一种制备维拉卡肽的方法与流程

本发明涉及合成领域，具体涉及一种制备维拉卡肽的方法。

背景技术：

维拉卡肽英文名：velcalcetide或amg416，氨基酸序列结构如下：

维拉卡肽可以在进行血液透析的同时通过静脉给药，这对于每天都需要使用大量药物的慢性肾病患者来说是一个福音。因此，velcalcetide很有可能会超过sensipar。分析师预期velcalcetide的年销售峰值出现在2023年，为10亿美元。

目前已有的专利有cn106795201、cn107434820a、cn105504012a、cn106928320a、cn106928321a等专利。

但是在现有的合成工艺路线中，虽然公开了采用固相合成的策略，但是在合成过程中存在多肽链间二硫键错配的反应，并且工艺较长，副反应和副产物的种类较多，收率和纯度都不理想。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种制备维拉卡肽的方法，解决了现有合成过程中存在多肽链间二硫键错配的反应，工艺较长，副反应和副产物的种类较多的问题，本发明通过原料、步骤和参数的合理优化，能有效避免工艺合成中存在的二硫键反应，操作简便，大大缩短了工艺的合成步骤，提高了多肽维拉卡肽的收率和纯度，减少了副反应的发生和副产物的种类，同时也减少了工艺杂质的研究。

本发明通过下述技术方案实现：

一种制备维拉卡肽的方法，包括：

步骤一、采用fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh、ac-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))和fmoc-d-arg(pbf)-oh为起始原料；先取fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh与树脂偶联制得d-ala-d-arg(pbf)-树脂；

步骤二、再将起始原料fmoc-d-arg(pbf)-oh，fmoc-d-arg(pbf)-oh，fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh依次偶联到d-ala-d-arg(pbf)-树脂上，获得d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-树脂；

步骤三、将起始原料x-d-cys(ss-y-l-cys(ot-bu))偶联在d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-树脂上，获得x-d-cys(ss-y-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-树脂；

步骤四、通过裂解后得到目标产品维拉卡肽；

其中，x为fmoc或ac，y为fmoc或boc。

本发明是采用固相合成的策略合成维拉卡肽主链树酯，本发明的主链中用fmoc-d-ala-d-arg(pbf)、ac-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))和fmoc-d-arg(pbf)为起始原料参与合成，减少了固相合成中合成步骤，减短了合成时间。并且，本发明通过整体工艺的优化设置，提高了多肽维拉卡肽的收率和纯度；本发明经裂解得到维拉卡肽的粗品，整个过程不用纯化，所获得粗品纯度可以达到88.2％，且当纯化后纯度达到99％以上时收率能达到57.8％，大大提高了收率。

本发明的方法为纯固相工艺，操作简便，步骤短，工艺合成时间短。同时，本发明合成工艺中能有效对巯基进行保护，避免了合成中存在的多肽链间二硫键错配的反应，避免产生肽链间反应，减少了副反应的发生和副产物的种类，同时也减少了工艺杂质的研究。

