一种转基因小鼠基因型的快速鉴定方法与流程

本发明涉及基因工程的
技术领域：
，具体而言，涉及一种转基因小鼠基因型的快速鉴定方法。技术背景转基因动物技术是指通过人工操作的方式，将外源基因整合到动物的基因组内，使该转基因动物能稳定地将此基因遗传给后代的一种实验技术。进入21世纪以来，生物技术迅猛发展，转基因小鼠的基因修饰技术线路日趋成熟，又因其与人类亲缘关系较近、饲养成本较低、繁殖周期短的优势，转基因小鼠已成为目前最常用的构建人类疾病模型的动物模型，广泛应用于生物学、免疫学、制药等领域，并成为了机理探讨、药物筛选及基因治疗等的重要有力工具。由于转基因小鼠是通过基因修饰的方法获得可稳定遗传的实验模型，在应用转基因小鼠开展科学研究前，通常需要对小鼠的基因型进行鉴定，区分转基因小鼠以及野生型小鼠。转基因小鼠基因型鉴定，涉及小鼠dna的获取、目标dna片段的pcr扩增及dna凝胶电泳等过程。目前传统的dna提取方法包括酚/氯仿提取法和高盐提取法。这些方法虽然能够获取较高纯度和较高得率的组织dna，但存在操作步骤繁琐(需多次离心)、耗时过长(有些操作步骤需过夜处理)、涉及多种试剂(均采用了氯仿、乙醇、蛋白酶k等试剂)等不足之处；另外，一些市面现有的组织dna提取试剂盒(如takara、promega及vazyme等公司的试剂盒)也需耗费大量收集柱、多种试剂(如裂解液、中和液、蛋白酶k等)和多次离心，且dna提取过程(即模板制备)所花时间也至少在45min到数小时之间。上述问题都在一定程度上增加实验成本(包括试剂成本、耗材成本和人力成本)，从而制约了转基因小鼠基因型鉴定的工作效率。技术实现要素：本发明的目的就是克服现有技术中的上述不足和缺陷，提供一种快速、高效、简易的转基因小鼠基因型的鉴定方法。本发明自主研发的组织裂解液在95℃水浴或金属浴中消化鼠尾组织5-10min，可迅速释放组织中的基因组dna，无需抽提与纯化，裂解产物直接可以用于pcr扩增，极大减少了提取dna的步骤和dna的获取时间，即使得转基因小鼠鉴定模板制备的总时间缩短至10-15min。然后使用pcr预混合溶液2×pcrmastermix(withdye)及本发明方法优化的实验体系和条件，可快速高效的对转基因小鼠进行基因型鉴定，极大的提高了实验的效率。本发明的特点和优势是pcr鉴定模板制备的时间仅需10-15min且操作简单，市面上一些的其他试剂盒模板制备的时间均较长，如vazyme公司的onestepmousegenotypingkit，模板制备过程包括加组织裂解液、涡旋震荡后在55℃水浴中孵育20-30min、孵育完成后将样品置于95℃或者沸水浴中加热5min灭活proteinasek、再将裂解产物涡旋震荡充分混匀后12000rpm离心5min，模板制备时间至少在45min以上；又如takara公司的takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0，其组织裂解及dna纯化过程涉及加多种试剂、多次静置离心，整个模板制备时间需2小时以上。另外，本发明对不同类型(完全敲除、条件性敲除、定点敲入、随机敲入等)的转基因小鼠均有非常好的鉴定效果，后面具体鉴定实例可说明。本发明所采取的技术方案为：一种转基因小鼠组织dna提取及基因型鉴定的方法，包括以下步骤：1)剪取转基因小鼠组织置于干净的ep管，取样量如下：鼠耳：打直径3mm的圆孔或者剪下近似大小的耳朵鼠趾：约2mm长左右的脚趾(不含指甲的长度)鼠尾：约2mm的尾尖2)向每个含有样本的ep管中加入100μlsg1buffer，95℃水浴或金属浴中消化5-10min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组dna已经释放，不影响后续的pcr实验；3)消化后冷却至室温，然后向每个ep管中加入8.6μlsg2buffer，轻弹ep管3-4次混匀，8000g离心3min，取上清作为pcr的模板。4)按照以下体系及条件进行pcr反应：pcr体系组分体积ddh2o8μl引物1(10μm)0.5μl引物2(10μtm)0.5μl裂解液模板1μl2xpcrmastermix10μl总体积20μlpcr扩增条件5)pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。