一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法与流程

本发明属于微生物的活性测定技术领域，具体涉及一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法。

背景技术：

氧化亚铁硫杆菌（acidithiobacillusferrooxidans，简称a.ferrooxidans）属原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属，革兰氏阴性菌，是专性化能自养菌，营好氧呼吸，嗜酸。广泛分布在土壤、海水、淡水、污泥、垃圾、煤矸石、酸性矿坑水中，尤其是在矿坑水中含量巨大。由于氧化亚铁硫杆菌以元素硫、亚铁离子为能源物质进行生长代谢，因此对于大部分金属硫化物矿山环境或者含硫量高的其它固体废弃物，它是最好的脱硫微生物。且能通过直接作用或其代谢产物的间接作用，产生氧化、还原、络合、吸附或溶解作用，达到浸出固相中重金属的效果。目前已在市政污泥、污泥重金属脱除、矿山冶金等领域成熟应用。由于氧化亚铁硫杆菌以氧化单质硫或还原态的硫或者亚铁来获取生长繁殖所需的能量，所以研究者一般使用硫氧化活性或者亚铁氧化活性来表示氧化亚铁硫杆菌的活性。在实际工程应用中，功能菌株的活性对于浸出重金属含量、污泥降解率、浸出反应速率以及细菌最适生长条件有很大的影响。因此在利用氧化亚铁硫杆菌进行工程应用之前，需要对主要功能菌株氧化亚铁硫杆菌的活性进行准确的测定。

作为化能自养细菌，氧化亚铁硫杆菌有其独特的能量利用方式：首先，氧化亚铁硫杆菌以二价铁（fe²⁺）或单质硫（s⁰）以及还原态硫化物为能源，通过这些离子或物质的氧化反应中电子的传递过程来获取能量，这个特点也是它被当做最常用的浸矿微生物的主要原因。

氧化亚铁硫杆菌属于嗜酸菌，在ph值为2.0-5.0的范围内都能很好的生长，最适合ph为2.0-3.5，最适生长温度为28-35℃。氧化亚铁硫杆菌生长周期约为6-10d，在9k液体培养基中会使培养基由乳白色液体变为红褐色液体，并伴随有大量沉淀产生。在9k固体培养基上生成红棕色菌落，直径约为0.5-1.0mm，质地坚硬，难以挑起，在菌落的周围会出现一圈铁锈色的沉淀。根据氧化亚铁硫杆菌的理化性质对9k培养基进行改良后开始培养氧化亚铁硫杆菌。

氧化亚铁硫杆菌主要利用co2为碳源，并通过吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。氧化亚铁硫杆菌铁氧化系统中的绝大多数功能成分已得到了鉴定。它包括一个92kd的外膜蛋白，一个称为铁质兰素的小兰铜蛋白，许多c和a型细胞色素及铁（ⅱ）氧化酶等。目前氧化亚铁硫杆菌硫氧化系统存在两种机制：（1）在硫基础盐培养基中有氧生长时硫氧化以氧为最终电子受体；（2）在铁基础盐培养基中厌氧生长时，它利用三个酶即硫化氢-fe³⁺氧化还原酶，亚硫酸-fe³⁺氧化还原酶及铁（ⅱ）氧化酶，共同将元素硫氧化为硫酸。氧化亚铁硫杆菌可氧化硫和硫代硫酸盐等其他部分还原态的硫化物。相对于铁氧化系统来说，硫的氧化研究则进展较慢，其中有生物催化作用的酶有待进一步研究。无论是单质硫，硫代硫酸盐或是其他还原态硫的生物氧化，亚硫酸根离子是一必然的中间产物。

在一些化学反应过程中伴随的光发射现象被称作化学发光。反应中产生化学发光现象主要通过两种途径。一类是化学反应中激发态的发光体直接生成；另一类是反应过程中由于能量的转移而间接产生的化学发光。化学发光法的优点主要在于操作简单、背景干扰小、高灵敏度以及高准确度等，易于实现快速定量分析，目前广泛地应用于定量检测化学反应中微量物质。目前国内对于化学发光法的研究多聚焦于检测重金属离子含量。

