专利名称：一种克隆山羊mc4r基因编码区全序列的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种克隆山羊黑素皮质素受体-4(melanocortin-4rec印tor, MC4R)基因基因编码区全序列的方法。
背景技术：
黑素皮质素受体_4(MC4R)是黑素皮质素受体家族的五成员之一，黑素皮质素受体家族是目前所知的最小的G蛋白偶联受体亚家族，它们均属于A类7个跨膜α螺旋G 蛋白受体，是一系列小基因的产物。MC4R基因由单一外显子编码，是由下丘脑腹内侧核 (ventro medial hyp ο thai am, VMH)分泌的一种肽类物质。MC4R与G-蛋白偶联，经cAMP信号通路和磷脂酰肌醇信号通路最终影响细胞内基因的转录和翻译。在人和鼠的体重、能量稳态和采食量的调控中具有重要作用。MC4R可以调节L印tin，是一个调节能量动态平衡的重要的信号分子，大量存在于动物中枢神经系统的各个区域中，包括大脑皮质、丘脑、下丘脑、脑干和脊索，能够通过中枢神经系统调节体重，主要表现为抑制摄食，导致血糖、胰岛素和瘦素水平降低，从而减少体脂、降低体重，在动物的体重、能量稳态和采食量的调控中具有重要作用。RT-PCR克隆是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用质粒PCR产物测序。 此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理， 可利用这一技术很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难于得到的PCR产物；克隆载体PCR测序能克服PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE (cNDA 末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本低，工作量小。该技术成功的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在终止密码子的下游设计下游引物，使得PCR产物包含完整的基因编码区全序列。现有技术中采用RACE (cNDA末端快速扩增)技术是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。1、目的PCR 产物的基因片段长度不明确。2、试验成本高。3、工作量大，实验技术要求高。分段PCR克隆法将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大，一个基因分成几段就需要做几次克隆。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快捷的获取山羊MC4R基因的完整编码区序列的方法，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基石出。本发明采用以下技术方案一种克隆山羊MC4R基因编码区全序列的方法，包括以下步骤
Al、提取山羊眼肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；A2、引物的设计及PCR反应上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为上游引物 Pl :5 ‘ -CTCTCCGCCGCCTAACTTTCGTTT-3 ‘下游引物P2:5' -GTGCCTATAACCTGTGATGTGGAT-3 ‘用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增MC4R基因，温度为范围在50°C到65°C之间的8个温度点.PCR反应体系为IOul体系(5 μ L的2XMaster Mix Tap,上下游引物各 0. 5 μ L，2 μ L 的 cDNA, 2 μ L 的 ddH20.)，反应条件为 95°C预变性 5min, 37 个循环(94°C，30s ； 590C，40s ；72°C，50s)，最后 72°C IOmin ；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。所述的方法，所述步骤Al包括以下步骤用液氮将眼肌磨成粉末装入1. 5ml的EP 管，放入零下80的超低温冰箱中备用；取新的1. 5ml的EP管，加入Iml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末，用手摇晃混勻后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟； 4°C下13000rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另一个新的1. 5ml的EP管，加入0. 2ml 的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；取上层水相0. 5ml于一新的离心管，加入 0. 5ml的异丙醇，室温放置10分钟，4°C下12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入Iml的 75%乙醇混勻，4°C下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，加入30UL到100UL的DEPC水；将效果好的RNA立即反转录成cDNA。所述的方法，所述步骤A3包括以下步骤a.将60μ 1 PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手术刀割下所要回收的DNA的琼脂块，放入1. 5ml离心管称取重量。b.按每0. 1克胶块加入300 μ 1溶胶液；于50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转EP管，以确定胶块充分溶解；c.胶块完全溶解后将溶液温度降至室温，加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中， 12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700 μ 1漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500 μ 1漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液；将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步的试验；f.将吸附柱置于另一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液， 室温放置2min，12000r/min离心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收产物于1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度；所述的方法，所述步骤A3包括以下步骤(1)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试
剂盒使用说明书，操作连接体系为PMD-18T Vector0.5 μ L
纯化回后的PCR片段
Solution I4.5 μ L
