本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法。
背景技术
金枪鱼主要分布在太平洋、大西洋和印度洋广阔的海域，是一种长距离洄游性远洋经济鱼类，我国每年对金枪鱼的捕捞量约为8万吨左右，按照加工产生50％-70％的实际下脚料计算，每年约为4-5.6万吨的金枪鱼下脚料。在这些下脚料中，金枪鱼眼部是脂质含量最高的部位，包括大量的活性磷脂成分。在磷脂中，结合有丰富的不饱和脂肪酸，如epa、dha等。这些磷脂对提高记忆力和改善代谢综合症等方面具有很好的生物活性。
目前，对金枪鱼脂质的利用仅仅是用于制备深海鱼油，对其磷脂的研究尚未见报道。
技术实现要素：
本发明目的是：提供一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法，以解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法，该方法包括如下步骤：
(1)以金枪鱼眼部为原料，去除鱼骨，加入95％碱性乙醇溶液，在温度为4℃的条件下匀浆15-20min，获得金枪鱼眼部混合液；
(2)在超声波作用下，搅拌所述金枪鱼眼部混合液，并从中萃取含有磷脂的脂质，在萃取期间，每隔30min间歇性以超声波辅助萃取，获得含有磷脂的脂质混合液；
(3)在萃取结束后，分别用三层纱布和三层滤纸过滤所述含有磷脂的脂质混合液，取滤液于40-45℃的温度下减压蒸馏以收集脂质部分，乙醇回收重复利用；
(4)取所述脂质部分，在30-45℃的温度下，低流速滴加0.9％nacl溶液，边滴加边搅拌，在滴加结束后继续搅拌直至出现絮状沉淀，在温度为4℃的条件下12,000×g离心15-20min，取沉淀物即为粗磷脂；
(5)将所述粗磷脂溶解于二氯甲烷中，用硅胶柱层析法进行分离，其中硅胶需用3倍甲醇清洗30min，干燥后于110℃下活化2h、洗脱获得含有磷脂的洗脱液；
(6)收集所述含有磷脂的洗脱液，在温度为40-45℃的条件下减压蒸馏获得纯度较高的磷脂。
进一步的，步骤(1)中所述原料为从金枪鱼鱼眼中心至金枪鱼鱼眼直径的10-15倍部分，所述原料重量与95％碱性乙醇溶液体积之比为1:5-1:10。
进一步的，步骤(1)中所述95％碱性乙醇溶液为向95％乙醇中加入naoh，使其ph值在10.0-11.0之间。
进一步的，步骤(2)中所述萃取时间为2-5h，萃取温度为40-60℃。
进一步的，步骤(2)中所述超声波处理时间为5-10min，超声声场强度为60-100w/cm2，超声频率为25khz。
进一步的，步骤(4)中所述边滴加边搅拌的搅拌速度为30-80r/min，滴加速度为0.2-0.6ml/min。
进一步的，步骤(4)中所述0.9％nacl溶液用量为所述脂质部分重量的2％-5％。
进一步的，步骤(5)中所述洗脱具体为：先用一位柱体积的环已烷洗脱以除去小分子极性杂质，再用环已烷和甲醇的混合液洗脱，所述环已烷和甲醇的体积比为2:3，所述洗脱速度为7ml/min，每10ml收集洗脱液，用薄层色谱法检测洗脱液中的磷脂。
进一步的，所述薄层色谱法的展开剂为a展开剂和b展开剂，先用所述a展开剂展开至2/3，再用所述b展开剂展开。
进一步的，所述a展开剂由氯仿、甲醇和氨水组成，所述氯仿、甲醇、氨水的体积比为65:30:5，所述b展开剂由氯仿、甲醇、冰醋酸和蒸馏水组成，所述氯仿、甲醇、冰醋酸和蒸馏水的体积比为170:25:25:6，再用碘蒸汽显色法检测磷脂。
