大豆肽混合物的制备方法

专利名称：：大豆肽混合物的制备方法
技术领域：
：本发明提供一种即使在酸溶液中也不形成渣滓的大豆肽混合物。更特别地是，本发明提供一种即使在酸溶液中冷藏和j^藏时也不形成渣滓的大豆肽混合物。
背景技术：
：迄今为止，大豆蛋白分离物通常通过下述方法制备，这些方法是大豆蛋白工业化生产的主流方法。向脱脂大豆中加入水制成水性淤浆，用例如离心的方法分离去除其中的"豆渣(豆腐渣)"，向生成的水溶性部分(脱脂豆乳)中加入酸调整其pH值到大豆蛋白的等电点使大豆蛋白沉淀，分离和去除上清液(大豆乳清)，从而获得酸性淤浆。加碱中和此酸性淤浆，通过喷雾干燥等方法进行干燥得到所述"分离的大豆蛋白(separatedsoybeanisolate)"(以下称为方法A)。另一方面，有一种方法，其用水提取大豆蛋白浓缩物以去除"豆渣"而得到大豆蛋白溶液，将该大豆蛋白溶液喷雾干燥后制得大豆蛋白分离物(以下称为方法B)。大豆蛋白浓缩物，有一种是用醇溶液从脱脂大豆中分离去除乳清成分或其类似物所获得的醇浓缩物，还有一种是将脱脂大豆在酸溶液中直接制成淤浆，然后去除上清液，即上清液中的乳清而获得酸性淤浆，然后进行干燥等所得到的酸浓缩物。就醇浓缩物而言，可以通过向浓缩物中加水来去除"豆渣"，然后进行喷雾干燥等，从而获得大豆蛋白分离物。就酸浓缩物而言，可以通过中和其淤浆来去除"豆渣"而获得大豆蛋白分离物溶液，然后将其进行喷雾干燥等而制得大豆蛋白分离物。由后面的方法(方法B)制备的大豆蛋白与由前面的方法(方法A)制备的大豆蛋白相比具有更好的口感，并且将此大豆蛋白水解得到的大豆蛋白水解物也具有良好的口感。然而，根据本发明人的研究，当用于酸性食品和饮料例如酸性饮料时，由方法B制备的大豆蛋白水解物具有以下问题其与方法A制成的大豆蛋白水解物相比更容易形成渣滓。换句话说，对于用蛋白酶处理大豆蛋白分离物溶液得到的大豆蛋白水解物，使用由方法A制成的大豆蛋白获得的水解物即便在酸性条件下冷藏时也难以形成渣滓(白浊)，而使用由方法B制成的大豆蛋白获得的水解物则具有在酸性条件下冷藏时容易形成渣滓的问题。因为大豆蛋白的等电点在pH4.5附近，因此可以通过将水解物用于某些弱酸性饮料而不是酸性饮料来避免形成渣滓。例如，作为已知的方法，专利文献1公开了将饮料的pH调整到大约6的高范围的方法。然而，这样的pH太高以致于不能制备pH3-4.5的酸性饮料。迄今为止，为了制备即使在酸性溶液中也不形成渣滓(白浊)的大豆蛋白水解物，已进行了很多发明，所述水解物例如用于酸性饮料。专利文献2公开了可溶性大豆蛋白的制备方法，所述大豆蛋白在酸性到碱性范围内可溶解，其中用胞内/胞外蛋白酶处理由方法A获得的大豆蛋白，然后离心分离等。然而，其具有不受欢迎的气味和不好的味道例如涩味，并且其味道和风味是不希望有的。本申请人在专利文献3中公开了能在低于pH4.6的酸性食品中使用的、在pH3.0-4.5可溶的大豆蛋白。该发明的特征是在去除或灭活含大豆蛋白的溶液中的聚阴离子物质，和/或向其中加入聚阳离子物质后，在酸性条件下以高于IOO'C的温度对溶液进行加热处理。此外，该文献还公开了除去植酸和用植酸酶处理的如上述去除或灭活聚阴离子物质的处理。此外，该文献还公开了用蛋白酶水解处理蛋白质。