Total10.0 μ L以上操作在冰上进行，稍离心混勻，16°C在PCR仪中连接12h，-20°C保存备用；(2)大肠杆菌感受态细胞的制备a.从无抗生素平板上挑取新鲜的E. coli JM109单菌落结种于IOml LB液体培养基中，37°C，250r/min摇菌培养过夜；b.取2ml活化过夜的菌液接种于含50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37°C，250r/ min摇菌培养至0D_ = 0. 3 ；c.将细菌培养物无菌操作下转移至50ml EP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min 离心lOmin，弃上清，收集菌体沉淀；d.加入20ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30min。 再次4°C 4000r/min离心lOmin，弃上清，收集菌体沉淀；e.加入2ml冰预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置过夜；f.按200ul/份加入15%冰预冷甘油，混勻分装，_70°C冻存备用；(3)连接产物的转化a.吸取IOul连接物介入冰预冷的1. 5ml EP管中，再取出_70°C冻存的E. coli感受态细胞置于冰上融化，轻弹管壁使细胞混勻；b.小心吸取100 μ 1细胞悬液加入到含有连接产物的EP管中，轻弹管壁，混勻后冰浴 30min ；c. 42°C水浴热激90sec，立即冰浴!Bmin ；d.加入500 μ 1预热至37°C的LB液体培养基，37°C，250r/min摇菌培养45min ；e.吸取200 μ 1菌液，用灭菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固体培养基平板上，室温温浴至完全吸收，37°C培养箱中倒置过夜培养；(4)阳性菌落的筛选随机挑选菌落接种于LB氨节培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩增。扩增产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测， 鉴定为所克隆基因后，取60 μ 1交送宝生物工程技术有限公司完成测序。该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的优势。
图1是山羊MC4R基因的PCR产物电泳图。图2是山羊MC4R基因基因编码区的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。步骤一提取山羊眼肌组织中的总RNA(核糖核酸)，然后将总RNA反转录成cDNA ；1.组织的采集选取周岁的天府肉羊颈动脉放血后立即取约Ig眼肌放入液氮罐中用于提取总 RNA。2. RNA的制备及cDNA的合成在实验室用液氮将眼肌磨成粉末装入1. 5ml的EP管。放入零下80°C的超低温冰箱中备用。取新的1. 5ml的EP管，加入Iml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末。
用手摇晃混勻后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟。4°C下13000rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另一个新的1. 5ml的EP管，并往这个新EP管中加入0. 2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，然后4°C下 13000rpm离心8分钟。离心结束以后用移液枪将这个EP管中的上层水相约0. 5ml移入一新的离心管，加入0. 5ml的异丙醇，室温放置10分钟，4°C下12000rpm离心10分钟。弃去上清液，加入Iml的75%乙醇混勻，4°C下7500g离心5分钟。小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，注意不要把RNA吸掉，然后根据RNA量的多少。加入30UL的DEPC水。用1. 5%琼脂糖电泳法检测RNA的质量。将效果好的RNA立即反转录成cDNA。步骤二引物的设计及PCR反应；依据已发表的牛的MC4R基因的序列(登录号为NM_174110)设计引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计。设计的引物为上游引物Pl :5, -CTCTCCGCCGCCTAACTTTCGTTT-3 ‘ (SEQ ID NO 1)下游引物P2:5' -GTGCCTATAACCTGTGATGTGGAT-3 ‘ (SEQ ID NO 2)用cDNA为模板进行PCR操作扩增MC4R基因，退火温度为59°C。PCR反应体系为 IOul 体系(5μ L 的 2XMaster Mix iTap,上下游引物各 0. 5 μ L，2 μ L 的 cDNA，2 μ L 的 ddH20.)，反应条件为 95°C预变性 5min，37 个循环(94°C，30s ；59°C,40s ；72°C，50s)，最后 72°C IOmin0反应结束后将约有1350bp的PCR产物收集到一个EP管中并切胶回收(图1)， 将回收的基因片段克隆到质粒载体中，然后挑取阳性菌进行PCR反应，产物送测序公司测序。步骤三PCR产物的回收和纯化；PCR产物OMEGA公司纯化回收试剂盒Gel Extraction Mini Kit回收PCR产物，具体操作步骤为a.将60 μ 1 PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手术刀割下所要回收的DNA的琼脂块，放入1. 5ml离心管称取重量。在判定DNA片断位置时，要尽可能使用长波及外线，而且还要注意在紫外光下照射的时间应尽可能的短。b.按每0. 1克胶块加入300 μ 1溶胶液。于50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转EP管，以确定胶块充分溶解。c.胶块完全溶解后将溶液温度降至室温，加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中， 12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
d.向吸附柱加入700 μ 1漂洗液Pff (含无水乙醇)，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。e.向吸附柱加入500 μ 1漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。12000r/min离心aiiin，尽量除去漂洗液。将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步的试验。f.将吸附柱置于另一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液， 室温放置2min，12000r/min离心Imin收集DNA溶液。g.取2uL回收产物于1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度。步骤四克隆；(1)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试
剂盒使用说明书，操作连接体系为
权利要求
