一种从胭脂萝卜废渣中提取木质素的方法及其应用与流程

本发明涉及生物化工领域，特别的涉及一种从胭脂萝卜废渣中提取木质素的方法及其应用。

背景技术：

木质素是由芳香醇聚合而的构成的一类物质，存在于木质组织中，为次生壁主要的成分，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间，起支撑、抗压作用。木质素作为可再生资源，每年都以500万亿吨的速度再生，来源广阔，成本低廉。木质素与纤维素、半纤维素共同构成植物的纤维质部分，在自然界中木质素的含量是仅次于纤维素的第二大天然高分子材料。木质素无毒，在性能方面有极好的通用性，在工业上有广泛的应用。

胭脂萝卜红色素作为天然食用色素的一种，不仅安全无毒、色调自然，而且原材料成本低又具有较高的营养价值，随着人们对食品安全要求的不断提高，目前胭脂萝卜红色素已被广泛用作食品、饮料、和化妆品的着色剂和添加剂，但胭脂萝卜用于红色素的提取后产生大量废渣。胭脂萝卜废渣中含有大量的木质素，但未得到利用而被废弃，造成了很大的浪费，并且带来了环境污染问题。

由于植物病原菌，种类繁多、分布极广，普遍存在于土壤及动植物有机体上。易侵染多种粮食和经济作物，引起根腐、茎腐和穗(粒)腐等多种病害，造成作物减产，给世界范围内农作物生产带来严重破坏。为了解决以上问题，现有技术采用涂喷化学抑菌剂的方法，这种方法虽然简单快捷，但是时效期短，容易对环境造成污染，同时对植物也有不同程度的影响，产生药物残留问题。因此，化学抑菌剂的使用，一方面造福于人类，另一方面也给人类赖以生存的环境带来危害，由于大量施用化学农药，空气、水源、土壤和食物受到了污染，毒物积累在家畜和人体当中引起中毒等。植物源农药因其高效、低毒、低残留、选择性高、害物不易产生抗药性等特点成为人们关注的焦点，然而现在市面上可用的植物源性农作物高效抑菌剂还非常稀少，难以满足农业生产所需。

技术实现要素：

针对现有技术的存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种从胭脂萝卜废渣中提取木质素的方法，解决胭脂萝卜废渣的资源浪费问题。

本发明还提供了胭脂萝卜木质素在抑制细菌活性方面的应用，为植物源性的抑菌剂提供了更多的选择。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种从胭脂萝卜废渣中提取木质素的方法，包括以下步骤：

1)向胭脂萝卜废渣中加入丙酮抽提6～8h，再将其超声粉粹20～30min后，然后置于真空干燥箱干燥，得到胭脂萝卜粉；

2)将步骤1)得到的胭脂萝卜粉加入ph为4.5的醋酸盐缓冲液中，再加入复合酶，充分溶解，使胭脂萝卜粉于20～60℃下酶解8～24h后，离心收集沉淀，再用去离子水冲洗所述沉淀去除多余的杂质，然后将所述沉淀冷冻干燥得到粗木质素；所述复合酶为纤维素酶与果胶酶的组合物；

3)将步骤2)制备的粗木质素溶于氢氧化钠水溶液中，在65～80℃恒温水浴中搅拌1～2h后，离心后取上清液，向所述上清液中加入质量分数为20％的硫酸溶液得到混合溶液，然后将所述混合溶液于65～80℃下让凝聚30～60min，后置于室温下静置2～3h，最后将其离心收集沉淀，并将所述沉淀在70℃下烘干至恒重，得到精制木质素；所述混合溶液的ph值为2～3。

进一步，所述胭脂萝卜废渣为提取红色素后的胭脂萝卜废渣。

进一步，所述胭脂萝卜粉与醋酸盐缓冲液的料液比为1g：10～30ml。

进一步，所述纤维素酶与果胶酶的质量比为2:1。

进一步，所述胭脂萝卜粉与复合酶的质量比为1：0.03～0.15。

一种抑菌剂，其主要成份采用上述方法获得胭脂萝卜木质素。

进一步，所述菌为葡萄腔菌、镰刀病菌、枯草芽孢杆菌、黑斑病菌、青霉菌和炭疽病菌中的一种或多种。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用以丙酮为溶剂提取木质素，在复合酶的作用下与纤维素分离，进而在高温酸性条件下精炼木质素，得到的木质素纯度高，该方法是在常温、常压下进行催化反应，降低了反应能耗，反应条件温和，没有副反应发生，该方法可以较好的保持木质素原有的结构和活性，提高了木质素的提取率，增加了胭脂萝卜的工业废渣的资源化利用，避免环境污染。