鲁米诺-过氧化氢化学发光反应是应用最为广泛的鲁米诺发光体系。cu²⁺、cr³⁺、ni²⁺、co²⁺和fe²⁺等过渡金属离子对鲁米诺-过氧化氢化学发光反应有很好的催化作用。其基本原理为：当fe²⁺与ho2^-配位，生成的配合物再与鲁米诺发生氧化反应，fe²⁺失去一个电子变成fe³⁺，鲁米诺则被氧化成鲁米诺游离基，随后，鲁米诺游离基进一步被过氧化氢氧化成氨基邻苯二甲酸根离子产生化学发光。因为鲁米诺-h2o2-fe（ⅱ）发光体系能够快速准确的测定溶液中亚铁含量，因此本方法使用重铬酸钾滴定法与鲁米诺-h2o2-fe（ⅱ）发光体系来测定同一培养周期中不同时间段的亚铁含量，以此来确定使用化学发光法测定氧化亚铁硫杆菌的准确性和可行性。

在国内外的关于氧化亚铁硫杆菌的活性研究的试验中，大部分都选择以铁氧化活性来代表细菌的活性。主要有以下几种测定方法：

1.重铬酸钾滴定法。如许晓芳等人在研究阳离子对嗜酸性氧化亚铁硫杆菌氧化活性的影响时，使用了重铬酸钾来滴定fe²⁺，通过前后变化值来确定亚铁离子的氧化率。

2.邻菲罗啉分光光度法。如王艳锦等人在研究载体对氧化亚铁硫杆菌氧化活性的影响时，使用邻菲罗啉分光光度法来测定fe²⁺的前后变化值。

3.氧化还原电位分析法（orp计）。如周吉奎等人采用bpp-922型台式氧化还原电位分析仪(orp计)检测浸出体系氧化还原电位值的变化。

4.edta滴定法。徐晶晶在研究氧化亚铁硫杆菌符合杀菌剂的作用机理及其缓释技术时，利用edta滴定法测定了fe²⁺的含量。

5.谢丽等人利用流式细胞仪来测定细菌的活性，通过fcm-单染色法以及fcm-双染色法分别测定活性，并取得较好的结果。

4.t•o•斯卡恭等人通过一种适于硫化矿精矿槽浸的通过离心方式确定氧化亚铁硫杆菌生物量和通过测定浸出矿浆溶液中fe²⁺的氧化速率（g/ml时）来确定细菌氧化活性的快速方法。

目前国内外关于氧化亚铁硫杆菌的研究中，一般使用重铬酸钾滴定法来测定fe2+的氧化率来表示氧化亚铁硫杆菌的铁氧化活性，但使用传统方法测定氧化亚铁硫杆菌活性，操作繁复，需要多次测量，耗费大量时间且检测周期长。而化学发光法具有灵敏度好，准确度高，光背景小等优点，广泛地应用于微量物质的定量分析。使用化学发光法可以快速测定氧化亚铁硫杆菌的活性，迅速而准确。为以后的研究者提供一种新的活性测定思路和方法，并为后续氧化亚铁硫杆菌在工程中的应用提供支持。

技术实现要素：

本发明针对现有测定氧化亚铁硫杆菌活性的方法操作复杂，时间长，效率低的问题，提供一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法—化学发光法。

本发明采用如下技术方案：

一种测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法，包括如下步骤：

第一步，调整发光仪参数：高压1000v，标准光源¹⁴c每秒发光值为1500count/s（发光强度/每秒），背景值6count/s，测量温度30℃；

第二步，分别配制浓度为1μg/l、10μg/l、30μg/l、50μg/l、70μg/l、80μg/l、100μg/l的fe²⁺标准溶液待用，在样品杯中依次加入鲁米诺分析溶液与h2o2溶液，放入发光仪中开始计时，在第20s时从暗室顶端注射孔中将fe²⁺标准溶液注射入样品室，得到反应体系，每种浓度测量三次，反应结束后，记录不同浓度fe²⁺标准溶液到达最大发光值所用时间以及不同浓度fe²⁺标准溶液到达最大发光值时的累计发光数，并绘制标准曲线；

第三步，取待测含氧化亚铁硫杆菌的菌液接种到9k液体培养基中，测定待测菌液中fe²⁺的含量，记录到达最大发光值所用时间与到达最大发光值时累计发光数，代入到标准曲线中求得待测菌液中的fe²⁺浓度；

