二氧化锰纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞内microRNA的检测与成像的制作方法

本发明涉及医疗领域，具体涉及二氧化锰纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞内microrna的检测与成像。

背景技术：

microrna(mirna)是存在于真核生物中的一组非编码rna分子，其通过调节基因的表达在多种生物过程中发挥重要作用，如细胞增殖、分化和凋亡。越来越多的证据表明，mirna表达水平的改变与癌症的发生和发展密切相关。例如，mirna-21在多种癌症中过表达，如乳腺癌、肝癌和肺癌。因此，mirna可作为潜在的癌症生物标志物。mirna的检测对于早期癌症诊断具有重要意义。然而，由于mirna自身特点的局限性，例如短的序列(约22个核苷酸)、低丰度、家族成员之间的高序列同源性和易降解性，mirna检测方法必须具有高灵敏度和准确性。

传统的mirna检测方法包括northern印迹、实时定量聚合酶链反应(qrt-pcr)和微阵列。虽然这些方法可以在溶液或细胞裂解液中实现mirna的检测，但是它们需要耗时的步骤，实验复杂且昂贵，限制了它们的广泛应用。为解决这些问题，引入了新的mirna检测方法，如电化学方法、表面增强拉曼方法、比色法和荧光法。其中，荧光方法由于耗时短、重现性好、简单且灵敏而备受关注。此外，荧光成像可用于细胞水平上目标物的检测。

目前，已经使用荧光成像技术设计了一系列用于活细胞中mirna的检测方法。分子信标(mb)作为一种检测活细胞中mirna的方法，其通过简单的设计，目标物可以与mb杂交产生荧光信号，从而实现mirna的检测。然而，mb通过转染递送到细胞中，转染效率低，信号表达有限。为解决此问题，一类使用纳米材料作为载体的方法已被用于mirna的检测。wang研究小组设计了一种载有金纳米粒子的分列式dna酶探针，用于癌细胞中mirna的成像。kuang等人基于金纳米粒子和量子点开发了dna驱动的核心-卫星组装探针实现了细胞内mirna的检测。然而，这些检测方法集中于单响应信号并基于检测荧光强度的绝对变化。可能会受到各种环境因素的干扰，包括核酸酶降解、热力学波动、探针浓度分布不均、细胞自发荧光和光源漂移等，影响检测的准确性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测mirna探针组、生物传感器、试剂盒及使用该探针组、生物传感器、试剂盒检测mirna的方法和应用。

本发明的方法、探针组、生物传感器以及试剂盒基于mno2纳米片介导的比率荧光法，因此可以在两个不同波长下同时测量荧光强度。并且可以避免由实验环境(酶降解、热力学波动、探针浓度分布不均匀和光源漂移等)引起的假阳性信号。具有较高的灵敏度以及对mirna-21的高选择性。能够用于区分正常细胞和癌症细胞(比如区分l02和hepg-2细胞)中mirna-21的表达水平。与mirna相关疾病的诊断上拥有潜在的应用价值。

本发明是通过如下所述的技术方案实现的：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种检测mirna的方法，所述方法包括将mno2纳米片、含有荧光供体的探针h1、含有荧光受体的探针h2与待测样品混合，检测供体荧光信号与受体荧光信号的变化，以荧光受体与荧光供体的荧光强度的比值作为荧光比率信号。所述方法为体外检测。

含有荧光供体的探针h1、含有荧光受体的探针h2为发夹探针，该h1探针和h2探针中存在互补序列，互补序列分别位于其发夹茎中，以阻断二者之间的自发自组装。

通常情况下，该自发自组装可在接触目标分子后触发。h1探针中存在目标识别单元，当其与待测目标mirna(比如mirna-21)接触后可与待测目标mirna识别后杂交(h1-mirna)，使h1发夹茎中隐藏的粘性末端暴露并识别h2，即h1发夹茎中的与h2互补的序列暴露后识别h2，实现h2与mirna的置换，形成稳定的h1-h2双链体结构。此外，h2探针中可以含有扩增单元。释放出的待测目标mirna可以触发下一组h1和h2的上述组装，并产生大量h1-h2双链体结构，使信号放大。