2、本发明的胭脂萝卜木质素提取于天然植物，安全无毒、无刺激性，由于胭脂萝卜木质素具备完整的共轭烯烃结构和苯环结构，对植物病原菌和人体病原菌具有广谱抑菌效果，因此在植物病害和室内杀菌等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为胭脂萝卜木质素紫外光谱图；

图2为复合酶用量对胭脂萝卜木质素提取率的影响曲线图；

图3为酶解时间对胭脂萝卜木质素提取率的影响曲线图；

图4为酶解温度对胭脂萝卜木质素提取率的影响曲线图；

图5为料液比对胭脂萝卜木质素提取率的影响曲线图；

图6为酶解时间与酶用量对木质素的提取量交互影响图；

a为曲面图；b为等高线图；

图7为料液比与酶用量对木质素的提取量交互影响图；

a为曲面图；b为等高线图；

图8为酶解时间与料液比对木质素的提取量交互影响图；

a为曲面图；b为等高线图；

图9为各菌悬液中加入胭脂萝卜木质素后抑菌率的比较；

1为葡萄腔菌、2为镰刀病菌、3为枯草芽孢杆菌、4为黑斑病菌、5为青霉菌、6为炭疽病菌。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

木质素得率＝m产物/m酶解×100％式1

式中：

m产物——最终得到的精致木质素质量(g)；

m酶解——纤维素酶处理得到的酶解粗木质素质量(g)

一、一种从胭脂萝卜废渣中提取木质素的方法优化

实施例1复合酶用量对胭脂萝卜木质素得率的影响

1)向胭脂萝卜废渣中加入丙酮抽提6h，再将其超声粉粹20min后，然后置于真空干燥箱进行干燥，得到胭脂萝卜粉；

2)取5g步骤1)得到的胭脂萝卜粉加入100mlph为4.5的醋酸盐缓冲液中，平均分成5份，向每份中分别加入0.03g，0.06g，0.09g，0.12g和0.15g复合酶(纤维素酶和果胶酶比例为2:1)，充分溶解，使胭脂萝卜粉于40℃下酶解16h后，离心收集沉淀，再用去离子水冲洗所述沉淀去除多余的杂质，然后将所述沉淀冷冻干燥得到粗木质素；

3)将步骤2)制备的粗木质素溶于1mol/l的氢氧化钠水溶液中，在70℃恒温水浴中搅拌1h后，离心后取上清液，向所述上清液中加入质量分数为20％的硫酸溶液至ph值为2左右，然后将上述混合溶液于70℃下让溶液凝聚30min，后置于室温下静置2h，最后将其离心收集沉淀，并将所述沉淀在70℃下烘干至恒重，得到精制木质素。

由于木质素的紫外光谱的特征吸收峰，其分别在280nm，210nm，230nm及310nm～350nm有吸收峰。因此采用紫外光谱法测定制得的精制木质素在200nm～400nm间的吸收峰，结果如图1所示，并得出胭脂萝卜木质素得率，结果如图2所示。

经紫外光谱分析得到(图1)，产物在280nm附近处有最大吸收峰，210nm有较强吸收峰，在230nm～300nm间出现较多的肩峰，在310nm～350处有微弱吸收峰。说明提取物为木质素且结构较为完整，活性较高。

如图2所示，纤维素酶与果胶酶的复合酶用量从0.03g增加至0.06g，提取率从10.69％上升至17.28％，提取率逐渐升高。但当复合酶用量超过0.06g后，木质素提取率并未增加，反而有降低的趋势，提取率从17.28％降至13.94％；因此当复合酶用量为0.06g时，胭脂萝卜木质素的提取率最佳。

实施例2酶解时间对胭脂萝卜木质素得率的影响

试验步骤同实施例1，其中复合酶用量为0.07g，酶解时间分别为8h、12h、16h、20h和24h。并得出胭脂萝卜木质素得率，结果如图3所示。

如图3所示，酶解时间从8h增加到12h时，提取率随着时间不断增高，木质素的提取率从10.47％上升至15.53％；而酶解时间从12h增加到24h时，木质素的提取率并未持续上升，反呈逐渐下降趋势。从15.52％降至13.06％，但下降趋势较为平缓；表明当酶解时间在12h左右，胭脂萝卜木质素的提取率最佳。

