多重检测EGFR基因突变的试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及多重检测egfr基因突变的试剂盒及方法。
背景技术：
：肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(nsclc)数量约占所有肺癌患者的85％，晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率约为15％。随着技术的发展，肿瘤中发生的基因突变越来越受到人们重视，非小细胞肺癌具有高度的异质性，导致其临床表现及治疗效果极其多样化。表皮生长因子受体(egfr)是一种跨膜蛋白，广泛分布于细胞膜上，为受体酪氨酸激酶家族成员之一。egfr与表皮生长因子(egf)的结合可启动细胞核内相关基因，从而促进细胞分裂增殖。egfr存在于大多数细胞中，对肿瘤细胞的生长、繁殖、转移、新血管生成、浸润等起到重要作用，在非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中均有表达。根据2018年美国国立综合癌症网络(nccn)肺癌治疗指南，建议对非小细胞肺癌患者egfr等基因的基因突变进行检查，这些基因的突变状态，与靶向药物的疗效息息相关，对多基因进行联合检测可进一步提高预测预后的准确性，对肺癌患者进行靶向用药具有指导意义。目前基因突变常用的检测方法包括：sanger测序法、荧光pcr法、高分辨溶解曲线法、高通量测序法等。①sanger测序法：检测基因突变需要对待测样品扩增、纯化、测序、序列分析，过程操作繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高，并且由于自身的限制导致其灵敏度不高，仅可检测丰度超过20％的突变，假阴性较多。②荧光pcr法：目前常用的基因突变检测方法，检测灵敏度高，可检出样品中含量低至1％的突变基因，且大幅缩短目标产物的长度，可解决石蜡包埋组织样本提取的dna片段化的难题，从而获得较为准确的检测结果。荧光pcr法操作简单，能极大的避免扩增产物的污染。但该方法多用于检测单基因突变，多重基因检测在检测位点增多的同时设计难度成倍增加，因此虽然荧光pcr法拥有众多优点，但多重基因突变检测产品极少。③高分辨率溶解曲线分析(hrm)：基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于pcr扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确认具体位置，最终需要测序确认。④高通量测序法：高通量测序法价格昂贵，读长大约30-250bp，比sanger测序短，对序列拼接造成了负担，检测结果仍需要sanger测序验证，并且对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确性不够。高通量测序法操作繁琐，限制了测序速度。因此，本领域迫切需要开发能够有效检测肺癌患者egfr基因因突的技术以满足临床准确、快捷、低成本的需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种多重检测egfr基因突变的试剂盒及方法。在本发明的第一方面，提供了一种用于多重检测egfr基因突变的引物对集，所述引物对集包括：第一引物对组，所述第一引物对组包括如seqidno.:1所示的正向引物；和，如seqidno.:6所示的反向引物。在另一优选例中，所述第一引物对组还包括：seqidno.:2所示的正向引物；和/或，seqidno.:3所示的正向引物；以及，seqidno.:7所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：第二引物对组，所述第二引物对组包括如seqidno.:4所示的正向引物；和，如seqidno.:8所示的反向引物；和/或第三引物对组，所述第三引物对组包括如seqidno.:5所示的正向引物；和，如seqidno.:9所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对组包括：如seqidno.:1、seqidno.:2、和seqidno.:3所示的正向引物；以及，如seqidno.:6、和seqidno.:7、所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对组包括：如seqidno.:1、seqidno.:2、seqidno.:3、seqidno.:4、和seqidno.:5所示的正向引物；以及，如seqidno.:6、seqidno.:7、seqidno.:8、和seqidno.:9所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：第四引物对组(内标)，所述第四引物对组包括如seqidno.:13所示的正向引物；和，如seqidno.:14所示的反向引物本发明的第二方面，提供了一种多重检测egfr基因突变的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如seqidno.:10所示的第一突变探针，和/或核苷酸序列如seqidno.:11所示的第二突变探针，和/或核苷酸序列如seqidno.:12所示的第三突变探针。在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如seqidno.:15所示的内控探针。在另一优选例中，所述突变探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述突变探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述内控探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述内控探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述突变探针标记的荧光报告基团不同于所述内控探针标记的荧光报告基团。