一种赖氨酸修饰的二氧化硅粒子制备及提取DNA方法与流程

本发明涉及dna提取领域，尤其涉及赖氨酸修饰的二氧化硅粒子制备及提取dna方法。

背景技术：

随着现代科学技术的发展，该领域的技术日新月异，焕然一新，生物技术也得到了长远的发展，而生物技术中的dna提取与纯化，更是生物技术的核心技术之一，作为医学、生化、分子生物学进行相关研究的基础，dna提取与纯化技术的重要性非同寻常。

dna是绝大部分生物的遗传物质，直接影响甚至决定着生物的所有性状，对dna进行研究有利于人们探索生命的秘密，进而开发出新的医疗手段和疾病诊断方法，这就要求对dna进行提取和纯化，随着相关技术的进步，dna的提取和纯化也得到了发展，已经摆脱了传统方法所带来的一些的缺陷。

对于dna的提取与纯化，目前常用的方法有盐桥法，该方法首先将dna与硅基质混合，由于dna与硅基质之间存在静电，二者不能结合，向溶液中加入高浓度的盐，利用盐的静电屏蔽掉二者之间的斥力，使得dna能够吸附在硅基质表面，然后再将盐分洗脱掉，去除了静电屏蔽作用，使得斥力恢复，dna便从硅基质上脱落下来，完成dna的提取，但该方法提取效率低并且不能进行小片段的dna提取；直接静电法，通过化学反应使得基质粒子表面带有与dna互相吸引的电荷，借助静电引力将dna吸附在基质表面，但同样由于静电引力，使得dna不能脱附，故提取效率不高，虽然可通过反转电荷的固相基质解决该问题，但过程繁琐且最佳提取条件需要进一步研究探讨才能决定，因此该技术并不成熟，尚不适合实际应用。

虽然现有方法也能够进行dna提取，但通过分析发现其存在操作繁琐、dna提取效率低、提取时间长、小片段dna提取效果差等缺点，有待技术升级，进行进一步的优化。

技术实现要素：

本发明的目的是解决dna片段提取过程中操作步骤繁多、耗时长、提取效率低、提取dna的精度和纯度低问题，提供一种耗时较少、操作简便、成本更低、精度更高的赖氨酸修饰的二氧化硅粒子制备及提取dna方法。

本发明所采用的技术方案：一种赖氨酸修饰的二氧化硅粒子制备及提取dna方法，所需材料及试剂包括：二氧化硅粒子、去离子水、乙醇、氨水、氢氧化钠、醋酸、正硅酸乙酯、γ-丙基三甲氧基硅烷、缓冲溶液，所需设备包括：三颈瓶、离心管、离心机、水浴箱、透射电镜、真空干燥箱、ph计，所述二氧化硅粒子为利用stober方法自行制备，性能优越，氨基与羧基比例为1：1；所述缓冲溶液根据工艺的需要有两种，一种是促进二氧化硅粒子吸附dna片段的低ph值的0.02m缓冲溶液，另一种是促进二氧化硅粒子脱附dna片段的高ph值的0.02m缓冲溶液，具体ph值视dna片段类型而定；所述透射电镜型号为jem-1200；所述离心机型号为sigma1-14；所述ph计型号为sartoriuspb-20；所述真空干燥箱为dzg-6020。

本发明一种赖氨酸修饰的二氧化硅粒子制备及提取dna方法布置如下：

(一)二氧化硅粒子制备：将去离子水、乙醇、氨水在三颈瓶中混合，并在300rpm、30℃的条件下搅拌，同时快速加入正硅酸乙酯，进行6h的反应后会产生二氧化硅粒子，将整个体系放入离心机，在8500rpm下离心处理20min，保留二氧化硅粒子，并用乙醇反复清洗数次，再用清水清洗数次，然后将二氧化硅粒子与去离子水混合均匀，超声下处理，将混合液移至离心管中，放入真空干燥箱中干燥24小时，再真空干燥12小时，通过称重定量，最后利用投射电镜观察二氧化硅粒子的形貌、单分散性和粒径，选取符合要求的二氧化硅粒子；

(二)赖氨酸修饰二氧化硅粒子：将赖氨酸溶解于去离子水中，溶解均匀后向溶液中加入少量naoh同时利用ph计监测，将溶液的ph值调整到11.0，然后将溶液放入0℃的水浴箱中，恒温滴加γ-丙基三甲氧基硅烷并搅拌均匀，再以450rpm的转速在65℃的水浴箱中搅拌5h，再将溶液体系置于0℃的水浴箱中进行冷却，冷却完成后缓慢滴加γ-丙基三甲氧基硅烷，再次以450rpm的转速在65℃的水浴箱中搅拌5h，在ph计的监测下加入醋酸将溶液ph值调整为3.0，加入去离子水和二氧化硅颗粒，在80℃、150rpm的条件下进行4h的反应，再在离心机中以8500rpm的转速离心处理20min,保留二氧化硅粒子，并进行反复多次水洗，将二氧化硅粒子装入离心管并放入真空干燥箱内进行12h真空干燥处理，通过称重定量；

(三)二氧化硅颗粒对dna的吸附：将二氧化硅粒子与dna溶液加入离心管中，然后加入低ph值的0.02m缓冲溶液，在ph计的监测下将溶液ph调至促进dna吸附的状态，在30℃下充分震荡2.5小时，然后将离心管置于离心机内，在8000rpm转速下离心处理10min，保留二氧化硅颗粒；