不同于常规方法仅以mirna触发互补探针间的自组装方式，除本发明上述将互补序列设置在发夹茎中以阻止h1探针和h2探针的自发自组装外，本发明的方法中应用了mno2纳米片与还原物质的组合，上述探针吸附于mno2纳米片上，通过还原剂比如gsh(谷胱甘肽)，将mno2还原为mn²⁺并释放h1和h2探针，以实现对h1探针和h2探针自组装的双控作用，即仅在待测目标存在下是无法触发h1探针和h2探针自发自组装的，只有在还原剂，比如gsh存在下释放h1和h2探针后才会实现上述触发。如此，可以防止非特定触发，比如因背景信号泄露等因素导致的非特定触发。

在mirna和gsh存在下，含有荧光供体的探针h1、含有荧光受体的探针h2自组装形成h1-h2双链体结构，荧光供体和荧光受体相互靠近发生荧光共振能量转移，产生供体荧光信号与受体荧光信号的变化。供体信号降低，受体信号增强，以此荧光信号变化作为荧光比率信号用于mirna比如mirna-21检测。

即，以(fa/fd)positive和(fa/fd)negative的荧光强度的值分别代表存在和不存在mirna(比如mirna-21)时荧光受体与荧光供体的比值，以(fa/fd)positive/(fa/fd)negative作为传感器的输出信号。

优选地，所述荧光供体为fam；所述荧光受体为tamra。

优选地，所述含有荧光供体的探针h1的序列为：

5’-tcagactgatgttcgtagcttatcaacatcagtctgataagcta-fam-3’；所述含有荧光受体的探针h2的序列为：

5’-ttcgt-(tamra)agcttatcagactgatgttgataagctacgaacatcagt-3’。

荧光供体位于h1探针的3’末端，其便于接近位于h2上的荧光受体，两者相互靠近时发生荧光共振能量转移，产生供体荧光信号与受体荧光信号的变化。

关于荧光信号的检测，不同于常规的电化学方法、表面增强拉曼方法、比色法和荧光法，其主要集中于单响应信号或单染料检测，比如集中于检测荧光强度的绝对变化，这样会受到各种环境因素的干扰，包括核酸酶降解、热力学波动、探针浓度分布不均、细胞自发荧光和光源漂移等，影响检测的准确性。而本发明的检测方法采用比率荧光法，本发明以供体荧光强度和受体荧光强度的比值的变化作为荧光比率信号(如上所述，可表示为(fa/fd)positive/(fa/fd)negative)，与单染料检测相比，比率荧光法可以在两个不同波长下同时测量其荧光强度。可以避免由实验环境(酶降解、热力学波动、探针浓度分布不均匀和光源漂移等)引起的假阳性信号。检测更为灵敏和准确。

优选地，所述含有荧光供体的探针h1和含有荧光受体的探针h2吸附在mno2纳米片上；优选地，所述吸附为物理吸附，比如通过范德华力进行吸附。

优选地，所述待测样品中含有还原剂，所述还原剂优选为gsh；

优选地，所述待测样品为细胞，所述细胞中含有gsh；优选地，所述细胞为肝细胞，所述肝细胞可以为正常细胞或癌细胞，比如l02细胞和hepg-2细胞。

优选地，所述细胞可通过如下方法在体外孵育：

l02细胞用dmem培养基孵育，其中培养液中混有10％胎牛血清和1％青链酶素混合液。hepg-2细胞用mem培养基培养，培养液中混有10％胎牛血清和1％青链酶素混合液。所有细胞在含有5％co2和95％空气的环境中37℃孵育。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种检测mirna的探针组，其包含h1探针和h2探针；h1探针含有荧光供体，h2探针含有荧光受体；h1、h2探针均为发夹探针，所述h1探针和h2探针中存在互补序列，互补序列分别位于其发夹茎中。

h1探针中存在目标识别单元，当其与待测目标mirna(比如mirna-21)接触后可与待测目标mirna识别后杂交，使h1发夹茎中隐藏的粘性末端暴露并识别h2，即h1发夹茎中的与h2互补的序列暴露后识别h2，实现h2与mirna的置换，形成稳定的h1-h2双链体结构。此外，h2探针中可以含有扩增单元。释放出的待测目标mirna可以触发下一组h1和h2的上述组装，并产生大量h1-h2双链体结构，使信号放大。