本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测egfr基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含seqidno.:1-15所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，使用pcr用缓冲液(buffer)配制所述引物探针混合液。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含dna酶系，所述dna酶系包括热启动酶、ung酶、和dntps。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性质控品。本发明的第四方面，提供了一种多重检测egfr基因突变的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测对象的dna样本；(2)制备pcr反应体系并进行pcr检测：其中，所述pcr反应体系包括：步骤(1)提供的所述dna样本、本发明第一方面所述的引物对、和本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述dna样本来自多种类型核酸样本，如血液游离核酸、石蜡包埋组织样本、胸腹水等。在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。在另一优选例中，所述pcr反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。在另一优选例中，所述pcr反应体系还包括dna酶系；和/或pcr用缓冲液。本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备pcr检测试剂盒，所述pcr检测试剂盒用于检测egfr基因突变。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1egfr基因g719a；g719c；g719s；l861q；s768i突变检测灵敏度图；图2实例3中临床样本检测结果典型阳性示例1；图3实例3中临床样本检测结果典型阳性示例2；图4对照共用下游引物1结果示意图；图5对照共用下游引物2结果示意图；图6对照共用下游引物3结果示意图；图7对照共用下游引物3组合成多重pcr体系结果示意图具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种多重检测egfr基因突变的试剂盒及方法，能够同时检测肺癌egfr基因的5种突变类型，本发明的方法和试剂盒具有检测过程简单、可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。本发明提供一种高特异性、高灵敏度的多重肺癌基因突变检测的引物、探针、试剂盒及引物分配方式。本发明通过荧光检测技术，利用新鲜组织样本、石蜡包埋组织样本或胸腹水、血浆样本进行基因突变的检测，具有取材便捷、高特异性、高灵敏度、检测结果重复性好、操作快捷简便等优点，一次性检测肺癌热点基因突变egfr基因的5种突变，大大缩短检测时间的同时，提高了灵敏性和准确性，提供了可靠便捷的检测方法。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。多重pcr多重pcr(multiplexpcr)，又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般pcr相同。影响多重pcr反应的因素有很多，比如：(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是dna聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行pcr反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方dna介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。本发明的目的在于提供能够检测肺癌egfr基因5种突变的pcr检测试剂盒。由egfr不同突变位点检测试剂和内控检测试剂组成。基因突变检测采用fam信号指示，内控检测采用vic信号指示。本试剂盒检测的突变类型如表1：表1试剂盒检测的所有突变类型信息*以上基因信息来源于cosmic数据库。本试剂盒组成详见表2和表3，可同时检测5种肺癌热点基因突变，简化操作，大大缩短检测耗时，对非小细胞肺癌个性化治疗具有指导意义。表2试剂盒组成试剂盒所需引物、探针序列如表3：表3引物、探针及序列号优选地，引物及探针序列长度为18-30个碱基；gc含量为40-60％，扩增序列长度为100-350bp；tm值控制在50-60℃。优选地，所述荧光基团为fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任意一种或组合多种，优选为fam荧光基因。优选地，所述淬灭基因选自mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3等任意一种或组合多种，优选为mgb淬灭基因。本发明的引物设计中，基本按照突变基因突变位置位于3'端第一个碱基，在3'端第2-6位适当引入错配，其余碱基与待测碱基互补，能够显著提高引物特异性。对特异性引物及探针经大量试验筛选，选出其中12条序列(包括引物和探针)，并对其进行组合、优化、验证，最终优选出组合后不会互相干扰、扩增效率高、特异性好的多重检测最优引探组合。本发明中，设计了共用上游、下游引物或探针，在识别多个突变位点的同时使用最少引物探针，节约成本。上述序列组合包含肺癌多重基因突变区域检测所需引物和探针，能够一次性完成5个基因位点的检测。