进一步，所述偶联的过程为：

首先，将树脂加入到固相反应柱中，对树脂进行洗涤和溶胀，再采用dblk脱除fmoc保护，再次洗涤；

其次，取起始原料和cl-hobt溶于dmf中，冰浴下加入hbtu或pybop，以及diea活化；

最后，将活化后的起始原料加入到固相反应柱中与树脂进行偶联。

或者，所述偶联的过程为：

首先，将树脂加入到固相反应柱中，对树脂进行洗涤和溶胀，再采用dblk脱除fmoc保护，再次洗涤；

其次，取起始原料和hobt溶于dmf中，冰浴下加入hbtu或pybop，以及diea活化；

最后，将活化后的起始原料加入到固相反应柱中与树脂进行偶联。

更进一步，所述dblk由体积浓度为20％哌啶的dmf溶液组成。

进一步，所述步骤一和步骤三中的偶联完成后，加入封闭试剂进行封闭，封闭试剂采用摩尔比为1:1的dipea和乙酸酐组成。

进一步，所述裂解中采用的裂解试剂由质量比为83:5:5:5:2的tfa、phsme、edt、tis和h2o组成。

进一步，所述裂解试剂的加入量为10ml/g树脂。

进一步，所述步骤一中的树脂为rinkamideresin、rinkamide-mbharesin或rinkamide-amresin。

进一步，所述树脂的取代度为1.1mmol/g～0.2mmol/g。

进一步，所述步骤四中裂解后再采用高效液相色谱法进行纯化并转盐，最后经过浓缩干燥后制成成品。

本发明中所用氨基酸及试剂均可由市场购得。本发明中的缩写和英文含义对应如下：

fmoc9-芴甲氧羰基

hobt1-羟基苯并三唑

dmfn,n-二甲基甲酰胺

dcm二氯甲烷

tfa三氟乙酸

phsme苯甲硫醚

tis三异丙基硅烷

edt乙二硫醇

dipean,n-二异丙基乙胺

hbtu苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯

t-bu叔丁基。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明能有效避免工艺合成中存在的二硫键反应，操作简便，并且大大缩短了工艺的合成步骤；

2、本发明提高了多肽维拉卡肽的收率和纯度，减少了副反应的发生和副产物的种类，同时也减少了工艺杂质的研究。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为实施例1的合成线路图。

图2为实施例1中维拉卡肽纯品hplc图谱。

图3为实施例2的合成线路图。

图4为实施例2中维拉卡肽纯品hplc图谱。

图5为实施例3的合成线路图。

图6为实施例3中维拉卡肽纯品hplc图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

一种制备维拉卡肽的方法，如图1所示，包括：

步骤一：替代度为0.5mmol/g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide-mbha树脂的合成

称取替代度为0.502mmol/g的rinkamide-mbharesin50g为原料，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。称取36.0g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh(50mmol)和8.2g的hobt(60mmol)溶于dmf溶液中，冰浴下加入22.8g的hbtu(60mmol)活化10min，再加入diea(17.4ml,100mmol)活化5min，再将活化液体加入固相反应柱中，室温反应6小时。用dmf洗涤3次，加入174ml封闭试剂(dipea/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用dmf洗涤4次，dcm洗4次，甲醇收缩抽干，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide-mbha树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.499mmol/g。

步骤二：

ac-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-树脂的制备(rinkamide-mbharesin)

称取步骤一中替代度为0.499mmol/g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide-mbha树脂(25mmol)，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。取fmoc-d-arg(pbf)-oh(50mmol)，cl-hobt(60mmol)，溶于dmf合溶液，冰水浴下加入hbtu(60mmol)和diea(75mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照维拉卡肽主链肽序，从c端到n端依次完成fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh、ac-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))的偶联，用dmf洗涤4次，dcm洗4次。得到ac-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-树脂。

步骤三：维拉卡肽的制备

将步骤二中的肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂，裂解试剂为tfa/phsme/edt/tis/h2o＝83:5:5:5:2，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量dcm洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水甲基叔丁基醚沉淀，用无水甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即维拉卡肽粗品28.6g，纯度为88.2％。

步骤四：维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的制备

称取步骤三种任意25.0g维拉卡肽粗品用10l水溶解后，采用汉邦(dac-hb80)，波长230nm，色谱柱为80×250mm反相c18柱，常规0.2％tfa/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.8％精肽。将精肽溶液采用汉邦(dac-hb80)，色谱柱为80×250mm反相c18柱，0.1％三氟乙酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到维拉卡肽盐酸盐精肽16.8g，计算总收率为57.8％，rp-hplc纯度为99.364％。维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的hplc图谱如图2所示。

实施例2

一种制备维拉卡肽的方法，如图3所示，包括：

步骤一：替代度为0.5mmol/g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbharesin的合成

称取替代度为0.502mmol/g的rinkamide-mbharesin50g，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。称取36.0g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh(50mmol)和8.2g的hobt(60mmol)溶于dmf溶液中，冰浴下加入22.8g的hbtu(60mmol)和diea(100mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应6小时。用dmf洗涤3次，加入174ml封闭试剂(dipea/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用dmf洗涤4次，dcm洗4次，甲醇收缩抽干，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbharesin树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.498mmol/g。