优选地，所述h1探针序列为：

5’-tcagactgatgttcgtagcttatcaacatcagtctgataagcta-fam-3’；所述h2探针的序列为：

5’-ttcgt-(tamra)agcttatcagactgatgttgataagctacgaacatcagt-3’。

荧光供体位于h1探针的3’末端，其便于接近位于h2上的荧光受体，两者相互靠近时发生荧光共振能量转移，产生供体荧光信号与受体荧光信号的变化。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种检测mirna的生物传感器，其包含mno2纳米片及吸附在其上的探针组，所述探针组如上所述。

吸附在mno2纳米片上的探针组在含有还原剂比如gsh的待测样品(含有mirna)中释放出h1探针和h2探针，h1探针与待测目标mirna识别后杂交，使h1发夹茎中隐藏的粘性末端暴露并识别h2，即h1发夹茎中的与h2互补的序列暴露后识别h2，实现h2与mirna的置换，形成稳定的h1-h2双链体结构。此外，h2探针中含有扩增单元。释放出的待测目标mirna可以触发下一组h1和h2的上述组装，并产生大量h1-h2双链体结构，使信号放大。如此，实现生物传感。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种检测mirna的试剂盒，其包括如上所述的探针组。

优选地，所述试剂盒中还含有mno2纳米片。

优选地，所述mno2纳米片在tma·oh(四甲基氢氧化铵)存在下，利用h2o2氧化mncl2·4h2o制备。

优选地，所述制备方法包括以下步骤：在搅拌下将包含h2o2和tma·oh的混合物与mncl2·4h2o溶液混合，混合时间控制在15秒内，将得到的深棕色悬浮液在室温下搅拌过夜，然后通过离心收集；然后，将得到的粗产物用水和甲醇洗涤数次，干燥除去残留溶剂得到mno2固体；将mno2固体分散于水中超声、离心取上清液，即得。

优选地，在一个较为具体的实施方式中，mno2纳米片通过如下方法制备：在搅拌下将20ml包含3wt％h2o2和0.6mtma·oh的混合物与10mlmncl2·4h2o(0.3m)溶液混合。混合时间控制在15秒内。将得到的深棕色悬浮液在室温下搅拌过夜，然后通过离心(10000rpm，10分钟)收集。然后，将得到的粗产物用水和甲醇洗涤数次，并在60℃下干燥12小时以除去残留的溶剂。最后，为了获得mno2纳米片，将5mgmno2固体分散于10ml水中超声10小时以上，离心取上清液，即得。

优选地，所述试剂盒中还含有tris-hcl缓冲液。

所述tris-hcl缓冲液由0.1mtris(三羟甲基氨基甲烷)与0.01mnacl配制而成，ph为7.4。

优选地，所述试剂盒中还含有还原剂，所述还原剂优选gsh。

在本发明的第五方面，本发明提供了上述试剂盒的使用方法，所述方法包括将mno2纳米片与h1探针和h2探针在tris-hcl缓冲液中混合，加入待测样品温育后检测受体荧光信号和供体荧光信号的变化。

所述待测样品中含有还原剂(比如gsh)时，可以不再加入还原剂，所述待测样品中不含有还原剂或无法确定是否含有还原剂时，需在加入待测样品前加入还原剂，比如gsh。

优选地，所述温育条件为：37℃下温育0.5-5小时，比如可以温育40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或5小时。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种体外检测mirna的方法，所述方法包括使用上述试剂盒检测待测样品；

优选地，所述方法包括将h1和h2制备成发夹结构后与mno2纳米片在tris-hcl缓冲液中混合，加入还原剂，然后加入待测样品温育后检测荧光信号的变化。

优选地，所述方法包括以下步骤：h1和h2在95℃退火5分钟，然后缓慢冷却至室温并保持2小时，以形成发夹结构；随后，将mno2纳米片(40μgml^-1)与h1(20nm)和h2(120nm)在tris-hcl缓冲液(0.1mtris，0.01mnacl，ph7.4)中混合，然后加入gsh(1mm)。最后，加入目标mirna-21，在37℃温育40分钟以引发探针自组装反应。

