芝麻抗旱基因SiSAM1及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及芝麻抗旱基因sisam1及其应用。

背景技术：

芝麻(sesamumindicuml.)是重要的油料作物，主要分布在北纬40°到南纬40°的热带和亚热带地区。由于芝麻种子具有很高的营养价值(含油量在40％-62.7％；蛋白质含量在19％-30％)，所以芝麻有“油料皇后”的美称。芝麻是我国五大油料作物之一，是传统特色农产品。我国是作为主要生产国和贸易国，年消费量居世界之首，但是，自给不足50％，且进口率逐年上升。

芝麻由于受到生物和非生物逆境胁迫的共同作用，每年的产量低且不稳定，这也是芝麻产业发展的重大瓶颈问题。芝麻主要种植在干旱和半干旱地区，容易遭受极端和间歇性的干旱胁迫，难以获得稳定且较高的产量，同时干旱胁迫对芝麻品质也有很大的影响。近年来我国芝麻生产旱害发生不断加重，造成减产严重。黄淮和长江流域芝麻主产区，容易在芝麻盛花期和终花期发生持续干旱，对芝麻生长发育和产量造成严重影响。我国西部、东北芝麻春播区和长江以南秋播区，常年遭受干旱威胁，影响产量。此外，在印度、缅甸、苏丹、埃塞俄比亚、尼日利亚、泰国、土耳其等非洲和南亚等大多数国家的芝麻生产地区，干旱是最大的危害因素。因此，在干旱胁迫环境下获得高且稳的产量，需要抗旱基因型，通过提高芝麻抗旱能力，促进高产稳产，对促进我国芝麻生产发展、解决总量自给不足问题十分必要。芝麻抗旱性的研究比较薄弱，研究报道主要集中在干旱对芝麻植株形态、产量性状、品质性状及生理生化的影响，分子相关研究较少。

因此，迫切需要发掘一种芝麻抗旱基因，从而为开展芝麻抗旱性分子育种，以提高芝麻抗旱能力的重要基础和可靠途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了芝麻抗旱基因sisam1及其应用，该基因sisam1可用来提高植物的抗旱能力以便用于油料作物抗旱品种的选育，由此来提高作物抗旱性，保证作物高产稳产。

为实现上述目的，本发明是这样实现的：

在本发明的第一方面，提供了一种芝麻抗旱基因sisam1，所述芝麻抗旱基因sisam1为如seqidno:1所示的核苷酸序列；或者为seqidno:1所示的核苷酸序列经过添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的具有抗旱性的核苷酸序列。

本发明的芝麻抗旱基因sisam1是由申请人基于芝麻全基因组测序、进行大量生物信息学分析筛选获得的。申请人将其命名为芝麻抗旱基因sisam1。

在本发明的第二方面，提供了所述的芝麻抗旱基因sisam1所编码的芝麻sisam1蛋白，该蛋白为如seqidno：2所示的氨基酸序列；或者为与seqidno.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性且具有抗旱性的氨基酸序列。

在本发明的第三方面，提供了所述的芝麻抗旱基因sisam1的重组载体。

所述重组载体包括克隆载体或表达载体。其中本发明具体提供一种表达载体，所述的表达载体通过pcambia1301s载体构建成pcambia1301s-sisam1载体。

在本发明的第四方面，提供了一种所述重组载体的转化体。

在一些实施例中，所述转化体为根癌农杆菌、和/或植物细胞(或生物体)；所述生物体为转基因抗旱植物，为水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、大豆、高粱、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、甘蔗、或甜菜中之一，其中优选为芝麻。

在本发明的第五方面，提供了芝麻抗旱基因sisam1在提高植物抗旱性中的应用。

在本发明的第六方面，提供了所述的重组载体在提高植物抗旱性中的应用。

在本发明的第七方面，提供了所述的转化体在提高植物抗旱性中的应用。

本发明将sisam1基因构建到表达pcambia1301s载体(pcambia1301s是在国际上常用的植物遗传转化载体pcambia1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的花椰菜花叶病毒camv35s启动子的遗传转化载体)。通过农杆菌介导的转化方法，将pcambia1301s携带的sisam1基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。实验结果表明，sisam1具有提高植物抗旱性的作用。

