本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法。
背景技术：
唾液酸糖肽是一种复杂的n糖链糖肽，目前只能从天然产物中分离获得。唾液酸糖肽是一种人源化的糖肽，具有调节肾小球的透过性、抑制破骨细胞生长的作用。高活性的唾液酸糖肽主要存在于性成熟的动物卵细胞中。国际上分离纯化唾液酸糖肽的方法主要是以日本akiraseko于1997年报道的方法为主。该方法要经过两次葡聚糖凝胶分离和一次deae离子交换柱和一次cm-sephadexc分离，过程非常复杂，周期较长。国内某专利是利用一次葡聚糖凝胶进行分离，活性碳吸附后利用乙腈洗脱法获得鸡蛋卵黄唾液酸糖肽，其过程简化，得率较高，但由于提取过程引入了苯酚，分离纯化过程引入了乙腈，使得获得的唾液酸糖肽存在严重的安全隐患。
金枪鱼是高捕捞量的深海经济鱼类，是国际营养学会推荐的世界三大营养鱼类之一。经测定，成熟的金枪鱼卵中唾液酸糖肽的含量占干重质量百分比为4％左右。目前，尚无任何文献对金枪鱼卵唾液酸糖肽进行报道。鉴于唾液酸糖肽的高生物活性，开发一种从金枪鱼卵中获得唾液酸糖肽的制备方法，对增加金枪鱼的附加值和促进人类的健康产业发展具有积极的影响。
技术实现要素：
本发明目的是：提供一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法，以解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将冷冻的金枪鱼鱼卵取出后解冻、匀浆后冷冻干燥，得到金枪鱼鱼卵粉；
(2)将所述金枪鱼鱼卵粉经无水乙醇脱脂后过滤晾干，得到脱脂金枪鱼鱼卵粉；
(3)将所述脱脂金枪鱼鱼卵粉经去离子水于超声波辅助下提取、离心、浓缩，获得浓缩液；
(4)将所述浓缩液经葡聚糖凝胶g-50柱分离后减压浓缩，得到金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品；
(5)将所述金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品利用活性炭吸附，经甲醇-水体系进行洗脱，得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽纯品。
进一步的，步骤(1)中所述解冻的温度为4℃，所述冷冻的温度为-20℃，时间为12h。
进一步的，步骤(2)中所述将所述金枪鱼鱼卵粉经无水乙醇脱脂后过滤晾干，得到脱脂金枪鱼鱼卵粉包括：将所述金枪鱼鱼卵粉加入10-15倍体积的无水乙醇中搅拌10h进行脱脂，期间每3h更换一次无水乙醇，脱脂后通过双层滤脂过滤除去乙醇，取滤渣于冷风干燥机中风干6-10h得到脱脂金枪鱼鱼卵粉。
进一步的，步骤(3)中所述将所述脱脂金枪鱼鱼卵粉经去离子水于超声波辅助下提取、离心、浓缩，获得浓缩液包括：将所述脱脂金枪鱼鱼卵粉按其重量体积比的20-30倍加入去离子水中进行唾液酸糖肽的提取，在提取期间每小时进行超声波处理以辅助获取唾液酸糖肽，在获取结束后进行离心，取上清液在40-45℃下进行减压浓缩，获得浓缩液。
进一步的，所述提取温度为4-10℃，提取时间为12-16h，所述超声波处理时间为10-30min，超声声场强度为200～300w/cm2，超声频率为30khz，离心转速为8000r/min，离心时间为10-15min。
进一步的，步骤(4)中所述将所述浓缩液经葡聚糖凝胶g-50柱分离后减压浓缩，得到金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品包括：将所述浓缩液经葡聚糖凝胶g-50柱进行分离，温度为20-30℃，流速为1.0-1.5ml/min，每7min收集洗脱液，用高效液相色谱法判断洗脱液中的唾液酸糖肽是否流脱，收集含有唾液酸糖肽的洗脱液在40-45℃下进行减压浓缩，冷冻干燥，得到金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品。
进一步的，步骤(5)中所述活性炭吸附为：将所述金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品配成浓度为100-150mg/ml的溶液，加入适量活性炭吸附唾液酸糖肽。
进一步的，所述活性炭的用量为10mg/ml，吸附时间为60-120min。
进一步的，步骤(5)中所述甲醇-水体系进行洗脱为：用质量分数为4-6％的nacl-甲醇溶液分三次洗脱活性炭中的唾液酸糖肽，收集洗脱液，经分子截留量为200da的透析袋透析后，减压浓缩后冻干，得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽纯品。