然而，尽管所生成的大豆蛋白在酸性范围内显示出极好的溶解性和贮藏稳定性，但它是具有功能型特征例如乳化能力和凝胶形成能力的大豆蛋白，而不是像本发明一样的具有低分子量的大豆肽混合物。而且，其中没有教导如本发明中的两步酶分解处理。专利文献4公开了一种在低于等电点的酸性范围内提高蛋白质溶解性的方法，该方法制备pH约为2.0-4.2和固体成分含量为10-15重量％的大豆蛋白分离物的淤浆，并且在大约120-160。C的温度下以连续方式对淤浆进行加热处理。然而，这是大豆蛋白，而不是如本发明所述的具有低分子量的水解大豆肽混合物。而且，当被用于酸性饮料时其在贮藏时形成渣滓。专利文献5公开了分离可溶性蛋白片段的方法，所述蛋白片段在pH4.6或更低时可溶，其中结合使用植酸酶处理和调整pH分离。然而，该方法的产率以大豆蛋白分离物原料计只有14%，并且不适于实际使用。而且，它没有教导如本发明的两步酶解处理。本申请人在专利文献6中公开了即使在酸性范围内也不形成渣滓的大豆蛋白水解物的制备方法，其中将由方法A获得的大豆蛋白进行蛋白酶处理。该方法的特征在于加热处理，而且水解物即使在酸性范围内也不形成渣滓。然而，产品具有令人不愉快的气味和差的味道例如涩味，因此这些味道和风味是不希望有的。此外，本申请人在专利文献7中公开了大豆蛋白的处理方法，其中将大豆蛋白经蛋白酶处理，然后经植酸酶处理。然而，其原料是方法A获得的大豆蛋白，并且处理的目的是减少或去除大豆蛋白中含有的植酸。因此，该方法没有教导两步酶解。作为使用由方法B获得的大豆蛋白的例子，专利文献8公开了在pH3-5具有优良溶解性的蛋白质的制备方法，其中用微生物来源的酸性植酸酶在pH2-6处理经酸洗的脱脂大豆，然后分离可溶性部分。此外，该文献还公开了在对酸性淤浆进行植酸酶处理的同时或之后进行蛋白酶处理。在该发明中，植酸酶处理的目的是提高蛋白质在酸性条件下的提取率，而蛋白酶的处理目的是进一步改善味道。因此该发明的目的和过程与本发明的不同。此外，它没有教导两步蛋白酶处理。而且，当在酸性条件下用蛋白酶高强度水解时，产生涩味和特殊的味道。这是不希望有的。专利文献l:JP2002-10764A专利文献2:JP2005-80668A专利文献3:WO2002/067690专利文献4:JP53-19669A专利文献5:JP55-29654A专利文献6:JP2001-238693A专利文献7:WO2004/17751专利文献8:JP51-125300A
发明内容如前所述，尽管由方法B制备的大豆蛋白水解获得的大豆肽混合物与由方法A制备的大豆蛋白混合物获得的产品相比具有更好的味道和风味，然而仍存在如下缺陷在酸性溶液中易于形成渣滓，尤其是在冷藏条件下。因此，本发明的目的是提供一种大豆蛋白水解物，尤其是具有相对低分子量的大豆肽混合物，所述大豆蛋白水解物以由方法B制成的大豆蛋白为原料，其即使在酸性条件下冷藏时也不形成渣滓。解决技术问题的技术方案大豆蛋白在碱:至中:条件下用内切;白酶水解，生成的水解物在酸性条件下用具有外切酶活性(exo-activity)的蛋白酶处理，然后进一步用植酸酶处理，则生成的大豆蛋白水解物即使在酸溶液中也不形成渣滓。而且，本发明人研究了在酸性条件下使用的酶，发现根霉菌属(/^/W/7W)来源的蛋白水解酶表现出显著的效果，曲霉菌属(ylyp^^7/W5")来源的蛋白水解酶也表现出一定程度的效果。从而，完成了本发明。