实施例3酶解温度对胭脂萝卜木质素得率的影响

试验步骤同实施例1，其中酶用量为0.09g，酶解温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃和60℃。并得出胭脂萝卜木质素得率，结果如图4所示。

如图4所示，随着酶解温度的不断增高，从20℃升至40℃，木质素的提取率从10.6％上升至15.57％，提取率逐渐升高。酶解温度从30℃升至40℃时，木质素的提取率急剧增加，增幅度较大为4.09％；而酶解温度高于40℃后温度呈下降趋势，木质素的提取率由15.57％降至10.23％。酶解温度从50℃升至60℃时，木质素的提取率下降幅度较大为4.44％；表明，当酶解温度为40℃时，胭脂萝卜木质素的提取率最佳。

实施例4料液比对胭脂萝卜木质素得率的影响

试验步骤同实施例1，其中酶用量为0.09g，胭脂萝卜粉与醋酸盐缓冲液的料液比分别为1g:10ml、1g：15ml、1g:20ml、1g:25ml和1g:30ml，即为1:10、1：15、1:20、1:25和1:30(下同)。并得出胭脂萝卜木质素得率，结果如图5所示。

如图5所示，料液比从1:10升至1:20，木质素提取率由13.57％上升至16.32％，提取率呈上升趋势，上升幅度为2.75％，几乎呈线性变化；而在料液比大于1:20，木质素的提取率逐渐下降。表明当料液比为1:20时，胭脂萝卜木质素的提取率最佳。

二、响应面优化法

自变量以a:料液比、b：复合酶用量(纤维素酶与果胶酶：2:1)c：酶解时间为代表，响应值以胭脂萝卜木质素为代表，通过单因素试验的结果分析，利用box-behnken响应面优化试验方法，对胭脂萝卜木质素的提取率进行分析优化，得出最佳试验结果。因素水平见表1所示。

表1因素与水平

2.1回归模型方差分析结果

选取自变量a：料液比、b：复合酶用量(纤维素+果胶酶)c:酶解时间此三因素为代表，响应值以胭脂萝卜木质素为代表，通过单因素的试验结果，使用软件designexpert响应面软件进行数据的分析，获得回归方程：

y＝15.71-2.77a-4.60b-1.70c-3.64a2-3.67b2-3.86c2+1.49a3+5.73b3+2.99c3，结果如表2和表3所示。

表2分析方案及结果

表3回归模型的方差分析

注：r²＝0.9213；adjr²＝0.7797；predr²＝-5.5174；adedprecision＝7.430；表中：*显著(p＜0.05)；**极显著(p＜0.01)

从表4中可知，二次多项模型p值＜0.05，得到试验结果为显著，失拟项p值＝0.2816＞0.05，结果不显著，说明该模型对胭脂萝卜木质素的提取率进行分析与预测是可行的。拟合度r²＝0.9213，表示此次试验索采用的方法对木质素的提取率之间的实验值与预测值拟合度较好；预测拟合度5.5174与校正拟合度0.7797相比，两者相差不大，则模型描述各因素与响应值之间的关系；以f值为准，单因素试验对木质素提取率影响的顺序如下：b＞a＞c，即酶用量＞料液比＞酶解时间。进一步缩减模型得到：

y＝-61.88973+2.96404a+11.26237b+6.20922c-0.12563a2-1.83971b2-0.34098c2+1.48662e-003a3+0.089479b3+5.84635e-003c3。从整体的分析上看，p＜0.05，说明该模型显著。经试验分析得出，二次回归方程的适用度也较高，模型具有显著性特征。

2.2响应面交互作用分析

对影响胭脂萝卜木质素提取量的因素进行分析与研究，通过单一变量的方法，分析得出，各影响因素在相互作用的情况下与胭脂萝卜木质素提取量之间的关系图，该图为动态的相应曲面图，并且由该图来确定因素的最佳参数范围。

由图6中酶解时间和复合酶用量对胭脂萝卜木质素提取量交互影响的响应曲面图可以看出(图a)，当料液比处于最优参数时，胭脂萝卜木质素提取量会因复合酶用量的增加而增加，且增加程度较为明显，具体表现为起始增加速度较快，当达到某一点时，增加开始变缓甚至发生减小的情况，某些点由上升趋势，但幅度不大于最高点。酶解时间对胭脂萝卜木质素提取量的影响同理在一定程度上也遵循上述规律。由等高线的走向可以看出(图b)，等高线边沿趋于不规则形，中部接近圆形，表明和复合酶用量之间有交互作用。

