基于雄激素受体识别元件和G-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法与流程

本发明涉及一种基于雄激素受体识别元件和g-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法，属于分析化学和临床诊断技术领域。

背景技术：

雄激素是体内非常重要的类固醇激素，在体内主要为睾酮及少量脱氢表雄酮和雄烯二酮，在男性生殖系统中发挥着重要的生理学作用，如：影响男性生殖器官的发育和精子的发生和成熟，促进第二性征的出现及维持男性正常的性功能。而雄激素作用的发挥必须借助其受体—雄激素受体(androgenreceptor,ar)，若无ar，则雄激素对组织无刺激反应，ar是雄激素作用的中介物质。研究表明，ar与前列腺癌、良性前列腺增生、肯尼迪病、男性不孕、雄激素不敏感综合症以及男性乳癌等疾病的发生、发展有密切关系。因此，研究一种高灵敏检测ar的方法，为临床提供更可靠的资料，对前列腺癌等疾病的研究和诊断有着重要的意义。

传统的ar检测方法有蛋白印迹、免疫组化和酶联免疫吸附法。蛋白印迹和免疫组化是典型的半定量检测模式，不能精确的测定受体含量。酶联免疫吸附法虽然可以定量检测，但是需要特异性标记的抗体，耗时且不经济。因而，建立操作简单便携、特异性好、灵敏度高的ar检测方法，对ar理论研究和临床诊断都具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是将蛋白-核酸识别技术、信号放大技术与生物传感技术相结合，用雄激素受体识别元件进行靶标识别，通过杂交链式进行信号放大，g-四链体-血红素复合物作为信号标记，建立了一种灵敏度高、特异性强的针对ar的检测方法。

本发明的技术方案，一种基于雄激素受体识别元件(androgenreceptorresponseelement,are)和g-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体(androgenreceptor,ar)的电化学方法，合理设计了两条具有特定序列的单链dna探针p1和p2，用以构建雄激素受体ar结合探针arbp；p1的5’端序列和p2的3’端序列互补，其杂交后形成一端为序列互补的双链dna，其中包含雄激素受体识别元件are，并在末端带有巯基修饰，另一端为非互补的能够引发g-四链体杂交链式放大反应的单链末端区；通过自组装将arbp的双链端以au-s键固定至金电极表面，形成探针修饰的电极；利用ar与arbp中are部分的特异性识别和结合屏蔽住arbp本身含有的限制性内切酶nspi的酶切位点，避免nspi对arbp的切割；在g-四链体杂交链式放大反应中，合理设计了四段g-四链体形成探针hp1、hp2、hp3和hp4，hp1和hp2、hp3和hp4两两互补配对，不断自发地在arbp的单链端形成两段具有极多数量g-四链体结构的杂交链，与血红素结合形成具有氧化还原活性的g-四链体-血红素复合物，其数量与ar的浓度密切相关；最后通过差分脉冲伏安法dpv测定峰电流值与ar浓度间的线性关系建立标准曲线；以同样的步骤和试剂对人血清样品中的ar进行检测。

在该方法体系中设计了六个特殊的dna序列：形成arbp的探针p1和p2，能够自组装形成g-四链体的四个g-四链体形成探针hp1、hp2、hp3和hp4。

特殊设计的p1和p2部分互补形成的arbp中包含一段雄激素受体识别元件(androgenreceptorresponseelement,are)，其另一端以非互补的单链存在，为g-四链体形成探针的捕捉序列，分别与hp1和hp3部分互补，且互补区域的长度大于发夹dna本身的茎环长度。

四个g-四链体形成探针的两端均含有能形成g-四链体的碱基序列，中间含有能与其它g-四链体形成探针互补配对的核酸序列，如hp1与hp2部分核酸序列互补，hp3和hp4互补，合理的设计四段g-四链体形成探针的茎环，使得它们在溶液中共存时能够维持原本的茎环结构不变。只有当体系中存在p1、p2的单链末端时，由于碱基的互补配对扰乱了原本的构象平衡，hp1和hp2、hp3和hp4两两互补配对，不断自发地在两个单链末端上形成两段具有数量极多的g-四链体的杂交链。

将雄激素受体结合探针(arbp)固定到金电极表面，当体系中含有ar时，ar能与arbp紧密结合，从而包裹屏蔽了arbp双链区含有的nspi的酶切位点。当体系中存在nspi时，nspi只能识别未结合ar的核酸序列，此时ar和arbp按摩尔比1:1的比例存留在金电极表面。向体系中加入四段g-四链体形成探针后，g-四链体形成探针会不断地杂交到arbp的单链末端上形成数量极多的g-四链体杂交链，此时ar与g-四链体数量的摩尔比例为1:n，从而实现了信号的放大。在有血红素存在时，g-四链体与血红素结合形成具有很强电化学信号的复合物从而提供检测信号。测得的电化学信号与ar浓度存在对应关系，从而实现对ar的定量灵敏检测。