本发明具有的有益效果是：

本发明提供的芝麻抗旱基因sisam1是国内外首次报道，本发明将sisam1基因构建到表达pcambia1301s载体，通过农杆菌介导的转化方法，将pcambia1301s携带的sisam1基因转入拟南芥，获得转基因拟南芥；将转基因拟南芥以及非转基因拟南芥(受体对照)同时模拟干旱(18％的peg6000)胁迫17天后，转基因拟南芥与非转基因拟南芥(受体对照)相比，sisam1的表达有很大程度的提高，且转基因拟南芥的抗旱能力也大大提高。结果表明过量表达sisam1基因的转基因植株在干旱胁迫下抗逆性增强。因此该芝麻抗旱基因sisam1的过量表达可用来提高植物的抗旱能力以便用于油料作物抗旱品种的选育，由此来提高作物抗旱性，保证作物高产稳产。

附图说明

图1为含sisam1基因的植物表达pcambia1301s-sisam1载体的构建；

图2为pcambia1301s-sisam1载体酶切图(m1：1kbdnaladder；m2：2000dnamarker；3-4：pcambia1301s-sisam1载体酶切片段)；

图3转sisam1基因拟南芥t1代阳性植株的筛选结果示意图；

图4转sisam1基因拟南芥t1代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-6：转基因t1代植株)；

图5转sisam1基因拟南芥t2代阳性植株的筛选结果示意图；

图6转sisam1基因拟南芥t2代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-10：转基因t2代植株)；

图7转sisam1基因拟南芥t2代植株定量表达验证结果图；

图8土壤干燥法测定转sisam1基因拟南芥t2代植物的抗旱性。

具体实施方式

实施例1芝麻抗旱基因sisam1基因的获得

一、芝麻抗旱基因sisam1的发现

1、从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据抗旱相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了抗旱性不同的400份芝麻材料进行重测序分析；

2、利用illuminahiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对400份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；

3、结合种质资源抗旱群体中的抗旱相关性状数据、基因型数据和群体结构，采用emmax软件包和peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在p＝10-8.86水平检测到1个位于8号连锁群上16465126的位置与干旱胁迫下的芝麻存活株率显著关联的标记位点；

4、通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比对和基因注释分析，发现显著关联标记位点落在sin_1022789基因内部，推测该基因可能与芝麻抗旱相关，命名为sisam1。

二、芝麻根系rna的提取和芝麻抗旱基因sisam1的克隆

1、根系rna提取采用改进的ctab法，cdna的合成按照takara公司反转录合成试剂盒说明书步骤进行。根据sisam1基因的cds序列，利用primer5.0设计可以扩增其完整cds序列的引物，引物序列(包含修饰碱基)及名称如下：sisam1-f：5’-gctttcgcgagctcggtaccatggagaccttcttgtttac-3’(如seqidno.3所示)

sisam1-r：5’-cgactctagaggatccttagttctggggcttctccc-3’(如seqidno.4所示)；

2、取初花期抗旱种质zzm1805干旱胁迫5天后的叶片，提取根系总rna，逆转录生成cdna，以反转后的cdna为模板，利用所述的引物对sisam1-f/r进行rt-pcr扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得提高芝麻抗旱能力的sisam1基因序列，如seqidno.1所示。

实施例2sisam1基因过表达载体的构建与遗传转化

一、过表达载体的构建

将实施例1克隆得到的抗旱相关的芝麻基因sisam1利用同源重组的方法与pcambia1301s(本实验室提供)质粒连接构建植物表达载体，命名为pcambia1301s-sisam1(图1)，具体操作如下：