本发明提供了一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法，该方法开发金枪鱼眼部活性磷脂产品既可以充分利用金枪鱼加工下脚料中的鱼眼部分，获得高价值的金枪鱼活性磷脂，促进金枪鱼加工产业的良性发展，又可以丰富海洋生物活性脂质的市场空间，对人类的身体健康和海洋保健食品行业的发展具有积极的意义。
具体实施方式
本发明提供一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法，包括以下步骤：
以金枪鱼眼部为原料，低温匀浆后，室温利用超声波辅助乙醇萃取法提取分离金枪鱼眼部的脂质，低温低压蒸馏获得脂质成分，脂质上硅胶柱层析，先后经二氯甲烷、丙酮、甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液，经分子蒸馏后可获得金枪鱼眼部活性磷脂。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法，包括：
步骤一：以金枪鱼眼部为原料，去除鱼骨，加入95％碱性乙醇溶液，在温度为4℃的条件下匀浆15-20min，获得金枪鱼眼部混合液；
该步骤可以具体如下执行：以金枪鱼眼部为原料，去除鱼骨，加入95％碱性乙醇溶液，所述原料重量与95％碱性乙醇溶液体积之比为1:5-1:10，在温度为4℃的条件下匀浆15-20min，获得金枪鱼眼部混合液。其中，95％碱性乙醇溶液为向95％乙醇中加入naoh，使其ph值在10.0-11.0之间。
步骤二：在超声波作用下，搅拌所述金枪鱼眼部混合液，并从中萃取含有磷脂的脂质，在萃取期间，每隔30min间歇性以超声波辅助萃取，获得含有磷脂的脂质混合液；
该步骤可以具体如下执行：在超声波作用下，搅拌所述金枪鱼眼部混合液，并从中萃取含有磷脂的脂质，萃取时间为2-5h，萃取温度为40-60℃，在萃取期间，每隔30min间歇性以超声波辅助萃取，超声波处理时间为5-10min，超声声场强度为60-100w/cm2，超声频率为25khz，获得含有磷脂的脂质混合液。
步骤三：在萃取结束后，分别用三层纱布和三层滤纸过滤所述含有磷脂的脂质混合液，取滤液于40-45℃的温度下减压蒸馏以收集脂质部分，乙醇回收重复利用；
步骤四：取所述脂质部分，在30-45℃的温度下，低流速滴加0.9％nacl溶液，边滴加边搅拌，在滴加结束后继续搅拌直至出现絮状沉淀，在温度为4℃的条件下12,000×g离心15-20min，取沉淀物即为粗磷脂；
该步骤可以具体如下执行：取所述脂质部分，在30-45℃的温度下，低流速滴加0.9％nacl溶液，所述0.9％nacl溶液用量为所述脂质部分重量的2％-5％，边滴加边搅拌，搅拌速度为30-80r/min，滴加速度为0.2-0.6ml/min，在滴加结束后继续搅拌直至出现絮状沉淀，在温度为4℃的条件下12,000×g离心15-20min，取沉淀物即为粗磷脂。
步骤五：将所述粗磷脂溶解于二氯甲烷中，用硅胶柱层析法进行分离，其中硅胶需用3倍甲醇清洗30min，干燥后于110℃下活化2h、洗脱获得含有磷脂的洗脱液；
该步骤可以具体如下执行：将所述粗磷脂溶解于二氯甲烷中，用硅胶柱层析法进行分离，其中硅胶需用3倍甲醇清洗30min，干燥后于110℃下活化2h、洗脱，洗脱方法为：先用一位柱体积的环已烷洗脱以除去小分子极性杂质，再用环已烷和甲醇的混合液洗脱，所述环已烷和甲醇的体积比为2:3，所述洗脱速度为7ml/min，每10ml收集洗脱液，用薄层色谱法检测洗脱液中的磷脂，先用a展开剂(氯仿、甲醇、氨水的体积比为65:30:5)展开至2/3，再用所述b展开剂(氯仿、甲醇、冰醋酸和蒸馏水的体积比为170:25:25:6)展开，再用碘蒸汽显色法检测磷脂获得含有磷脂的洗脱液。