该方法在人血清中也能对ar进行灵敏检测，具体原理如图1所示。通过差分脉冲伏安法(dpv)测定峰电流值与ar浓度间的线性关系建立标准曲线；以同样的步骤和试剂对人血清样品中的ar进行检测。

所述雄激素受体结合探针arbp由两条单链dnap1和p2通过碱基互补配对得到，其中间含有雄激素受体识别元件are，尾部为g-四链体形成探针的捕捉序列。

所述dnap1具体序列如seqidno.1所示；所述dnap2具体序列如seqidno.2所示；

seqidno.1：5’-sh-tttttttgtggagaacagcatgttctccatcaagcaacaagaagaaggtgtttaagta-3’；

seqidno.2：5’-aactccatgccgactcagaacaagcttgatggagaacatgctgttctccac-3’。

hp1具体序列如seqidno.3所示，hp2具体序列如seqidno.4所示，hp3具体序列如seqidno.5所示，hp4具体序列如seqidno.6所示；

seqidno.3：5’-agggcgggtgggtgtttaagttggagaattgtacttaaacacctcttcttgggt-3’；

seqidno.4：5’-tgggtcaattctccaacttaaactagaagaaggtgtttaagtgggtagggcggg-3’；

seqidno.5：5’-agggcgggtgggtgagtcggcatggagtttgccgactcaccatgtcattgggt-3’；

seqidno.6：5’-tgggtaactccatgccgattctatgacatggtgagtcggcatgggtagggcggg-3’。

具体步骤如下：

（1）ar结合探针arbp的形成：将0.1μmol·l^-1巯基修饰的p1和0.1μmol·l^-1与其部分互补的探针p2在10mmol·l^-1tris-hcl缓冲液中，经过95℃变性5min，室温复性2h处理形成部分互补的双链dnaarbp备用；

（2）g-四链体形成探针的预处理：用10mmol·l^-1pb缓冲液分别将hp1、hp2、hp3和hp4溶解并稀释至1μmol·l^-1，在95℃变性5min并置于60℃退火1h以形成发夹结构；

（3）金电极的预处理：用粒径为0.5μm及0.05μm氧化铝粉末依次分别小心地抛光直径3mm的金电极，然后分别在超纯水、乙醇、超纯水中40khz超声清洗2-3min；通过在0.5mol·l^-1h2so4中于0.35v~-1.5v循环伏安扫描，扫描速度100mv/s，进行电化学活化，直至获得稳定的循环伏安图为止，最后将处理好的金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干备用；

（4）arbp的固定：将步骤（3）所得金电极浸于100μl0.1μmol·l^-1的arbp中，室温孵育16h，使arbp在金电极表面上形成自组装单分子层；用1mmol·l^-1巯基己醇封闭电极30min，得到修饰arbp的金电极；

（5）样品中ar与arbp的结合：将步骤（4）得到的修饰arbp的金电极浸于50μl含有不同浓度ar的10mmol·l^-1pbs样品中，37℃孵育40min使得ar紧密地结合到arbp上；

（6）限制性内切酶nspi的切割：将步骤（5）得到的金电极浸于50μl含有10unspi内切酶的1×cutsmart缓冲液中，37℃孵育2h以进行酶切反应；

（7）g-四链体杂交链式放大反应：将步骤（6）得到的金电极浸于100μl含有步骤（2）处理后的1μmol·l^-1hp1、hp2、hp3和hp4的pbs缓冲液中，室温反应4h；

（8）g-四链体-血红素复合物的形成：将200μl的g-四链体形成液倒扣在步骤（7）得到的电极上，室温下放置30min；向g-四链体形成液中加入2μl20mmol·l^-1的血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下放置1h；用超纯水冲洗电极，用于电化学检测；

（9）电化学检测：采用三电极系统，步骤（8）所得金电极作为工作电极，ag/agcl作为参比电极，铂丝作为对电极；工作溶液为ph7.4，含20mmol·l^-1kcl的20mmol·l^-1hepes缓冲液，检测前先通入氮气30min；采用差分脉冲伏安法dpv，扫描范围-0.6~-0.15v，振幅50mv；将一系列不同浓度的ar样品对应的电极测得的dpv曲线中的峰电流对ar浓度作图得到标准曲线；

（10）人血清中ar的检测：将不同浓度ar添加至人血清中制备得到人工添加ar的血清，在与标准品相同的条件下进行检测。

进一步的，所述tris-hcl缓冲液中含有10mmol·l^-1三(2-羧乙基)膦tcep，100mmol·l^-1nacl，其ph为7.4。

进一步的，所述pbs缓冲液中含有100mmol·l^-1nacl，1mmol·l^-1mgcl2和10mmol·l^-1kcl，其ph为7.4。

步骤（8）中的g-四链体形成液为含有10mmol·l^-1hepes，50mmol·l^-1kcl，ph为8.0的溶液。

本发明的有益效果：本发明构建了一种灵敏度高、特异性强的电化学生物传感器，实现了对ar的高灵敏检测；将电化学检测跟信号放大技术联合起来，提高检测灵敏度；检测原理的通用性使该方法还适合基于不同的蛋白识别元件实现对不同目标物的检测。