1、首先利用双酶切(bamhi和kpni)(takara)方法获得线性化载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化获得高纯度线性化载体。

2、将目的片段dna和线性化载体以3:1的摩尔比加到1.5ml的离心管中进行重组反应，混匀后在37℃放置约30min，加入10μl的反应液到50μl的dh5a感受态细胞中，用移液器轻轻混匀，于冰上孵育20min，42℃水浴中热激45秒后快速置冰上冷却2min。

3、加入300μllb液体培养基，37℃孵育45-60min。5,000rpm离心2min收集菌体，弃掉部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有kan抗性的lb固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16-24h。

4、挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定为阳性的菌落，挑取相应单菌落于含有kan抗生素的液体lb培养基中37℃、200rpm培养箱中培养过夜，提取质粒或将菌液直接测序以及通过酶切电泳(图2)来鉴定载体准确性。

二、遗传转化

将步骤1)中制备的pcambia1301s-sisam1载体转入根癌农杆菌lba4404(上海唯地生物技术有限公司)，再导入拟南芥植株中，具体操作如下：

1、重组载体转入农杆菌lba4404：

(1)每100μllba4404农杆菌感受态细胞中加入2μg质粒dna，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

(2)加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养5h。6000rpm离心1min收集菌体，留取100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有kan和rif的lb固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天，挑取若干个阳性克隆利用菌落pcr简单验证结果。

2、拟南芥的平板培养：

(1)根据实验需要数出一定数量的拟南芥种子装于无菌的1.5ml离心管中。加入1ml75％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，重复1次。放入37℃200rpm摇床中摇10min表面灭菌。

(2)弃75％乙醇，加入1ml95％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，并重复1次。在超净工作台中，向各管种子加入300-500μl无水乙醇，用1ml移液器将种子和乙醇一同喷洒到无菌滤纸上。

(3)待乙醇挥发完，用牙签将拟南芥种子点种于准备好的平板上。将平板封口，黑暗条件下倒置于4℃春化48h，春化结束后，将平板置于光照培养箱中竖直培养，出苗一周后即可移栽。

(4)用镊子将幼苗栽入小盆的土中，先用保鲜膜保湿24h，置于植物生长间中培养直至拟南芥生长抽薹时(约一个月)，用于转化实验。

3、遗传转化：

(1)农杆菌活化：在20ml的lb液体培养基中分别加入20μlrif和kan，摇匀并接菌，28℃220rpm震荡活化8-10h。

(2)农杆菌扩大培养：在200ml的lb液体培养基中分别加入200μlrif和kan，再加入5-10ml的活化菌液，28℃220rpm震荡培养14-16h，至od值1.6-2.0，4500rpm离心10min，沉淀菌体弃上清，自然晾干。

(3)在沉淀菌体中加入100ml5％蔗糖溶液重悬菌体，移液器吹打均匀、重悬菌体。将离心瓶中菌液加到平皿中，再加入100ml5％蔗糖溶液，转化前加入40μlsilwet-l-77(0.02％)，晃动平皿混匀。

(4)将拟南芥花序合拢，浸入平皿，轻轻晃动15s。转化完后搅匀菌液；用黑袋子将植株套好，避光保湿24h。一周后再重复转化一次。

三、超表达植株的筛选与鉴定

1、筛选t1代阳性植株。

种植拟南芥t0代所收获的种子，将t0代种子消毒，接种含30mg/l潮霉素的ms筛选培养基(添加25mg/l头孢霉素抑菌)上22℃光照培养7-10天，筛选获得阳性植株(幼苗和根系都正常生长的植株)(图3)，本实验获得6个阳性株系，将阳性苗移栽到土壤中，用保鲜膜盖上2-3天后揭膜，然后正常生长。筛选出的阳性植株的叶片dna提取后，利用pcr方法鉴定sisam1基因，进行转基因植株的目的基因的分子验证(图4)，最终确认基因已经转入t1代阳性植株。