在本发明的第七方面，本发明还提供了上述探针组在体外mirna检测或成像中的应用。所述mirna为mirna-21。

在本发明的第八方面，本发明还提供了上述生物传感器在体外mirna检测或成像中的应用。所述mirna为mirna-21。

在本发明的第九方面，本发明还提供了上述试剂盒在体外mirna检测或成像中的应用。所述mirna为mirna-21。

在本发明的第十方面，本发明还提供了一种体外细胞成像的方法，所述方法基于mirna(比如mirna-21)，其包括将吸附有上述h1和h2探针的mno2纳米片递送到细胞中，并在37℃下孵育1-5小时，优选4小时，然后进行荧光成像。所述h1和h2探针以及mno2纳米片如上所述。荧光成像可用于细胞水平上目标物的检测。所述mirna为mirna-21。

优选地，所述细胞中含有gsh；

优选地，所述细胞在成像前用pbs缓冲液清洗数次，比如1-5次，优选3次。

优选地，所述细胞在体外孵育时，可使用常规方法孵育，或者优选在培养液中加入胎牛血清和青链酶素混合液，培养环境优选为含有体积分数5％co2和95％空气的37℃环境中。

比如，所述细胞为肝细胞，比如l02细胞或hepg-2细胞时，所述孵育条件为：l02细胞用dmem培养基孵育，其中培养液中混有体积分数10％胎牛血清和质量分数1％青链酶素混合液(青链双抗)。hepg-2细胞用mem培养基培养，培养液中混有10％胎牛血清和1％青链酶素混合液。所有细胞在含有5％co2和95％空气的环境中37℃孵育。

以l02细胞和hepg-2细胞为例，本发明在实施例中对离体活细胞中mirna-21进行了成像。当细胞与传感器孵育4小时后，hepg-2细胞表现出弱的绿色荧光信号(fam)和明显的红色荧光信号(tamra)，而l02细胞显示出强烈的绿色荧光和可忽略的红色荧光。

在本发明的十一方面，本发明还提供了上述探针组在体外区分正常细胞和癌症细胞中的应用。所述细胞中含有gsh，优选地，所述细胞选自乳腺细胞、肝细胞和肺细胞，优选为肝细胞，比如区分hepg-2和l02细胞。

在本发明的第十二方面，本发明还提供了上述生物传感器在在体外区分正常细胞和癌症细胞中的应用。所述细胞中含有gsh，优选地，所述细胞选自乳腺细胞、肝细胞和肺细胞，优选为肝细胞，比如区分hepg-2和l02细胞。

在本发明的第十三方面，本发明还提供了上述试剂盒在体外区分正常细胞和癌症细胞中的应用，所述细胞选自乳腺细胞、肝细胞和肺细胞，优选为肝细胞，比如区分hepg-2和l02细胞。

以l02细胞和hepg-2细胞为例，本发明在实施例中对活细胞中mirna-21进行了成像，过表达mirna-21的癌细胞hepg-2被选择作为阳性细胞，具有最低水平mirna-21的正常细胞l02作为阴性细胞。当细胞与传感器孵育4小时后，hepg-2细胞表现出弱的绿色荧光信号(fam)和明显的红色荧光信号(tamra)，表明hepg-2高表达mirna-21。然而，l02细胞显示出强烈的绿色荧光和可忽略的红色荧光，表明l02细胞具有低的mirna-21表达水平。本发明可以区分正常细胞和癌细胞。

以及，本发明还提供了上述探针组或试剂盒或生物传感器在检测癌症生物标记物mirna中的应用；优选地，所述癌症选自乳腺癌、肝癌和肺癌；优选为肝癌；所述生物标记物mirna为mirna-21。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的mno2纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞中mirna检测和成像的原理示意图。