下面通过鉴定实例来说明本发明的应用实施案例1b6.129s-sftpctm1(cre/ert2)blh/j转基因小鼠的鉴定b6.129s-sftpctm1(cre/ert2)blh/j转基因小鼠的鉴定，具体实施方法如下：1)剪取约2mm的b6.129s-sftpctm1(ere/ert2)blh/j转基因小鼠鼠尾置于干净的ep管；2)向ep管中加入100μlsg1buffer，置于95℃金属浴中消化5min；3)消化后冷却至室温，然后向每个ep管中加入8.6μlsg2buffer，轻弹ep管3-4次混匀，8000g离心3min，取上清作为pcr的模板；4)使用以下鉴定引物进行pcr鉴定5)按照以下体系和条件进行pcr扩增pcr体系组分体积ddh2o7μl13007引物(10μm)0.5μl24999引物(10μm)1μl25000引物(10μm)0.5μl裂解液模板1μl2xpcrmastermix10μl总体积20μlpcr扩增条件6)将上面获得的pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。实施案例2rbpj基因条件性敲除小鼠的鉴定rbpj基因条件性敲除小鼠的鉴定，具体实施方法如下：1)剪取约2mm的rbpj基因条件性敲除小鼠鼠尾置于干净的ep管；2)向ep管中加入100μlsg1buffer，置于95℃金属浴中消化5min；3)消化后冷却至室温，然后向每个ep管中加入8.6μlsg2buffer，轻弹ep管3-4次混匀，8000g离心3min，取上清作为pcr的模板；4)使用以下鉴定引物进行pcr鉴定5)按照以下体系和条件进行pcr扩增pcr体系pcr扩增条件6)将上面获得的pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。实施案例3xm200862ctsk-egfp-p2a-icre转基因小鼠鉴定xm200862ctsk-egfp-p2a-icre转基因小鼠的鉴定，具体实施方法如下：1)剪取约2mm的xm200862ctsk-egfp-p2a-icre转基因小鼠鼠尾置于干净的ep管；2)向ep管中加入100μlsg1buffer，置于95℃金属浴中消化5min；3)消化后冷却至室温，然后向每个ep管中加入8.6μlsg2buffer，轻弹ep管3-4次混匀，8000g离心3min，取上清作为pcr的模板；4)使用以下鉴定引物进行pcr鉴定5)按照以下体系和条件进行pcr扩增pcr体系组分体积ddh2o8μlctsk-tg-3tf1引物(10μm)0.5μlctsk-tg-3tr1引物(10μm)0.5μl裂解液模板1μl2xpcrmastermix10μl总体积20μlpcr扩增条件6)将上面获得的pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。附图说明图1为b6.129s-sftpctm1(cre/ert2)blh/j转基因小鼠鉴定的凝胶电泳图1)marker条带大小从上至下：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp2)8个样品均扩增出210bp和327bp条带，鉴定结果为杂合子图2为rbpj基因条件性敲除小鼠鉴定的凝胶电泳图1)marker条带大小从上至下：1500bp\1000bp\900bp\800bp\700bp\600bp\500bp\400bp\300bp\200bp\100bp2)鉴定结果：基因型小鼠编号阴性鼠(wt)4，5，6，7杂合子(flox/+)1，3，8，11，13，15纯合子(flox/flox)2，9，10，12，14，16图3为xm200862ctsk-egfp-p2a-icre转基因小鼠鉴定的凝胶电泳图1)marker条带大小从上至下：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp2)鉴定结果：xm200862ctsk-egfp-p2a-icre转基因小鼠阳性小鼠编号：22，23，24。当前第1页1 2 3