一种IgAN诊断试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种igan诊断试剂盒和应用。

背景技术：

iga肾病(iganephrology，igan)是一种肾小球系膜区iga沉积或以沉积为主的原发性肾小球疾病，是肾小球源性血尿最常见的病因，也是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病之一，同时还是我国最常见的肾小球疾病。现有的研究表明，igan是一种多基因、多因素决定的复杂性疾病。igan的确诊方式依赖于肾活检病理，其表现呈现多样性，主要以系膜增生性肾小球肾炎为主，病变程度轻重不一。igan的临床表现多种多样，几乎涵盖了所有肾小球肾炎的临床特征。肉眼血尿可能会诱发igan的急性肾衰竭，其中高达25％的患者无法恢复到基础肾功能水平。而年龄大于40岁的蛋白尿患者更易发展成肾功能不全。该病临床呈现慢性进展，约25-30％的患者在20-25年后出现终末期肾病(esrd)，需要肾脏替代治疗，因此，igan是导致esrd的主要疾病之一。目前，患者的治疗方案基于长期的免疫抑制剂、糖皮质激素及一般常规对症处理，缺乏有效的治愈手段。所以，结合生物医学技术手段的发展探讨igan的病因和发病机制也是当前的研究趋势。

近年来，基因组学、蛋白质组学、代谢组学及相关新技术的发展为igan的研究提供了一个新的思维模式和研究平台，很多学者进行了多项相关研究，并取得了一定的成果。据相关文献报道，mrna的表达和h3k4me3的甲基化水平之间存在一定的相关性，而mirna与igan的发病也密切相关。然而，上述研究主要是dna、mrna相关的研究，并未完全阐明igan的发病机制，不能完全解释igan的发生和发展，因此，有必要从新的角度对igan的发病机制进行阐释。

转移核糖核酸(trna)是蛋白质合成的关键接头分子，其在机体的稳定性还维持着细胞正常的生命过程，trna的不稳定性可能导致细胞的变性、增殖、死亡等。现有的研究表明，trna具有一部分管家基因的功能，过度表达会增加细胞的代谢功能与增殖能力，在上皮细胞瘤、肺癌、肝癌中都发现了trna的过度表达。因此，研究igan发病过程中trna的表达谱变化等情况，有助于从表观遗传学角度更全面、深入认识igan的发生发展过程，便于igan的诊断、预后，为探究igan治疗的新靶点提供理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种igan诊断试剂盒和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于iga肾病的诊断和/或预后的试剂盒，试剂盒包括定量trna的表达量的试剂，trna的核苷酸序列为seqidno.1-3中的至少一种。

优选的，还包括trna的提取试剂。

定量trna的表达量的试剂在制备iga肾病的诊断和/或预后的试剂中的应用，trna的核苷酸序列为seqidno.1-3中的至少一种。

优选的，trna的表达量为正常水平上调1.85倍及以上则判定为患有iga肾病。

优选的，trna的核苷酸序列为seqidno.1-3中的至少两种。

进一步优选的，trna的核苷酸序列为seqidno.1-3。

本发明的有益效果是：

本发明首次以trna为切入点，研究了igan患者的trna表达谱，筛选出了igan患者的差异性上调trna，可以作为igan的诊断、预后的重要手段之一，以期能够更加方便、准确地对该疾病进行诊断，从而为将来疾病的治疗打下相关的基础。

附图说明

图1是本发明的差异表达trna的散点图。

具体实施方式

以下将结合实验对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。

研究对象

病例来自于在深圳市人民医院就诊的igan患者，所有患者均经肾活检证实，按照《原发性iga肾病诊治循证指南(2016)》选择免疫病理学检查免疫荧光特征为在肾小球系膜区或伴毛细血管襻有以iga为主的免疫球蛋白沉积或仅有iga沉积。所有受试者均已根据临床资料排除紫癜性肾炎、乙肝相关肾炎和系统性红斑狼疮等疾病。igan组包括igan的患者20例，正常健康的对照组包括20例。患者的入选标准为：签署知情同意书并且有完整的临床和其它各种资料；排除标准为未获得知情同意或临床和其它资料不完整。

实验方法

1.序文库构建

用edta抗凝管收集igan患者及正常人外周静脉血(空腹时)5ml，4小时内处理样品，根据ficoll密度梯度离心法，使用淋巴细胞分离液将收集的静脉血分离出外周血单个核细胞(pbmc)。采用trizol法提使用trizoltm试剂提取pbmc的总rna，采用rna纯化试剂盒对总rna进行过柱纯化，并进行相应的质量检测。

将产物进行去甲基化处理、去末端处理和去氨基酸处理，从而筛选出高质量的trna。

通过pcr技术，构建trna文库。

2.测序与分析

使用assemnler-3.4.4.0、alignment2.0、coverageanalysis3.0软件、基于fame2算法的序列比对软件，以h38chrm(nc-012920)，参考基因组对数据进行组装和比对，允许10个碱基的错配。原始序列经过预过滤和比化筛除滤过率低于40％、mapping率低于80％、覆盖深度低于100x或覆盖度不均一的样本数据，最终筛选得到对照组和igan组有效数据，寻找有意义的差异性上调表达trna，并计算上调表达量。

实验结果

1.trna差异性表达分析

图1是本发明的差异表达trna的散点图。如图1所示，其中横坐标代表对照组的trna的cpm平均值的对数值，纵坐标代表igan组的trna的cpm平均值的对数值，两条虚线内部的点代表非差异性表达的trna(共238个)，上侧虚线的上方代表差异性表达上调的trna(共18个)，下侧虚线的下方代表差异性表达下调的trna(共19个)，pearson相关系数＝0.993。对筛选出的差异表达的trna进行注释后，综合多方面因素，进一步筛选得到3个上调最显著的差异表达的trna(trna-ser-cga-1-1、trna-ser-cga-4-1、trna-leu-caa-4-1的核苷酸序列分别为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3)，其具体信息如下：

表1.相关trna信息

其中，fc值(foldchange)为表达差异倍数，p值为负二项分布检验的p值，i_cpm为igan组trna的cpm平均值的对数值，z_cpm为对照组trna的cpm平均值的对数值，cpm为每百万读长(reads)中特定trna的读长数。在本发明中，出于实验样本量和实验精确性的综合考虑，将log2fc的阈值设定为0.585，即fc的阈值设置为1.50。

从上述结果可以看出，这三个trna在igan患者和正常对照组中表达中有明显上调，通过对外周血或其它一些样本中这三个trna的表达情况进行检测，相关的研究人员能够快速、简便地对igan进行诊断，有可能为今后igan的诊断、预后提供一种行之有效的快速诊断方法；同时，通过上述研究结果进行进一步分析期望获得igan相关的关键表观遗传位点，借此可以发现与igan的发生发展相关的重要调控因子，为进一步揭示其生理学机制，探寻igan的治疗和药物作用的全新靶点提供理论依据。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

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<110>深圳市人民医院

<120>一种igan诊断试剂盒和应用

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