1.一种克隆山羊MC4R基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤Al、提取山羊眼肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；A2、引物的设计及PCR反应上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为上游引物 P1 5 ‘ -CTCTCCGCCGCCTAACTTTCGTTT-3 ‘下游引物 P2 5 ‘ -GTGCCTATAACCTGTGATGTGGAT-3 ‘用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增MC4R基因，温度为范围在50°C到65°C之间的8 个温度点.PCR反应体系为IOul体系(5yL的2XMaster Mix Tap，上下游引物各0. 5 μ L， 2 μ L 的 cDNA, 2 μ L 的 ddH20.)，反应条件为 95°C 预变性 5min, 37 个循环(94°C，30s ；59°C， 40s ；72°C，50s)，最后 720C IOmin ；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Al包括以下步骤用液氮将眼肌磨成粉末装入1. 5ml的EP管，放入零下80的超低温冰箱中备用；取新的1. 5ml的EP管， 加入Iml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末，用手摇晃混勻后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟；4°C下13000rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另一个新的1. 5ml的EP管，加入0. 2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；取上层水相 0. 5ml于一新的离心管，加入0. 5ml的异丙醇，室温放置10分钟，4°C下12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入Iml的75%乙醇混勻，4°C下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，加入30UL到100UL的DEPC水；将效果好的RNA立即反转录成cDNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3包括以下步骤a.将60μ1PCR产物于的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手术刀割下所要回收的 DNA的琼脂块，放入1. 5ml离心管称取重量。b.按每0.1克胶块加入300 μ 1溶胶液；于50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转EP管，以确定胶块充分溶解；c.胶块完全溶解后将溶液温度降至室温，加入吸附柱中，吸附柱放入收集管中， 12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；d.向吸附柱加入700μ 1漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；e.向吸附柱加入500μ 1漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液；将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步的试验；f.将吸附柱置于另一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液，室温放置2min，12000r/min离心Imin收集DNA溶液；g.取2uL回收产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3包括以下步骤(1)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试剂盒使用说明书，操作连接体系为PMD-18T Vector0.5 μ L纯化回后的PCR片段5ULSolution I4.5 μ LTotal10.0 μ L以上操作在冰上进行，稍离心混勻，16°C在PCR仪中连接12h，-20°C保存备用；(2)大肠杆菌感受态细胞的制备a.从无抗生素平板上挑取新鲜的Ε.coli JM109单菌落结种于IOml LB液体培养基中， 370C，250r/min摇菌培养过夜；b.取2ml活化过夜的菌液接种于含50mlLB液体培养基的锥形瓶中，37°C，250r/min 摇菌培养至OD6tltl = 0. 3 ；c.将细菌培养物无菌操作下转移至50mlEP管中，冰浴lOmin，然后4°C 4000r/min离心lOmin，弃上清，收集菌体沉淀；d.加入20ml冰预冷的0.lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次 40C 4000r/min离心lOmin，弃上清，收集菌体沉淀；e.加入2ml冰预冷的0.lmol/L CaCl2溶液重悬细胞，用吸管吹散，4°C冰箱中放置过夜；f.按200ul/份加入15%冰预冷甘油，混勻分装，-70°C冻存备用；(3)连接产物的转化a.吸取IOul连接物介入冰预冷的1.5ml EP管中，再取出_70°C冻存的E. coli感受态细胞置于冰上融化，轻弹管壁使细胞混勻；b.小心吸取100μ 1细胞悬液加入到含有连接产物的EP管中，轻弹管壁，混勻后冰浴 30min ；c.42°C水浴热激90sec，立即冰浴!Bmin ；d.加入500μ 1预热至37°C的LB液体培养基，37°C，250r/min摇菌培养45min ；e.吸取200μ 1菌液，用灭菌涂布器均勻布于加有Amp的LB固体培养基平板上，室温温浴至完全吸收，37°C培养箱中倒置过夜培养；(4)阳性菌落的筛选随机挑选菌落接种于LB氨节培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩增。扩增产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，取60 μ 1交送宝生物工程技术有限公司完成测序。
全文摘要
本发明公开了一种克隆山羊MC4R基因编码区全序列的方法，包括以下步骤A1、提取山羊眼肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计及PCR反应上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为上游引物P15′-CTCTCCGCCGCCTAACTTTCGTTT-3′下游引物P25′-GTGCCTATAACCTGTGATGTGGAT-3′。A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。提供一种简单、快捷的获取山羊MC4R基因的完整编码区序列的方法，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。
文档编号C12N15/12GK102268437SQ201110199868
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者徐刚毅, 徐洪刚, 汪代华, 郑程莉, 陈浩林 申请人:四川农业大学