进一步的，所述甲醇的体积分数为5-8％。
本发明提供了一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法，弥补了我国金枪鱼加工产业在唾液酸糖肽方面的空白。该方法是利用脱脂鱼卵经超声波辅助水提取法获得金枪鱼卵唾液酸糖肽粗品，经葡聚糖凝胶g-50柱分离和活性炭吸附后，利用甲醇-水体系进行洗脱后获得金枪鱼卵唾液酸糖肽纯品。该制备方法既简单方便，提取率较高，又提高了产品的安全性。
具体实施方式
本发明提供一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法，包括以下步骤：
金枪鱼鱼卵去除卵膜，匀浆后冷冻干燥；
冻干的鱼卵经无水乙醇脱脂后晾干；
经去离子水于超声波辅助下提取唾液酸糖肽；
经葡聚糖凝胶g-50柱分离后减压浓缩；
活性炭吸附，经甲醇-水体系进行洗脱，获得金枪鱼卵唾液酸糖肽纯品。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法，包括：
步骤一：金枪鱼鱼卵去除卵膜，匀浆后冷冻干燥；
该步骤可以具体如下执行：将冷冻的金枪鱼鱼卵取出后在温度为4℃的条件下解冻、匀浆后在温度为-20℃的条件下冷冻干燥12h，得到金枪鱼鱼卵粉。
步骤二：冻干的鱼卵经无水乙醇脱脂后晾干；
该步骤可以具体如下执行：将所述金枪鱼鱼卵粉加入10-15倍体积的无水乙醇中搅拌10h进行脱脂，期间每3h更换一次无水乙醇，脱脂后通过双层滤脂过滤除去乙醇，取滤渣于冷风干燥机中风干6-10h得到脱脂金枪鱼鱼卵粉。
步骤三：经去离子水于超声波辅助下提取唾液酸糖肽；
该步骤可以具体如下执行：将所述脱脂金枪鱼鱼卵粉按其重量体积比的20-30倍加入去离子水中进行唾液酸糖肽的在温度为4-10℃的条件下提取12-16h，在提取期间每小时进行超声波处理10-30min以辅助获取唾液酸糖肽，在获取结束后进行离心10-15min，取上清液在40-45℃下进行减压浓缩，获得浓缩液，其中，超声声场强度为200～300w/cm2，超声频率为30khz，离心转速为8000r/min。
步骤四：经葡聚糖凝胶g-50柱分离后减压浓缩；
该步骤可以具体如下执行：将所述浓缩液经葡聚糖凝胶g-50柱进行分离，温度为20-30℃，流速为1.0-1.5ml/min，每7min收集洗脱液，用高效液相色谱法判断洗脱液中的唾液酸糖肽是否流脱，收集含有唾液酸糖肽的洗脱液在40-45℃下进行减压浓缩，冷冻干燥，得到金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品。
步骤五：活性炭吸附，经甲醇-水体系进行洗脱，获得金枪鱼卵唾液酸糖肽纯品。
该步骤可以具体如下执行：将所述金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品配成浓度为100-150mg/ml的溶液，加入适量活性炭吸附唾液酸糖肽，所述活性炭的用量为10mg/ml，吸附时间为60-120min，用质量分数为4-6％的nacl-甲醇溶液分三次洗脱活性炭中的唾液酸糖肽，收集洗脱液，经分子截留量为200da的透析袋透析后，减压浓缩后冻干，得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽纯品。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例按如下步骤展示一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法：
冷冻的金枪鱼鱼卵取出后于4℃下解冻，利用匀浆机匀浆后，于-20℃下冷冻12h，利用冷冻干燥机冻干，得到金枪鱼鱼卵粉。冻干的鱼卵粉加入10倍体积的无水乙醇(1/10，w/v)搅拌10h进行脱脂，期间每3h更换一次无水乙醇。脱脂后双层滤脂过滤除去乙醇，滤渣于冷风干燥机中风干6h得到脱脂金枪鱼鱼卵粉。取脱脂鱼卵粉按其重量体积比的20倍加入去离子水进行唾液酸糖肽的提取(1/20，w/v)，提取温度为4℃，提取时间为12h。期间每小时进行超声波处理以辅助提取唾液酸糖肽，处理时间为10min，超声声场强度为200w/cm2，超声频率为30khz。提取结束后进行离心，8000r/min，离心10min。取上清液在40℃下进行减压浓缩。浓缩液上葡聚糖凝胶g-50柱进行分离，温度为20℃，流速为1.0ml/min，每7min收集洗脱液，用高效液相色谱法判断洗脱液中的唾液酸糖肽是否流脱。