由图7中料液比和复合酶用量对胭脂萝卜木质素提取量交互影响的响应曲面图可以看出(图a)，当时间处于最优参数时，胭脂萝卜木质素提取量会因复合酶用量的增加而增加，且增加程度较为明显，在到达最高点增加开始变缓甚至发生减小的情况。酶用量对胭脂萝卜木质素提取量的影响同理在一定程度上也遵循上述规律，但有小幅度的增长。由等高线的走向可以看出(图b)，等高线边沿趋与中部都趋近于椭圆形，则表明两者间有交互作用。

由图8料液比和酶解时间对胭脂萝卜木质素提取量交互影响的响应曲面图可以看出(图a)，当复合酶用量处于最优参数时，胭脂萝卜木质素提取量会因料液比的增加而增加，且增加程度较为明显，在到达最高点增加开始变缓甚至发生减小的情况。酶解时间对胭脂萝卜木质素提取量的影响同理在一定程度上也遵循上述规律。由等高线的走向可以看出(图b)，等高线趋于椭圆形，表明酶解时间和料液比之间有交互作用。

通过响应面分析法对胭脂萝卜木质素的最佳提取工艺进行研究分析，得到提取工艺参数是：料液比为16.815ml，酶用量为0.069g,时间为14.546h。考虑到试验中实际操作的可行性，将工艺参数改正为：料液比为1:17(g/ml)、酶解时间为15h、复合酶用量为0.07g、酶解温度为40℃。为检验响应面试验结果是否可行，根据上述响应面优化法所获得的最佳工艺参数，进行3次平行试验，取平均值，得到胭脂萝卜中木质素含量平均值为17.251％。

三、胭脂萝卜木质素在抑制细菌活性上的应用

3.1胭脂萝卜木质素对不同菌的抑制效果

配置1mol/l的氢氧化钠溶液100ml，溶解0.5g的木质素，制成抑菌剂，制备pda固体培养基在高压灭菌锅中灭菌后进行活化菌种，青霉菌在28℃温度下培养48h，其它细菌在37℃下培养1天，活化后的菌种与10ml无菌水混合均匀，备用。

将6种供试菌种(葡萄腔菌、镰刀病菌、枯草芽孢杆菌、黑斑病菌、青霉菌和炭疽病菌)的菌液中分别加入10ml木质素(实验组)和10ml无菌生理盐水(空白组)进行试验研究。用可见分光光度计在510nm波长处分别测定实验组和空白组各菌悬液的吸光值，测定抑菌效果。结果如图8所示。

由图8可知，胭脂萝卜木质素对葡萄腔菌的抑菌率最高为47.6％；胭脂萝卜木质素对镰刀病菌抑菌率为40.44％，胭脂萝卜木质素对枯草芽孢杆菌的抑菌率为32.7％；胭脂萝卜木质素对黑斑病菌的抑菌率为26.23％，胭脂萝卜木质素对青霉病菌的抑菌率为17.75％；胭脂萝卜木质素对炭疽病菌的抑菌率为8.58％。可以初步判断胭脂萝卜木质素对所做的试验用菌的抑菌效果为：葡萄腔菌＞镰刀病菌＞枯草芽孢杆菌＞黑斑病菌＞青霉菌＞炭疽病菌。

3.2胭脂萝卜木质素的最小抑菌浓度(mic)

将活化的菌悬液与抑菌剂按比例加入试管中，使抑菌剂在总体系中的浓度分别为1.25％、2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％，并在适宜的条件下培养，与空白试验作对比，参照空白试验观测无菌生长的最低浓度。

表4胭脂萝卜木质素最小抑菌浓度

由表4可见，胭脂萝卜木质素对各种菌具有普遍的抑菌效果，随着胭脂萝卜木质素浓度的递增，抑菌效果不断增强。胭脂萝卜木质素对枯草芽孢杆菌、镰刀病菌、黑斑病菌的抑菌效果最好，其最低抑菌浓度是2.5％；对葡萄球菌的抑菌效果较强，其最低抑菌浓度为5％；对青霉菌及炭疽病菌的抑菌效果较弱，其最低抑菌浓度为7.5％。

综上，胭脂萝卜木质素对病原菌葡萄腔菌、镰刀病菌、枯草芽孢杆菌、黑斑病菌、青霉菌和炭疽病菌具有显著的抑菌效果，在治理植物病害和室内杀菌有良好的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。