步骤六：收集所述含有磷脂的洗脱液，在温度为40-45℃的条件下减压蒸馏获得纯度较高的磷脂。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例按如下步骤展示一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法：
取金枪鱼眼部(金枪鱼鱼眼直径的10倍部分)，去除鱼骨，加入95％碱性乙醇溶液(鱼眼部重量：溶液体积为1:5)，4℃匀浆15min，其中95％碱性乙醇溶液为向95％乙醇中加入naoh，使其ph10.0。在超声波作用下，搅拌萃取金枪鱼眼部的含有磷脂的脂质，萃取时间为2h，萃取温度为40℃，萃取期间，每隔30min间歇性以超声波辅助萃取，超声波处理时间为5min，超声声场强度为60w/cm2，超声频率为25khz。萃取结束后，分别用三层纱布和三层滤纸过滤，取滤液于40℃减压蒸馏以收集脂质部分，乙醇可回收重复利用。取脂质部分，30℃下，低流速滴加0.9％nacl溶液，边滴加边搅拌，搅拌速度为30r/min，0.9％nacl溶液用量为脂质部分重量的2％，滴加速度为0.2ml/min，滴加结束后继续搅拌直至出现絮状沉淀，4℃下12,000×g离心15min，取沉淀物即为粗磷脂。将磷脂溶解于少量的二氯甲烷中，用硅胶柱层析法进行分离，其中硅胶需用3倍甲醇清洗30min，干燥后于110℃下活化2h。先用一位柱体积的环已烷洗脱以除去小分子极性杂质，再用环已烷/甲醇＝2:3(v/v)洗脱，洗脱速度为7ml/min，每10ml收集洗脱液，用薄层色谱法检测洗脱液中的磷脂。收集含有磷脂的洗脱液，40℃减压蒸馏获得纯度较高的磷脂。薄层色谱法展开剂为a展开剂展开至2/3，再用b展开剂展开，其中a展开剂为：氯仿/甲醇/氨水＝65:30:5(v/v/v),b展开剂为：氯仿/甲醇/冰醋酸/蒸馏水＝170:25:25:6(v/v/v/v)，用碘蒸汽显色法检测磷脂。
实施例2
本实施案例按如下步骤展示一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法：
取金枪鱼眼部(金枪鱼鱼眼直径的12倍部分)，去除鱼骨，加入95％碱性乙醇溶液(鱼眼部重量：溶液体积为1:8)，4℃匀浆18min，其中95％碱性乙醇溶液为向95％乙醇中加入naoh，使其ph10.5。在超声波作用下，搅拌萃取金枪鱼眼部的含有磷脂的脂质，萃取时间为3h，萃取温度为50℃，萃取期间，每隔30min间歇性以超声波辅助萃取，超声波处理时间为8min，超声声场强度为80w/cm2，超声频率为25khz。萃取结束后，分别用三层纱布和三层滤纸过滤，取滤液于42℃减压蒸馏以收集脂质部分，乙醇可回收重复利用。取脂质部分，40℃下，低流速滴加0.9％nacl溶液，边滴加边搅拌，搅拌速度为50r/min，0.9％nacl溶液用量为脂质部分重量的4％，滴加速度为0.4ml/min，滴加结束后继续搅拌直至出现絮状沉淀，4℃下12,000×g离心18min，取沉淀物即为粗磷脂。将磷脂溶解于少量的二氯甲烷中，用硅胶柱层析法进行分离，其中硅胶需用3倍甲醇清洗30min，干燥后于110℃下活化2h。先用一位柱体积的环已烷洗脱以除去小分子极性杂质，再用环已烷/甲醇＝2:3(v/v)洗脱，洗脱速度为7ml/min，每10ml收集洗脱液，用薄层色谱法检测洗脱液中的磷脂。收集含有磷脂的洗脱液，42℃减压蒸馏获得纯度较高的磷脂。薄层色谱法展开剂为a展开剂展开至2/3，再用b展开剂展开，其中a展开剂为：氯仿/甲醇/氨水＝65:30:5(v/v/v),b展开剂为：氯仿/甲醇/冰醋酸/蒸馏水＝170:25:25:6(v/v/v/v)，用碘蒸汽显色法检测磷脂。