收集含有唾液酸糖肽的洗脱液在40℃下进行减压浓缩，冷冻干燥得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品。将冻干的金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品配成浓度为100mg/ml的溶液，加入适量活性炭吸附唾液酸糖肽，活性炭用量为10mg/ml，吸附时间为60min，用质量分数为4％的nacl-甲醇溶液(甲醇的体积分数为5％)的分三次洗脱活性炭中的唾液酸糖肽，收集洗脱液，经分子截留量为200da的透析袋透析后，减压浓缩后冻干，得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽纯品。
实施例2
本实施案例按如下步骤展示一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法：冷冻的金枪鱼鱼卵取出后于4℃下解冻，利用匀浆机匀浆后，于-20℃下冷冻12h，利用冷冻干燥机冻干，得到金枪鱼鱼卵粉。冻干的鱼卵粉加入13倍体积的无水乙醇(1/12，w/v)搅拌10h进行脱脂，期间每3h更换一次无水乙醇。脱脂后双层滤脂过滤除去乙醇，滤渣于冷风干燥机中风干8h得到脱脂金枪鱼鱼卵粉。取脱脂鱼卵粉按其重量体积比的25倍加入去离子水进行唾液酸糖肽的提取(1/25，w/v)，提取温度为8℃，提取时间为14h。期间每小时进行超声波处理以辅助提取唾液酸糖肽，处理时间为20min，超声声场强度为250w/cm2，超声频率为30khz。提取结束后进行离心，8000r/min，离心13min。取上清液在43℃下进行减压浓缩。浓缩液上葡聚糖凝胶g-50柱进行分离，温度为25℃，流速为1.2ml/min，每7min收集洗脱液，用高效液相色谱法判断洗脱液中的唾液酸糖肽是否流脱。收集含有唾液酸糖肽的洗脱液在43℃下进行减压浓缩，冷冻干燥得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品。将冻干的金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品配成浓度为125mg/ml的溶液，加入适量活性炭吸附唾液酸糖肽，活性炭用量为10mg/ml，吸附时间为95min，用质量分数为5％的nacl-甲醇溶液(甲醇的体积分数为7％)的分三次洗脱活性炭中的唾液酸糖肽，收集洗脱液，经分子截留量为200da的透析袋透析后，减压浓缩后冻干，得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽纯品。
实施例3
本实施案例按如下步骤展示一种从金枪鱼卵中制备唾液酸糖肽的方法：
冷冻的金枪鱼鱼卵取出后于4℃下解冻，利用匀浆机匀浆后，于-20℃下冷冻12h，利用冷冻干燥机冻干，得到金枪鱼鱼卵粉。冻干的鱼卵粉加入15倍体积的无水乙醇(1/15，w/v)搅拌10h进行脱脂，期间每3h更换一次无水乙醇。脱脂后双层滤脂过滤除去乙醇，滤渣于冷风干燥机中风干10h得到脱脂金枪鱼鱼卵粉。取脱脂鱼卵粉按其重量体积比的30倍加入去离子水进行唾液酸糖肽的提取(1/30，w/v)，提取温度为10℃，提取时间为16h。期间每小时进行超声波处理以辅助提取唾液酸糖肽，处理时间为30min，超声声场强度为300w/cm2，超声频率为30khz。提取结束后进行离心，8000r/min，离心15min。取上清液在45℃下进行减压浓缩。浓缩液上葡聚糖凝胶g-50柱进行分离，温度为30℃，流速为1.5ml/min，每7min收集洗脱液，用高效液相色谱法判断洗脱液中的唾液酸糖肽是否流脱。收集含有唾液酸糖肽的洗脱液在45℃下进行减压浓缩，冷冻干燥得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品。将冻干的金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽粗品配成浓度为150mg/ml的溶液，加入适量活性炭吸附唾液酸糖肽，活性炭用量为10mg/ml，吸附时间为120min，用质量分数为6％的nacl-甲醇溶液(甲醇的体积分数为8％)的分三次洗脱活性炭中的唾液酸糖肽，收集洗脱液，经分子截留量为200da的透析袋透析后，减压浓缩后冻干，得金枪鱼鱼卵唾液酸糖肽纯品。
下述表1为三个实施例与现在技术的对比，具体如下：
表1
与现有技术相比，本发明的有益效果是：生产过程简单，周期短、简单方便、提取率较高、纯度高、产品安全性高。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。