步骤二：

fmoc-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-(rinkamide-mbharesin)的合成

称取步骤一中替代度为0.498mmol/g的fmoc-d-arg(pbf)-oh-mbharesin(25mmol)，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。取fmoc-d-arg(pbf)-oh(50mmol)，cl-hobt(60mmol)，溶于dmf合溶液，冰水浴下加入hbtu(60mmol)和diea(75mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。

重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照维拉卡肽主链肽序，从c端到n端依次完成fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))的偶联，用dmf洗涤4次，dcm洗4次。得到fmoc-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin。

步骤三：

ac-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin的合成

称取步骤二中的fmoc-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin(25mmol)，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。取加入174ml封闭试剂(dipea/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭2小时。用dmf洗涤4次，dcm洗4次，甲醇收缩抽干，得到ac-d-cys(ss-boc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin。

步骤四：维拉卡肽的制备

将实步骤三中的肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂，裂解试剂由tfa/phsme/edt/tis/h2o＝83:5:5:5:2组成，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量dcm洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水甲基叔丁基醚沉淀，用无水甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即维拉卡肽粗肽27.6g，纯度为86.2％。

步骤五：维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的制备

步骤四任意25.0g维拉卡肽粗品用10l水溶解后，采用汉邦(dac-hb80)，波长230nm，色谱柱为80×250mm反相c18柱，常规0.2％tfa/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.8％精肽。将精肽溶液采用汉邦(dac-hb80)，色谱柱为80×250mm反相c18柱，0.1％三氟乙酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到维拉卡肽三氟乙酸盐精肽158.6g，计算总收率为55.32％，rp-hplc纯度为99.343％。维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的hplc图谱如图4所示。

实施例3

一种制备维拉卡肽的方法，如图5所示，包括：

步骤一：替代度为0.5mmol/g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbharesin的合成

称取替代度为0.502mmol/g的rinkamide-mbharesin50g，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。称取36.0g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh(50mmol)和8.2g的hobt(60mmol)溶于dmf溶液中，冰浴下加入22.8g的hbtu(60mmol)和diea(100mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应6小时。用dmf洗涤3次，加入174ml封闭试剂(dipea/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用dmf洗涤4次，dcm洗4次，甲醇收缩抽干，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbharesin树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.499mmol/g。

步骤二：

ac-d-cys(ss-fmoc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-(rinkamide-mbharesin)的合成

称取步骤一中替代度为0.499mmol/g的fmoc-d-arg(pbf)-oh-mbharesin(25mmol)，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。取fmoc-d-arg(pbf)-oh(50mmol)，cl-hobt(60mmol)，溶于dmf合溶液，冰水浴下加入hbtu(60mmol)和diea(75mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照维拉卡肽主链肽序，从c端到n端依次完成fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh、ac-d-cys(ss-fmoc-l-cys(ot-bu))的偶联，用dmf洗涤4次，dcm洗4次。得到ac-d-cys(ss-fmoc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin。

步骤三：

ac-d-cys(ss-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin的合成

称取步骤二中的ac-d-cys(ss-fmoc-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin(250mmol)，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次甲醇收缩抽干，得到ac-d-cys(ss-l-cys(ot-bu))-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-ala-d-arg(pbf)-mbharesin。

步骤四：维拉卡肽的制备

将实步骤三中的肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/phsme/edt/tis/h2o＝80:5:5:5:5)，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量dcm洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水甲基叔丁基醚沉淀，用无水甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即维拉卡肽粗肽27.6g，纯度为86.2％。

步骤五：维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的制备

步骤四任意25.0g维拉卡肽粗品用10l水溶解后，采用汉邦(dac-hb80)，波长230nm，色谱柱为80×250mm反相c18柱，常规0.2％tfa/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.8％精肽。将精肽溶液采用汉邦(dac-hb80)，色谱柱为80×250mm反相c18柱，0.1％三氟乙酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到维拉卡肽三氟乙酸盐精肽15.1g，计算总收率为52.46％，rp-hplc纯度为99.358％。维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的hplc图谱如图6所示。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，步骤一中fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-树脂的合成过程不同，可以采用如下几种合成方式中的任意一种。