实施例3
本实施案例按如下步骤展示一种从金枪鱼眼部制备高生物活性磷脂的方法：
取金枪鱼眼部(金枪鱼鱼眼直径的15倍部分)，去除鱼骨，加入95％碱性乙醇溶液(鱼眼部重量：溶液体积为1:10)，4℃匀浆20min，其中95％碱性乙醇溶液为向95％乙醇中加入naoh，使其ph11.0。在超声波作用下，搅拌萃取金枪鱼眼部的含有磷脂的脂质，萃取时间为5h，萃取温度为60℃，萃取期间，每隔30min间歇性以超声波辅助萃取，超声波处理时间为10min，超声声场强度为100w/cm2，超声频率为25khz。萃取结束后，分别用三层纱布和三层滤纸过滤，取滤液于45℃减压蒸馏以收集脂质部分，乙醇可回收重复利用。取脂质部分，45℃下，低流速滴加0.9％nacl溶液，边滴加边搅拌，搅拌速度为80r/min，0.9％nacl溶液用量为脂质部分重量的5％，滴加速度为0.6ml/min，滴加结束后继续搅拌直至出现絮状沉淀，4℃下12,000×g离心20min，取沉淀物即为粗磷脂。将磷脂溶解于少量的二氯甲烷中，用硅胶柱层析法进行分离，其中硅胶需用3倍甲醇清洗30min，干燥后于110℃下活化2h。先用一位柱体积的环已烷洗脱以除去小分子极性杂质，再用环已烷/甲醇＝2:3(v/v)洗脱，洗脱速度为7ml/min，每10ml收集洗脱液，用薄层色谱法检测洗脱液中的磷脂。收集含有磷脂的洗脱液，45℃减压蒸馏获得纯度较高的磷脂。薄层色谱法展开剂为a展开剂展开至2/3，再用b展开剂展开，其中a展开剂为：氯仿/甲醇/氨水＝65:30:5(v/v/v),b展开剂为：氯仿/甲醇/冰醋酸/蒸馏水＝170:25:25:6(v/v/v/v)，用碘蒸汽显色法检测磷脂。
下述表1为三个实施例与现在技术的对比，具体如下：
表1
实施例4
改善代谢综合症
选择雄性c57bl/6j小鼠进行实验，按体重随机分为低脂组(lf，含5％玉米油)，高脂模型组(hf，含5％玉米油和25％猪油)和磷脂组(pl，饲喂高脂饲料和2％食物添加量的磷脂)，每组10只。饲喂8w，测定小鼠血糖、葡萄糖耐受量(auc)、血清胰岛素、血清总胆固醇(tc)、血清甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl-c)、肿瘤坏死因子а(tnf-α)和白细胞介素6(il-6)。结果如表2，显示，金枪鱼鱼眼磷脂能降低模型组小鼠的血糖和胰岛素水平，提高小鼠葡萄糖耐受性，抑制小鼠体内脂质增加，并降低小鼠炎症因子水平。提示，金枪鱼鱼眼磷脂能显著改善小鼠的代谢综合症。
表2金枪鱼鱼眼磷脂对小鼠代谢综合症的影响
注：#p＜0.05,##p＜0.01,与lf比较；*p＜0.05，**p＜0.01,与hf比较。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：弥补了我国金枪鱼加工产业在活性磷脂方面的空白，该方法采用超声波辅助乙醇萃取法提取分离金枪鱼眼部的脂质，最大限度地保护了脂质中易氧化的磷脂和不饱和脂肪酸，采用硅胶柱分离技术分离活性磷脂成分，获得的活性磷脂具有改善代谢综合症的高生物活性。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。