图2为本发明的mno2纳米片的表征。

其中：(a)tem图像，(b)uv-vis吸收光谱，(c)dls分布。

图3为不同浓度本发明的mno2纳米片对探针h1(a，20nm)和h2(b，120nm)荧光猝灭的发射光谱。激发为488nm。其中，a、b两图中曲线的顺序自上而下与图例顺序一致。

图4为不同浓度gsh对探针h1/mno2(a)和h2/mno2(b)荧光恢复的发射光谱。激发为488nm。其中，a、b两图中曲线的顺序自上而下与图例顺序一致。

图5为：(a)不同体系的荧光分析；520nm处自上而下第一条(最上方)曲线，h1；520nm处自上而下第四条(最下方)曲线，h2；520nm处自上而下第二条曲线，h1+h2；520nm处自上而下第三条曲线，h1+h2+mirna-21。激发为488nm。(b)page分析；泳道m，marker；泳道1，mirna-21；泳道2，h1；泳道3，h2；泳道4，h1+h2；泳道5，h1+h2+mirna-21。

图6为dnasei对比率探针(a)和单染料探针(b)的影响结果。

图7为mirna-21与(fa/fd)positive/(fa/fd)negative的线性关系，其中，a图中曲线的顺序自上而下与图例顺序一致(520nm处)。

图8为不同mirna对(fa/fd)positive/(fa/fd)negative的影响柱状图。

图9为hepg-2细胞与探针的孵育时间优化结果。

图10为hepg-2和l02细胞的细胞内成像。

图11为qtt-pcr分析l02细胞和hepg-2细胞中mirna-21的相对表达水平柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

化学品和试剂：以下实施例中涉及的所有dna寡核苷酸序列、mirna、dnasei核酸内切酶和焦碳酸二乙酯水(depc水)均购自上海生工生物技术有限公司。三羟甲基氨基甲烷(tris)、氯化锰四水合物(mncl2·4h2o)、四甲基氢氧化铵(tma·oh)、过氧化氢(h2o2)和还原型谷胱甘肽(gsh)购自麦克林生化科技有限公司。细胞培养基、青链酶素混合液、胎牛血清和pbs购自biologicalindustries。实验中所用化学品均为分析纯，且使用过程中无需进一步纯化。所有的溶液均采用depc水制备。其中，以下实施例中涉及的所有寡核苷酸和mirna序列如表1所示。

表1.该工作中所使用的寡核苷酸序列

仪器：以下实施例中涉及的荧光光谱测量在日立f-7000荧光分光光度仪上进行。发射光谱范围为510～650nm，激发波长为488nm。520nm和570nm处的荧光强度用于评估该传感系统的性能。紫外可见吸收光谱由u-2910分光光度计(日本)获得。透射电子显微镜由jem-1011(日本)记录。用axioobserver3(蔡司，德国)倒置荧光显微镜拍摄荧光图像。

实施例1、mno2纳米片的合成

在搅拌下将20ml包含3wt％h2o2和0.6mtma·oh的混合物与10mlmncl2·4h2o(0.3m)溶液混合。混合时间控制在15秒内。将得到的深棕色悬浮液在室温下搅拌过夜，然后通过离心(10000rpm，10分钟)收集。然后，将得到的粗产物用水和甲醇洗涤数次，并在60℃下干燥12小时以除去残留的溶剂。最后，为了获得mno2纳米片，将5mgmno2固体分散于10ml水中超声10小时以上，离心取上清液进行后续实验。

实施例2、体外mirna-21的荧光检测及凝胶电泳分析

体外mirna-21的荧光检测：h1和h2在95℃退火5分钟，然后缓慢冷却至室温并保持2小时，以形成发夹结构。随后，将实施例1制备的mno2纳米片(40μgml^-1)与h1(20nm)和h2(120nm)在tris-hcl缓冲液(0.1mtris，0.01mnacl，ph7.4)中混合，然后加入gsh(1mm)。最后，加入目标mirna-21，在37℃温育40分钟以引发催化发夹自组装(cha)反应。

将cha反应的产物用于凝胶电泳分析，方法如下：

凝胶电泳分析(page)：利用15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析实施例2中cha反应的产物。使用1×tbe(89mmtris，89mmboricacid，2.0mmedta，ph8.3)作为电泳缓冲液，在恒定电流30毫安的条件下电泳2h。凝胶用sybrgold染色40分钟,然后通过uv成像系统成像。