也就是说，本发明提供了由方法B获得的大豆蛋白通过两步酶水解及植酸酶处理所获得的大豆肽混合物，其具有良好的味道并且即使在冷藏状态下的酸溶液中也不形成渣滓。尤其是，本发明提供了大豆肽混合物的制备方法，其包括如下步骤(a)用水提取浓缩大豆蛋白获得提取物；(b)用蛋白酶在碱性到中性条件下处理提取物；(c)用蛋白酶在酸性条件下进一步处理生成的产物；(d)用植酸分解酶处理生成的产物；和(e)从产物中分离和去除不溶性物质。优选地，(b)步骤中使用的酶包括内切型。根据蛋白质成分的15%三氯乙酸溶解率，优选地(b)步骤中的水解度是20-98%的大豆蛋白分解率。优选地，(c)步骤中使用的酶包括外切型。优选地(c)步骤中使用的酶是曲霉菌属或根霉菌属来源的酶。优选地，(d)步骤在(c)步骤后或同时进行。大豆蛋白混合物的平均分子量优选200-5000。发明效果本发明使制备这样一种大豆肽混合物成为可能，其与根据常规方法A用蛋白酶处理大豆蛋白得到的产品相比不仅具有良好的味道，而且即使在酸性溶液中冷藏也不形成渣滓。因此，本发明可以提供能用于酸性食品和饮料中的具有良好味道的大豆肽混合物，所述食品和饮料例如酸性饮料和酸性果冻。具体实施方式本发明是一种大豆肽混合物的制备方法，其包括如下步骤(a)用水提取浓缩大豆蛋白获得提取物；(b)用蛋白酶在碱性到中性条件下处理提取物；(c)用蛋白酶在酸性条件下进一步处理生成的产物；(d)用植酸分解酶处理生成的产物；和(e)从产物中分离和去除不溶性物质。换句话说，本发明的特征在于使用(a)和步骤(b)-(e)的必要构成特征。如
背景技术：
中所述的醇浓缩物或酸浓缩物也可以用作(a)步骤中的浓缩大豆蛋白。浓缩大豆蛋白的例子包括用醇溶液从脱脂大豆中分离和去除乳清成分等而得到的醇浓缩物；和直接将脱脂大豆在酸性溶液中制成淤浆，去除上清液即乳清，然后干燥所生成的酸性淤浆而得到的酸浓缩物(酸浓缩大豆蛋白)。因此，浓缩大豆蛋白的水提取物可以用如下方式获得将水加入醇浓缩物，然后从生成的淤浆中去除"豆渣"；或者将酸浓缩物中和，然后去除"豆渣"。例如，按照本申请人的公开专利WO2004/013170中描述的方法可获得(a)步骤中浓缩大豆蛋白的水提取物。下面，说明用蛋白酶在碱性到中性条件下处理提取物的(b)步骤。本发明的特征在于在(b)步骤后结合(c)步骤和(d)步骤。尽管原因未知，但是当(a)用作原料时，仅仅在碱性到中性条件下进行蛋白酶处理的(b)步骤很难获得在酸溶液中不形成渣滓的大豆蛋白水解物。在本发明的(b)步骤中，在碱性到中性条件下进行蛋白酶处理是适当的。尽管原因未知，但是假设在碱性到非常弱的碱性条件下用内切蛋白酶水解，大豆蛋白的结构会松散和变成不牢固的状态，然后在酸条件下水解，会产生一定的效果。因此，在碱性到中性范围内具有活性pH的酶是适用的，在碱性到中性范围内具有最适pH的酶是优选的。在酶解过程中，反应混合物的pH降低到酸性边缘。但是，在本发明中，只要酶解反应开始时pH在碱性到中性范围内即可。优选地，酶解反应开始时pH是pH7-9，因为可以减少中和反应生成的盐。其它水解条件(温度、E/S比例等)因使用的蛋白水解酶的不同类型而不同，所以可确定加入的酶量和反应时间以获得期望的分解率。本发明的(b)步骤中使用的酶因产生不适于饮料用途的特殊的味道和氨基酸的味道而出现不协调感，因此优选所述酶含有内切型即所述内切蛋白酶以降低这些味道。