213>番木瓜(caricapapaya)的u6启动子基因序列

<400>2

gggtagtttattctctctggtgagtgaagccacttgctttattcaggacgattgtttgga60

ttgtttttcctcccgattgaacctactcaacgcgccgtggtcgtcgtgtttttggtccta120

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