实施例3、细胞孵育及荧光成像

细胞孵育：l02细胞用dmem培养基孵育，其中培养液中混有体积分数10％胎牛血清和质量分数1％青链酶素混合液。hepg-2细胞用mem培养基培养，培养液中混有10％胎牛血清和1％青链酶素混合液。所有细胞在含有体积分数5％co2和95％空气的环境中37℃孵育。

荧光成像：将上述孵育的l02和hepg-2细胞平铺在载玻片上，并在37℃孵育24小时。然后，细胞用pbs缓冲液清洗三次。随后，利用实施例1制备的mno2纳米片将发夹h1和h2递送到细胞中并进一步在37℃下孵育4小时。最后，利用荧光显微镜进行荧光成像。

结果与讨论

1、mirna检测与设计原理

所提出的mno2纳米片介导的比率荧光生物传感器的原理如图1所示。传感器包含有mno2纳米片和发夹h1和h2。其中，mno2纳米片可以吸附h1和h2作为dna纳米载体。发夹h1含有荧光供体(fam)和目标mirna-21的识别单元。发夹h2含有荧光受体(tamra)和扩增单元。由于h1和h2的互补序列在发夹茎中，阻断了二者之间的自发自组装。当传感器进入细胞后，mno2纳米片被细胞内gsh还原为mn²⁺并释放发夹h1和h2。细胞内目标mirna-21与h1的识别单元杂交使h1茎中隐藏的粘性末端暴露并识别h2。h2可以替代mirna-21形成稳定的h1-h2双链结构。在cha过程中，h13'末端的荧光供体接近位于h2中的受体，并产生荧光共振能量转移。此时，供体信号降低，受体信号增强，以此信号变化作为荧光比率信号用于mirna-21检测。此外，释放出的目标mirna-21可以触发下一个cha反应，并产生大量h1-h2复合物，使信号放大。以这种方式，可实现mirna-21的检测和细胞内成像。

2、mno2纳米片的合成和表征

首先，通过tem、紫外-可见光谱和动态光散射(dls)对实施例1制备的mno2纳米片进行了表征。如图2所示，合成的产物呈层状结构(图2a)，横向直径范围为100-350nm(图2c)，在360nm处具有强的紫外吸收峰(图2b)。结果表明实施例1成功合成了mno2纳米片。

其次，通过荧光分析测试了不同浓度的本发明的mno2纳米片(实施例1制备)对荧光染料(fam和tamra)的猝灭能力。如图3a所示，fam标记的h1在520nm附近显示强的荧光发射。随着本发明的mno2纳米片(实施例1制备)浓度的增加，荧光强度逐渐降低，直至在40μgml^-1时完全淬灭。利用本发明的mno2纳米片(实施例1制备)猝灭tamra标记的探针h2也得到了相同的结论(图3b)。这些结果表明，本发明的mno2纳米片可以有效地淬灭染料的荧光。此外，当gsh存在时，因为本发明的mno2纳米片(实施例1制备)可以被降解并释放探针，h1和h2的荧光逐渐恢复，如图4所示。

3、体外检测mirna

实施例2中进行了mno2纳米片介导的比率荧光生物传感器体外检测mirna并进行了凝胶电泳分析实验。

如图5a所示，归因于荧光共振能量转移对的分离，可以观察到在520nm处h1显示出强的荧光(即图5a中520nm处最上方曲线)，h2在570nm处呈现弱荧光发射峰(即图5a中520nm处最下方曲线)。当加入mirna-21时，h1的荧光发射峰减弱而h2的荧光发射峰增强。产生原因为供体和受体彼此接近，导致能量从供体转移到受体。(fa/fd)positive和(fa/fd)negative的荧光强度的值分别代表存在和不存在mirna-21时受体与供体的比值，其可作为传感器的输出信号。