通常地，蛋白酶处理后的酶解产物的干物质中游离氨基酸含量在10%之内是适当的，优选在5%之内。这些酶可以是任何动物、植物或微生物来源的酶。其具体例子包括丝氨酸蛋白酶(动物来源的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，微生物来源的枯草杆菌蛋白酶，等)，和巯基蛋白酶(植物来源的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶，等)。更具体地，此处的例子包括地衣芽孢杆菌(Bfld〃M"/c/!emybnn^s)来源的"碱性蛋白酶"(由NovozymesJapanLtd.生产)，枯草杆菌(必a"〃"s)来源的"蛋白酶S，，(由AmanoEnzymeInc.生产)，"BioplaseSP-15FG"(由NagaseChemtexCorporation生产)，"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo"Ltd.生产)，"ProtinAC10"(由DaiwaKaseiCo"Ltd.生产),"ProtinNY50"(由DaiwaKaseiCo.，Ltd.生产)，以及类似的酶。这些酶在碱性到中性范围内具有活性pH,在非常弱碱性到碱性范围内具有最适pH,除了ProtinNY50在中性范围内具有最适pH。这些酶可以单独使用或者2种以上组合使用。蛋白酶处理的大豆蛋白溶液的合适蛋白质浓度是1-30重量％，优选5-15重量％，更优选8-12重量％。通过适当地选择提取条件可将蛋白质浓度调整在此范围内，所述条件例如提取pH、提取温度、提取时间、提取量、提取次数等。即使浓度过低，也不妨碍蛋白酶处理。但是生产率低，并且导致大豆蛋白水解物的制造成本上升。此外，当大豆蛋白溶液的浓度过高时，需要大量的酶才能充分地反应。根据蛋白质成分的15%三氯乙酸溶解率计算，(b)步骤中蛋白酶处理引起的水解度即大豆蛋白分解率通常是20-98%，更适当地是50-90%。蛋白水解酶反应需要的时间根据使用的蛋白水解酶的活性和用量而不同。然而，通常约为30分钟-24小时，优选约为l-4小时。酶解时间过长容易导致腐败。下面，说明在酸性条件下的蛋白酶处理的(c)步骤。酸性条件下蛋白酶处理的目的是通过组合后面的(d)步骤来沉淀渣滓，而不需要在酸性条件下高度水解。本发明的(c)步骤的特征是在酸性条件下进行蛋白酶处理。而且，是轻度水解以免形成渣滓，即使如上所述游离氨基酸升高，或者即使平均分子量降低，其水解度也优选在上述范围内。(c)步骤的优选条件如下。酸性范围的pH适当地是pH3-6.2，优选pH4-5.5。在碱性条件下很难获得目标大豆肽混合物。温度范围为30-70°C,优选为45-65。C。而反应时间根据所用酶的活性和用量而不同，通常可以是大约2分钟至4小时，优选为大约5分钟到1小时。当反应时间过长时，产生特殊的味道、苦味等。因此，由(c)步骤中水解引起的游离氨基酸的增量以干固体成分(drysolidcontent)计保持在4重量％以下，优选保持在2重量％以下，更优选保持在1重量％以下。而且，(c)步骤中水解引起的平均分子量的降低保持在50%以内，优选在30%以内。