第一种合成方式：

称取替代度为0.8mmol/g的rinkamideresin50g，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。称取57.6g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh(80mmol)和13.0g的hobt(96mmol)溶于dmf溶液中，冰浴下加入36.4g的hbtu(96mmol)活化10min，再加入diea(28ml，160mmol)活化5min，将活化液体加入固相反应柱中室温反应6小时。用dmf洗涤3次，加入174ml封闭试剂(吡啶/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用dmf洗涤4次，dcm洗4次，甲醇收缩抽干，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.798mmol/g。

或者，以替代度为0.807mmol/g的rinkamide-mbharesin50g为原料，采用以上相同的方法，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbha树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.799mmol/g。

或者，以替代度为0.805mmol/g的rinkamide-amresin50g为原料，采用以上相同的方法，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-am树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.798mmol/g。

第二种合成方式：

称取替代度为0.310mmol/g的rinkamideresin50g，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。称取21.6g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh(30mmol)和4.8g的hobt(36mmol)溶于dmf溶液中，冰浴下加入13.6g的hbtu(36mmol)活化10min，再将diea(10.4ml，60mml)活化5min，将活化液加入固相反应柱中，室温反应6小时。用dmf洗涤3次，加入174ml封闭试剂(吡啶/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用dmf洗涤4次，dcm洗4次，甲醇收缩抽干，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.298mmol/g。

或者，以替代度为0.304mmol/g的rinkamide-mbharesin50g为原料，采用以上相同的方法，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbha树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.298mmol/g。

或者，以替代度为0.305mmol/g的rinkamide-amresin50g为原料，采用以上相同的方法，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-am树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.292mmol/g。

第三种合成方式：

称取替代度为0.201mmol/g的rinkamideresin50g，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。用dblk(20％哌啶/dmf)脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次。称取14.4g的fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-oh(20mmol)和3.2g的hobt(24mmol)溶于dmf溶液中，冰浴下加入9.2g的hbtu(24mmol)活化10min后,再将diea(7.0ml，40mmol)活化5min，再将活化液体加入固相反应柱中，室温反应2小时。用dmf洗涤3次，加入174ml封闭试剂(吡啶/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用dmf洗涤4次，dcm洗4次，甲醇收缩抽干，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.196mmol/g。

或者，以替代度为0.205mmol/g的rinkamide-mbharesin50g为原料，采用以上相同的方法，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbha树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.198mmol/g。

或者，以替代度为0.211mmol/g的rinkamide-amresin50g为原料，采用以上相同的方法，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-mbha树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.192mmol/g。

第四种合成方式：

采用替代度为0.8mmol/g的rinkamideresin替换步骤一中替代度为0.502mmol/g的rinkamide-mbharesin，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide树脂，用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.499mmol/g。

或者，采用替代度为0.504mmol/g的rinkamide-amresin替换步骤一中替代度为0.502mmol/g的rinkamide-mbharesin，得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-rinkamide-am树脂，用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.498mmol/g。

实施例5

采用对比文件cn201410526197.2中记载的工艺制成成品，工艺过程为：取arg与树脂偶联，制得arg-树脂；取arg-树脂，逐个偶联ala、arg、arg、arg、ala、cys(x)后，将氮端氨基乙酰化，得到第一肽树脂；脱除第一肽树脂中cys(x)的侧链保护基x，再与y-cys偶联，获得第二肽树脂，裂解，即得。

该方法采用特殊的侧链保护基npys，一方面防止合成原料之间的二硫键合成，另一方面npys属于良好的离去基团，能有效提高原料与链间cys的偶联。提高了多肽velcalcetide的收率和纯度，减少副反应的发生。

虽然采用该方法防止了原料之间二硫键合成，提高了收率和纯度，但根据其实施例中数据可知，其粗品的纯度仅仅只达到63.35％，当纯度达到99.34％时的总收率仅仅只有26.1％，收率较低。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。