为了进一步验证实验，实施例2中利用page对cha反应产物进行了分析。如图5b所示，泳道1、2和3中分别对应于mirna-21、h1和h2。单独的h1和h2混合，没有观察到明显的h1-h2双链带(泳道4)，这表明发夹h1和发夹h2可以在溶液中共存，且不发生cha反应。当目标物存在时，出现分子量较大的条带(泳道5)，表明触发了cha并形成了两个发夹的自组装复合物。这些结果表明该方法可行。

4、对照实验

此外，本发明还探究了核酸酶dnasei对比率荧光探针和单染料荧光探针(h3)的影响(图6)。当dnasei与比率荧光探针h1、h2混合时，fa/fd的比值几乎不变，表明无假阳性信号的产生。然而，当dnasei与单染料荧光探针混合时，随着时间的增加，荧光信号逐渐增强，这无法与真正的mirna-21结合所产生的信号区分，假阳性信号较大。实际上，两种类型的探针都可被dnasei破坏。不同之处在于单个染料探针被破坏后信号会发生变化，而比率探针信号不变，因为供体和受体并没有相互靠近。因此，可以得出比率探针可有效避免假阳性信号的产生，提高mirna检测的准确性。

5、灵敏度实验

本发明还利用加入不同浓度mirna-21时(fa/fd)positive/(fa/fd)negative的比值来评估传感系统的分析性能。如图7所示，(fa/fd)positive/(fa/fd)negative的值在0.1-20nm的浓度范围呈线性增强，线性方程为(fa/fd)positive/(fa/fd)negative＝0.2352c+1.0001(c代表mirna-21的浓度；r＝0.9974)。mirna-21的检测限(lod)(3σ/k，σ是空白溶液的标准偏差)为73pm。该结果表明，比率荧光生物传感器可以实现mirna-21的灵敏检测。

6、选择性实验

家族成员之间的序列相似性是mirna的一个重要特征，细胞内mirna检测的一个巨大挑战是区分mirna家族成员之间的差异。为了进一步验证传感系统的特异性，实验分别将相同浓度的mirna-21、mirna-141、let-7a、let-7b和mirna-21-5p加入到反应溶液中(按照实施例2的方法进行)。如图8所示，干扰mirna(即mirna-141、let-7a、let-7b和mirna-21-5p)的荧光比值几乎不发生改变，表明所提出的传感器对mirna-21的检测具有良好的选择性。

7、细胞成像实验

按照实施例3的方法，将hepg-2细胞与mno2纳米片(实施例1制备)和发夹dna(h1和h2)孵育不同的时间以优化探针和细胞之间的孵育时间。如图9所示，随着孵育时间的延长，hepg-2细胞的红色荧光(tamra)逐渐增加，直到4小时达到饱和。随着孵育时间的进一步延长，荧光成像强度无变化。结果表明本发明的生物传感器可以实现细胞内mirna成像，且反应可在4小时内完成。

本发明的生物传感器对活细胞中mirna-21成像的性能实验。过表达mirna-21的癌细胞hepg-2被选择作为阳性细胞，具有最低水平mirna-21的正常细胞l02作为阴性细胞。如图10所示，当细胞与传感器孵育4小时后，hepg-2细胞表现出弱的绿色荧光信号(fam)和明显的红色荧光信号(tamra)，表明hepg-2高表达mirna-21。然而，l02细胞显示出强烈的绿色荧光和可忽略的红色荧光，表明l02细胞具有低的mirna-21表达水平。这些结果与qrt-pcr结果一致(图11)。实验结果表明，本发明的比率成像传感器可以区分正常细胞和癌细胞，可应用于癌症诊断中。

本发明构建的mno2纳米片介导的比率荧光生物传感器用于活细胞中mirna的检测和成像。与单染料检测相比，比率荧光法可以在两个不同波长下同时测量其荧光强度。可以避免由实验环境(酶降解、热力学波动、探针浓度分布不均匀和光源漂移等)引起的假阳性信号。cha反应确保实验有较高的灵敏度。此外，该生物传感器可用于区分hepg-2和l02细胞中mirna-21的表达水平。这些结果表明所构建的生物传感器在与mirna相关疾病的诊断方面拥有潜在的应用价值。

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<110>山东大学

<120>二氧化锰纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞内microrna的检测与成

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