附图说明

图1基于雄激素受体识别元件和g-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的原理图。

图2dpv曲线中峰电流值与ar浓度关系标准曲线。

具体实施方式

实施例1dpv曲线中峰电流与雄激素受体浓度标准曲线的绘制

将arbp固定至电极，经过不同浓度的ar样品孵育、nspi切割、g-四链体杂交链式放大反应以及g-四链体-血红素复合物形成后所得到电极作为工作电极，用差分脉冲伏安法(dpv)进行测定。

具体步骤如下：

（1）ar结合探针arbp的形成：将0.1μmol·l^-1巯基修饰的p1和0.1μmol·l^-1与其部分互补的探针p2在10mmol·l^-1tris-hcl缓冲液中，经过95℃变性5min，室温复性2h处理形成部分互补的双链dnaarbp备用；

（2）g-四链体形成探针的预处理：用10mmol·l^-1pb缓冲液分别将hp1、hp2、hp3和hp4溶解并稀释至1μmol·l^-1，在95℃变性5min并置于60℃退火1h以形成发夹结构；

（3）金电极的预处理：用粒径为0.5μm和0.05μm氧化铝粉末分别依次小心地抛光直径3mm的金电极，然后分别在超纯水、乙醇、超纯水中40khz超声清洗2-3min；通过在0.5mol·l^-1h2so4中于0.35v~-1.5v循环伏安扫描，扫描速度100mv/s，进行电化学活化，直至获得稳定的循环伏安图为止，最后将处理好的金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干备用；

（4）arbp的固定：将步骤（3）所得金电极浸于100μl0.1μmol·l^-1的arbp中，室温孵育16h，使arbp在金电极表面上形成自组装单分子层；用1mmol·l^-1巯基己醇封闭电极30min，得到修饰arbp的金电极；

（5）样品中ar与arbp的结合：将步骤（4）得到的修饰arbp的金电极浸于50μl含有不同浓度ar的10mmol·l^-1pbs样品中，37℃孵育40min使得ar紧密地结合到arbp上；

（6）限制性内切酶nspi的切割：将步骤（5）得到的金电极浸于50μl含有10unspi内切酶的1×cutsmart缓冲液中，37℃孵育2h以进行酶切反应；

（7）g-四链体杂交链式放大反应：将步骤（6）得到的金电极浸于100μl含有步骤（2）处理后的1μmol·l^-1hp1、hp2、hp3和hp4的pbs缓冲液中，室温反应4h；

（8）g-四链体-血红素复合物的形成：将200μl的g-四链体形成液倒扣在步骤（7）得到的电极上，室温下放置30min；向g-四链体形成液中加入2μl20mmol·l^-1的血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下放置1h；用超纯水冲洗电极，用于电化学检测；

（9）电化学检测：采用三电极系统，步骤（8）所得金电极作为工作电极，ag/agcl作为参比电极，铂丝作为对电极；工作溶液为ph7.4，含20mmol·l^-1kcl的20mmol·l^-1hepes缓冲液，检测前先通入氮气30min；

采用差分脉冲伏安法dpv，扫描范围-0.6~-0.15v，振幅50mv；测定在不同浓度ar条件下进行g-四链体杂交链式放大反应后的dpv曲线，并读出dpv曲线中的峰电流值，以峰电流值对ar浓度作图，绘制出线性拟合曲线(图2)。

随着ar浓度的增加，氧化峰电流信号也随之增强，在ar浓度在50fmol·l^-1到500pmol·l^-1范围内，峰电流与ar浓度的对数呈线性相关，拟合回归方程y=0.02955logx+0.45705(x是ar浓度/fmol·l^-1，y是峰电流值/µa)，线性相关系数0.994。该方法对ar检测限达到7.64fmol·l^-1。

实施例2对ar检测的特异性分析

比较雄激素受体(ar)、免疫球蛋白g(igg)和人血清白蛋白(hsa)三种不同蛋白存在下的信号响应。相比较于ar蛋白产生的信号增加，igg和hsa信号强度要低得多，从而验证了构建的电化学传感器能很好地分辨ar和其它蛋白。

实施例3在人血清中对ar进行检测

往人血清样品中分别添加一定浓度的ar，以实施例1步骤（1）-（9）同样的操作和试剂进行反应后，测定dpv曲线图，根据dpv曲线中峰电流值从标准曲线中计算出ar浓度的浓度，并据此评估回收率和测定的相对标准差。

序列表

<110>江南大学

<120>基于雄激素受体识别元件和g-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法

<141>2018-11-09

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