例如，假设(b)步骤后经分离不溶性物质得到的大豆肽混合物的平均分子量是5000，如果(c)步骤中的少许水解引起的降低量在50%之内，则平均分子量是2500-5000，而如果在30%之内，则平均分子量是3500-5000。(c)步骤中使用的酶优选根霉菌属或曲霉菌属来源的酶为宜。根霉菌属来源的酶的例子包括来源于米根霉(及/n'w/7w的"PeptidaseR，，(由AmanoEnzymeInc.生产)、来源于雪白根霉(及/i/zo/uww/veiw)的"Newlase3FG，，(由AmanoEnzymeInc.生产)等。曲霉菌属来源的酶的例子包括来源于米曲霉(y^/^fg///^o/jzfle)的"蛋白酶M"、"蛋白酶A，，(由AmanoEnzymeInc，生产)以及"S腿izymeAP，,、"SumizymeFP，，、"S腿izymeLP"、"S咖izymeLPL"(由ShinNihonChemicalsCo.，Ltd.生产)等。优选地，这些酶含有外切型。因为通常使用粗制的酶，它们含有外切和内切蛋白酶。因此，通过将其在酸性条件下进行反应，从而在酸溶液中冷藏时可以抑制渣滓的形成。也就是说，当使用由方法A获得的大豆蛋白时，仅通过(b)步骤，或者通过结合(b)步骤和后述的(d)步骤，可以获得在酸溶液中难于形成渣滓的大豆蛋白水解物。在这种情况下，(d)步骤不是必须的，但以结合使用为佳。然而，当水解由方法B获得的大豆蛋白时，必须结合进行(b)步骤、(c)步骤、和(d)步骤。下面，说明植酸分解酶处理的(d)步骤。由上述步骤获得的大豆蛋白的酶解产物的pH值通常被调整为pH3-6.2,优选调整为pH4-5.5。通常浓度与(b)步骤中的水解时的浓度相同，为1-30重量％,优选为5-15重量％，更优选为8-12重量％。当在下面描述的不溶性物质分离后进行处理时，可以减少植酸分解酶的添加量，因为底物的量变小了。在酸性条件下，可以任选先进行(d)步骤或(c)步骤，也可以同时进行，优选(d)步骤在(c)步骤之后或同时进行。首先，说明本发明中使用的植酸分解酶。用于本发明的植酸分解酶，它的来源不局限于具体的一种酶，有植物例如小麦和马铃薯来源的酶；动物器官例如肠管来源的酶；微生物例如细菌、酵母、真菌和放线菌来源的酶，以及基因重组酶，并且可以使用例如具有植酸分解活性的植酸酶和磷酸酶。在这些分解植酸的植酸酶和磷酸酶中，植酸酶是更优选的。植酸酶，可以使用来源于能生产各种植酸酶的菌林，例如曲霉菌属、根霉菌属、酵母菌属(5"flcc/m/w^c")、毛霉菌属(Mwcor)和地丝菌属(GWc/m附)。优选地，曲霉菌属来源的酶是合适的。更优选地，其选自来源于以下曲霉菌属(As/7ew///"s)的植酸酶，例如无花果曲霉(^45/7e/^7/tw/c肌m)、黑曲霉(^s戸g"/ws)、和土曲霉(^印"^7/fW^TeMS)。为了将大豆中的植酸分解为肌醇，必须切断酯类基团，植酸酶即是进行该切断操作的酶。而且，酸性磷酸酶，可以使用真菌来源的酸性磷酸酶。特别^ko其可以选自来源于以下曲霉菌属的酸性植酸酶无花果曲霉(J5:/7Wg"/MSyc肌附)，黑曲霉(/45/erg"/w51w/ger)和土曲霉(^45/e,gi〃iw^rrew51)。因为酶处理的植酸分解反应可以在非常温和的条件下进^f，因而对蛋白质的影响4艮小。例如，本发明的酶反应可以在30-70°〇进4亍0.1-30小时。