第四步，通过公式：fe²⁺氧化速率=（cfe²⁺初始－cfe²⁺剩余）/cfe²⁺初始×100%计算氧化亚铁硫杆菌的活性。

第二步中所述鲁米诺分析溶液的加入量为1ml、h2o2溶液的加入量为0.5ml、fe²⁺标准溶液的加入量为0.5ml。

第二步中所述样品室中的反应体系的总体积为2ml，反应温度为30℃，反应总时间为100s，反应间隔0.1s。

本发明的有益效果如下：

1.由于传统滴定法测定需要测定细菌从停滞期到对数生长期再到衰亡期的一个完整生长周期，本方法缩短了测定时间，比现有方法效率更高。

2.传统滴定法测定结果受人为因素干扰，本方法仪器灵敏度好、准确度高，能实现快捷简便地测定氧化亚铁硫杆菌的活性。

3.本方法操作简单，易于在工程中推广应用。

4.本方法具有仪器构造简单，灵敏度好，准确度高，光背景小等优点，可被广泛地应用于微量物质的定量分析中，可以快速而准确地测定氧化亚铁硫杆菌的活性。

5.比较传统滴定法与化学发光法测得中fe²⁺的浓度，二者差异性没有达到显著水平，两组数据没有差异。进行加标回收实验，结果表明回收率为95%—105%，相对偏差rsd＜3.3%。化学发光法可以快速准确地检测氧化亚铁硫杆菌活性，为之后的工程应用提供更好的支持。

附图说明

图1为本发明fe²⁺浓度为80μg/l时化学发光强度随时间变化曲线图；

图2为本发明fe²⁺标准溶液浓度与累计发光数标准曲线；

图3为本发明fe²⁺标准溶液浓度与到达化学发光峰值所用的时间标准曲线。

具体实施方式

实施例

本发明的测定氧化亚铁硫杆菌活性的新方法的步骤如下：

1.调整发光仪参数以保证最佳信噪比：高压1000v，标准光源¹⁴c每秒发光值为1500count/s（发光强度/每秒），背景值6count/s，测量温度30℃。

2.样品杯预备5个，清洗后烘干，用擦镜纸擦干后待用。

3.在样品杯中依次加入鲁米诺分析溶液1ml、h2o2溶液0.5ml，用注射器吸取fe²⁺标准溶液0.5ml，在测量开始后的第20s时从暗室顶端注射孔中将fe²⁺标准溶液注射入样品室，反应体系总体积为2ml，反应温度30℃，反应总时间100s，反应间隔0.1s。用注射器加入不同浓度fe²⁺标准溶液0.5ml，每种浓度测量三次。反应结束后，记录不同浓度fe²⁺标准溶液到达最大发光值所用时间，并绘制标准曲线。

4.在样品杯中依次加入鲁米诺分析溶液1ml、h2o2溶液0.5ml，用注射器吸取待测含氧化亚铁硫杆菌的菌液0.5ml，在测量开始后的第20s时从暗室顶端注射孔中将待测溶液注射入样品室，反应体系总体积为2ml，反应温度30℃，反应总时间100s，反应间隔0.1s。反应结束后根据发光峰值带入到标准曲线中得出fe²⁺浓度。

5.通过公式：fe²⁺氧化速率=（cfe²⁺初始－cfe²⁺剩余）/cfe²⁺初始×100%计算氧化亚铁硫杆菌的活性。

分别采用化学发光法与重铬酸钾滴定法测定了已培养四天后进入对数成长期的三组实验组在七天内不同培养时间fe²⁺浓度，(h表示使用化学发光法测量的数据)结果如下表：

不同培养时间9k培养基中fe²⁺含量

通过spss双变量相关检验(pearson相关系数为0.9999)，两种方法所测数据存在显著相关关系。通过与传统滴定法结果的比对，表明本方法具有较好的准确性和精密性，化学发光法可以用来检测氧化亚铁硫杆菌铁氧化活性。

如图1所示，使用bpcl软件中的分析平台功能，以fe²⁺浓度为80μg/l时化学发光强度变化为例，从20.30s开始发光强度开始迅速上升，到第29.50s到达峰值，总用时9.30s，该时间段发光强度总和为2745705。

如图2所示，根据实验数据所做的fe²⁺标准溶液浓度与累计发光数标准曲线。其线性方程为y=28697x+412384，r²=0.9981，fe²⁺标准溶液浓度与累计发光数有显著的相关性

如图3所示，fe²⁺标准溶液浓度与到达化学发光峰值所用的时间标准曲线。其线性方程为y=0.0923x+1.7471，r²=0.9962，fe²⁺标准溶液浓度与到达化学发光峰值所用的时间有显著的相关性

结论：

（1）鲁米诺-h2o2-fe（ⅱ）体系发光峰值与fe²⁺浓度没有关系，加入不同浓度fe²⁺标准溶液后鲁米诺-过氧化氢体系发光峰值一致。

（2）不同浓度fe²⁺影响到达发光峰值的时间与到达发光峰值时累计发光量，浓度越高到达发光峰值所用的时间越长，浓度越高到达发光峰值时累计发光量越多；fe²⁺浓度与到达发光峰值的时间和达发光峰值时累计发光量有良好的线性相关性。