本试剂盒另一方面提供一种用于检测肺癌基因的引物探针、反应体系、质控品：表4试剂盒其他组分优选地，buffer的组成为0.5-2mol/ltris-clph8.8、0.5-3mol/lkcl、0.1-1mol/l(nh4)2so4、0.5-2mol/lmgcl2，10-20％tween-20，最优选为1mol/ltris-clph8.8、1mol/lkcl、0.5mol/l(nh4)2so4、1mol/lmgcl2、20％tween-20。优选地，dna酶系的组成为热启动酶0.5-20u/μl、ung酶0.1-1u/μl、dntps5-25mm，最优选组成为热启动酶15u/μl、ung酶0.12u/μl、dntps15mm；添加了尿嘧啶dna糖基化酶，即udg/ung酶等防污染组分。本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)提取检测样本中的总核酸，包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、胸腹水或血浆等组织中2-100ng/μl的总核酸。(2)将酶系加入pcr反应管中，依次加入阴性质控品、检测样本核酸、阳性质控品。(3)实时荧光pcr反应，程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品信号最高荧光值1/20作为阈值线，结合ct值及荧光曲线判断检测结果。优选地，仅根据ct及荧光曲线判断检测结果，简化判定方法。本发明的有益效果在于：(1)本发明适用于新鲜组织、石蜡包埋组织、胸腹水及血浆等多种样本类型，并采用总核酸作为检测样本，相比传统方法，更加简便快捷，易于操作。(2)试剂采用预分装单管单人份，操作简单，直接添加酶系和样本便可进行检测。(3)采用特异性引物和新型探针技术，通过双荧光通道检测模式，设定内控基因检测vic信号，可以在检测突变的同时监控样本核酸质量，提高判定准确性。(4)设计共用的下游引物和探针，使得识别同样多的突变位点的同时，减少引物、探针的数量，有效节约成本。(7)同时检测5种dna碱基突变，且仅需110分钟即可完成，易于操作的同时有效缩短检测时长。(8)特异性强，100ng/μl野生型核酸不会产生非特异性信号。(9)灵敏度高，可以检出2ng/μl中1％的基因突变。(10)判定方法简便，根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品最高荧光值1/20作为阈值线，结合ct值及荧光曲线判断检测结果，易于理解，易于判定。本发明适用于对肿瘤患者egfr基因5种突变位点的检测，是探索非小细胞肺癌早期诊断与高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在新药研发过程中，使用本发明的检测方法获得用作中间结果的基因突变信息，这些基因突变信息可以作为公众健康管理之需，也可以用于egfr基因突变的研究及靶向新药研发。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例1本发明提出一种肺癌多重基因突变检测的方法、引物、探针及试剂盒。具体实施步骤如下：(1)待测样本核酸模板提取中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(组织样本可使用粤穗械备20170666号；胸腹水、血浆样本可使用粤穗械备20180628号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取。组织样本提取后的核酸稀释为浓度2-100ng/μl(胸腹水、血浆提取的核酸浓度不少于2ng/μl)，纯度应满足a260/a280比值范围在1.7-2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。(2)加样取dna酶系3μl加入pcr反应管中。瞬时离心15s。分别取5μl阴性质控品、步骤1制备样本核酸模板、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧pcr反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。表5荧光pcr加样布局编号abcdefgh1阴控样本1样本2样本3样本4样本5样本6阳控注：阴控为阴性质控品；阳控为阳性质控品(3)实时荧光pcr扩增：设置实时荧光pcr扩增仪同时检测fam信号和vic信号。实时荧光pcr反应程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。每管vic通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品vic信号最高荧光值1/20作为阈值线，ct值小于38，表明核酸模板质量良好。根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品fam信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整baselinestartcycle3，endcycle15，并结合ct值和荧光曲线判断结果：a.ct值小于37，且有明显荧光扩增曲线，则判断为阳性；b.ct值大于等于37，或无明显荧光扩增曲线，则判断为阴性。本实施例提供的多重肺癌egfr基因检测试剂盒的组成成分、包装如表6：表6试剂盒的组成成分、包装及数量实施例2灵敏度及准确性检测核酸浓度2ng/μl的灵敏度参考品由各检测基因位点质粒dna或细胞株核酸，与野生型细胞株核酸分别按一定比例混合，混合液的基因突变率为1％。(1)加样取dna酶系3μl加入pcr反应管中。瞬时离心15s。分别取5μl阴性质控品、灵敏度参考品(浓度为2ng/μl突变率1％)、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧pcr反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。每种灵敏度参考品，5个重复试验。(2)实时荧光pcr扩增：设置实时荧光pcr扩增仪同时检测fam信号和vic信号。实时荧光pcr反应程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；检测结果的判断：a.