2、转基因植株t2代阳性检测

将t1代阳性植株进行单株收种获得t1代种子，继续进行潮霉素筛选获得t2代阳性植株(幼苗和根系都正常生长的植株)(图5)，获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组dna进行pcr分子鉴定(图6)，确定t2代阳性植株。

3、转基因植株t2代阳性植株定量表达验证

取转基因植株t2代阳性植株和野生型拟南芥植株生长时期的幼嫩叶片，用rna提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取叶片总rna，然后用反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)获得cdna，以各自cdna为模板，以拟南芥β-actin为内参，进行qrt-pcr表达验证(qrt-pcrmix：南京诺唯赞生物科技有限公司；仪器：roche480)。

其中拟南芥β-actin内参的qrt-pcr引物对为：

af：5’-cccgctatgtatgtcgcca-3’(如seqidno.5所示)；

ar：5’-aaccctcgtagattggcacag-3’(如seqidno.6所示)，

目标基因定量qrt-pcr引物对为：

samf：5’-gcccaccaatgacaaacc-3’(如seqidno.7所示)；

samr：5’-tctccacccagcacgatg-3’(如seqidno.8所示)。

结果表明以未转基因的野生型拟南芥为对照，芝麻sisam1基因在检测的3个拟南芥转基因株系的叶片中表达量显著提高，而在未转基因对照拟南芥的叶片中，没有检测到芝麻sisam1基因的表达(图7)。表明芝麻的sisam1基因均转化并插入到了相应拟南芥基因组中并得到了表达。

实施3sisam1超量表达转基因t2代家系阳性植株抗旱性能的测定

选取了3株实施例2中sisam1基因超量表达转基因t2代家系植株进行了干旱胁迫实验。具体步骤如下：在营养钵中每份材料种植3株(待t2代转基因植物生长至3对叶时期)以及未转基因野生型拟南芥植株3株，当植株开始孕穗时，断水进行干旱胁迫17天，然后观察转基因植株的生长状况。

结果表明，本发明克隆的sisam1基因超表达的3个转基因植株的生长在正常条件下与对照株生长状况相比稍好但差别不大很大，但在逆境胁迫处理后，对照非转基因植株明显地先于转基因植株发生萎蔫；持续干旱17天后用自来水灌溉，sisam1基因转基因植株能够恢复生长；而非转基因植株生长受到明显抑制。本发明所获得的转sisam1基因拟南芥株系抗旱能力明显高于野生型拟南芥对照(图8)，表明基因sisam1的过量表达可以提高植物的抗旱能力

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>芝麻抗旱基因sisam1及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1182

<212>dna

<213>芝麻(sesamumindicum)

<400>1

atggagaccttcttgtttacctctgaatctgttaacgagggacaccctgacaagctctgt60

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agtggtgcctatatcgttaggcaggcagccaagagcattgtggccaacggccttgctcgc900

aggtgcatagtacaagtctcatacgcaattggtgtgcctgagccgttatctgttttcgtc960

gacacttacggcacggggaagatcccagacaaggaaatcctcaagattgtgaaggagaac1020

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cggttcttgaaaacagctgcatacggtcactttggaagagacgaccccgacttcacatgg1140

gaagtcgttaagcccctcaaatgggagaagccccagaactaa1182

<210>2

<211>393

<212>prt

<213>芝麻(sesamumindicum)

<400>2

metgluthrpheleuphethrsergluservalasngluglyhispro

151015

asplysleucysaspglnileseraspalavalleuaspalacysleu

202530

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

aspleulysgluhisvalilelysprovalileproalalystyrleu

210215220

aspglulysthrilephehisleuasnproserglyargphevalile

225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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325330335

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355360365

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370375380

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385390

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gctttcgcgagctcggtaccatggagaccttcttgtttac40

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aaccctcgtagattggcacag21

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gcccaccaatgacaaacc18

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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