(四)二氧化硅颗粒对dna的脱附：将步骤(三)得到的二氧化硅颗粒加入到高ph值的0.02m的缓冲溶液中，在ph计的监测下将溶液ph调至促进dna脱附的状态，在30℃下充分震荡2.5小时，然后将离心管置于离心机内，在8000rpm转速下离心处理10min，完成脱附并取上清液。

不同类型dna片段对二氧化硅粒子的吸附和脱附对应的ph值不同，因此，步骤(三)和(四)中缓冲液加入后的ph值，应针对不同的dna片段具体的吸附与脱附性能选择合适的ph值。

本发明的有益效果：(1)本发明采用stober来制备二氧化硅粒子，避免了以往方法导致的氨基、羧基比例难以调节的弊端；(2)利用ph环境能反转二氧化硅表面电荷的特点，并针对相应dna选择适当的ph值，最大限度进行了dna的吸附与脱附，dna提取效率高，提取精度高；(3)本发明所用的各项材料均可提前制备，且易于保存，节约dna提取时间，操作步骤简单，；(4)所用各种原材料市场易获得，成本较低。

附图说明

图1是本发明的流程示意图。

具体实施方式：

下面结合附图与具体实例对本发明进行详细说明。

本发明结合实例，以鲑鱼精dna为例进行说明，所需材料及试剂包括：二氧化硅粒子、去离子水、乙醇、氨水、氢氧化钠、醋酸、正硅酸乙酯、γ-丙基三甲氧基硅烷、缓冲溶液，所需设备包括：三颈瓶、离心管、离心机、水浴箱、透射电镜、真空干燥箱、ph计，所述二氧化硅粒子为利用stober方法自行制备，性能优越，氨基与羧基比例为1：1；所述缓冲溶液根据工艺的需要有两种，一种是ph为4.0的0.02m缓冲溶液，另一种是ph为10.0的0.02m缓冲溶液；所述透射电镜型号为jem-1200；所述离心机型号为sigma1-14；所述ph计型号为sartoriuspb-20；所述真空干燥箱为dzg-6020。

本发明一种赖氨酸修饰的二氧化硅粒子制备及提取dna方法，结合实例，以鲑鱼精dna为例进行说明，具体实施如下：

(一)二氧化硅粒子制备：将去离子水、乙醇、氨水在三颈瓶中混合，并在300rpm、30℃的条件下搅拌，同时快速加入正硅酸乙酯，进行6h的反应后会产生二氧化硅粒子，将整个体系放入离心机，在8500rpm下离心处理20min，保留二氧化硅粒子，并用乙醇反复清洗数次，再用清水清洗数次，然后将二氧化硅粒子与去离子水混合均匀，超声下处理，将混合液移至离心管中，放入真空干燥箱中干燥24小时，再真空干燥12小时，通过称重定量，最后利用投射电镜观察二氧化硅粒子的形貌、单分散性和粒径，选取符合要求的二氧化硅粒子；

(二)赖氨酸修饰二氧化硅粒子：将赖氨酸溶解于去离子水中，溶解均匀后向溶液中加入少量naoh同时利用ph计监测，将溶液的ph值调整到11.0，然后将溶液放入0℃的水浴箱中，恒温滴加γ-丙基三甲氧基硅烷并搅拌均匀，再以450rpm的转速在65℃的水浴箱中搅拌5h，再将溶液体系置于0℃的水浴箱中进行冷却，冷却完成后缓慢滴加γ-丙基三甲氧基硅烷，再次以450rpm的转速在65℃的水浴箱中搅拌5h，在ph计的监测下加入醋酸将溶液ph值调整为3.0，加入去离子水和二氧化硅颗粒，在80℃、150rpm的条件下进行4h的反应，再在离心机中以8500rpm的转速离心处理20min,保留二氧化硅粒子，并进行反复多次水洗，将二氧化硅粒子装入离心管并放入真空干燥箱内进行12h真空干燥处理，通过称重定量；

(三)二氧化硅颗粒对dna的吸附：将二氧化硅粒子与鲑鱼精dna加入离心管中，然后加入ph值为4.0的0.02m缓冲溶液，在30℃下充分震荡2.5小时，然后将离心管置于离心机内，在8000rpm转速下离心处理10min，保留二氧化硅颗粒；

(四)二氧化硅颗粒对dna的脱附：将步骤(三)得到的二氧化硅颗粒加入到ph值为10.0的0.02m的缓冲溶液中，在30℃下充分震荡2.5小时，然后将离心管置于离心机内，在8000rpm转速下离心处理10min，完成脱附并取上清液。

对于鲑鱼精dna，ph值为6.5时二氧化硅颗粒与dna片段之间为等电位，无静电作用，在ph为4.0时二氧化硅颗粒与dna片段之间静电引力最大，吸附性最强，而在ph为10.0时二氧化硅颗粒与dna片段之间静电斥力最大，脱附性最强，因此，步骤(三)和(四)中加入缓冲液后的ph分别为4.0和10.0，而对于其他类型的dna则应根据具体的吸附与脱附性能选择合适的ph值缓冲液。