每管vic通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品vic信号最高荧光值1/20作为阈值线，ct值小于38，表明核酸模板质量良好。b.根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品fam信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整baselinestartcycle3，endcycle15，并结合ct值和荧光曲线判断结果。五次检测结果符合率100％。检测结果表明，本发明的检测体系可以一次性准确检测核酸浓度2ng/μl的突变率1％的非小细胞肺癌egfr基因突变。实施例3临床样本检测检测样本核酸的提取：(1)临床待测样本核酸模板提取采集100例阴性临床样本，将经常规方法确认的egfrg719a、g719c、g719s、l861q、s768i突变的临床样本各1例，编号后随机混入，使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(组织样本可使用粤穗械备20170666号；胸腹水、血浆样本可使用粤穗械备20180628号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取，组织样本提取后的核酸稀释为浓度2-100ng/μl(胸腹水、血浆提取的核酸浓度不少于2ng/μl)，纯度应满足a260/a280比值范围在1.7-2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。(2)加样取dna酶系3μl依次加入pcr反应管中。瞬时离心15s。分别取5μl阴性质控品、步骤1制备样本核酸模板、阳性质控品，按照表5顺序，依次加入到反应管中。盖紧pcr反应管管盖，充分混匀，瞬时离心10s。(3)实时荧光pcr扩增设置实时荧光pcr扩增仪同时检测fam信号和vic信号。实时荧光pcr反应程序如下：第一阶段：50℃2-15min，95℃10-15min，1个循环；第二阶段：94℃10-15s，55-60℃45s，45个循环；本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。每管vic通道有明显荧光扩增曲线，且以阳性质控品vic信号最高荧光值1/20作为阈值线，ct值小于38，表明核酸模板质量良好。根据实时荧光pcr扩增仪显示的阳性质控品fam信号最高荧光值1/20作为阈值线，调整baselinestartcycle3，endcycle15，并结合ct值和荧光曲线判断结果：在所检测的105例临床样本中(含5例经常规方法确认的egfr突变类型的临床样本)，共检出5例突变，典型阳性示例如图2-3所示。结果表明本发明检测体系检测准确率达到了100％，进一步证明了本发明体系检测的临床检测准确性。本发明取材便捷、高特异性、高灵敏度、准确性高，可满足肺癌基因的快速检测。对比例1本发明人在研究过程中，针对各突变位点目标序列筛选了数十对pcr引物，最终筛选出了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求的引物、探针组合。例如，针对g719a、g719c、g719s突变位点，本发明人期望能够设计出共用的引物和探针，并且能够保证优异的灵敏度和特异性。针对上述3个突变位点，本发明人设计的部分典型引物序列如下：对照共用下游引物1：ggctccccaccagacca(seqidno.:16)。对照共用下游引物2：gcaaggactctgggctc(seqidno.:17)。对照共用下游引物3：ccaccagaccatgagagg(seqidno.:18)。具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，分别结合上游引物对及探针进行检测测试。使用对照共用下游引物1的检测结果如图4所示，检测结果表明该引物对特异性较差。使用对照共用下游引物2的检测结果如图5所示，检测结果表明该引物对灵敏度较差。对照共用下游引物3的灵敏度和特异性能够满足检测需求，检测结果如图6所示。对比例2本发明人在研究过程中，针对多重检测体系进行了反复优化和测试。先用单重荧光pcr扩增筛选灵敏度和特异性较高的引物，然后将筛选出的引物探针组合到多重荧光pcr法进行测试，选择能够保证各位点优异灵敏度和特异性的引探组合。例如，将包含上述对照共用下游引物3的引探对集，与针对l861q、s768i检测的引探对集再组合，进行多重pcr扩增。结果表明，在该多重检测体系中，无法正常检测出egfrs768i突变位点，说明包含对照共用下游引物3的引探对集的组合会干扰针对egfrs768i突变位点的检测，结果如图7所示。因此，该对照多重检测体系无法应用于临床检测中。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120>多重检测egfr基因突变的试剂盒及方法<130>000036<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>1caaaaagatcaaagtgctagc21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>2tcaaaaagatcaaagtgtagt21<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>3attcaaaaagatcaaagtggtca23<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>4gttgggctggccaaaga17<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>5gaagcctacgtgatggcgat20<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<4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