优选地，与上述(c)步骤一样，其通常可以在30-70。C下处理约0.1-4小时，优选约10分钟-l小时。一般而言，因为常规可获得的植酸酶通常含有蛋白酶，当反应长时间进行时，由于蛋白酶的活性有时会产生特殊的味道。此外，植酸的分解反应可以如上所述在pH3-6.2进行，优选在pH4-5.5进行。可以使用任何形态的酶，例如粉末状或液体状。以大豆蛋白中的粗蛋白重量计算，加入酶的量为0.01-10重量％，优选为0.05-2重量%，更优选为约0.1-1重量％。优选加入的植酸酶的酶效为0.1-100U/g粗蛋白，优选为0.5-20U/g粗蛋白，更优选为l-10U/g粗蛋白。酶活性可以如下定量将反应混合液在37。C下反应30分钟，向其中加入1.0ml的10y。TCA终止反应，其中所述反应混合液包括0.5ml的0.2MTris-HCl緩冲液(pH6.5)(其中含有4mM植酸钠)、0.4ml蒸馏水和0.1ml酶溶液。用Fiske-Subbarow法测量反应后的反应混合液中的无机磷酸的含量。在上述条件下能在1分钟内释放出lnmol的无机磷酸所用的酶的量定为1单位(U)。在本发明中，包括用蛋白水解酶分解蛋白质的步骤((b)步骤和(c)步骤)和用植酸分解酶分解植酸的步骤((d)步骤)是很重要的。考虑这些步骤的顺序，优选先进行(b)步骤。优选在进行(d)步骤之前将反应混合液调节至酸性。优选地，在(c)步骤后或与(c)步骤同时进4亍(d)步骤，因为这样可以将大豆肽混合物的干固体成分中的植酸(六磷酸中肌醇，mesoinositolhexaphosphate)含量降低到0.7重量％以下，优选0.2重量％以下，更优选检测极限以下(检测极限5mg/100g)，所述含量由钼兰酸(vanadomolybdicacid)吸光光度法测得。接下来，说明分离和去除不溶性物质的(e)步骤。不溶性物质包括在大豆蛋白的蛋白酶处理中未分解的残渣，其易于在大豆蛋白的等电点附近聚集。当目标大豆肽混合物的溶液中存在这种不溶性物质时，需要将其分离和去除。不需要在(b)-(d)步骤的每个步骤后分离不溶性物质，但是需要在(b)步骤后的任意步骤分离。换句话说，当在(b)步骤后分离和去除不溶性物质时，只要在(c)步骤后或(d)步骤后不溶性物质不沉淀就不需要分离。当在(b)步骤后没有去除不溶性物质的情况下就进行(c)步骤或(d)步骤的处理时，可以在(c)步骤或(d)步骤后去除不溶性物质。作为分离和去除不溶性物质的设备，可以使用过滤设备如压滤机和膜分离，也可使用离心分离器、旋液分离器等设备。不溶性物质的分离适合在酸性pH(pH3-6.2)的条件下进行。酶反应后的pH根据反应条件而不同。虽然如此，(b)步骤后，pH通常在pH5-8的范围内。因此，为了分离不溶性物质，优选将pH值调整为pH3-6.2，更优选调整为pH4-5.5。因为包括未分解的残渣的不溶性物质容易在大豆蛋白的等电点附近聚集，因此在此pH范围内，上述不溶性物质的聚集能力提高，进而提高了分离时的分离能力。此操作也叫做酸沉淀。由于沉淀的蛋白质可以通过分离步骤去除，因此酸沉淀是没有问题的。当在(c)步骤或(d)步骤后进行分离时，由于pH已经被调整到酸性，因此分离可以在不调整pH的情况下进行。此外，即使在分解反应混合物中添加钙或镁的氯化物；盐例如硫酸盐；碱土金属化合物例如氢氧化物；蛋白聚集剂例如聚丙烯酸钠、褐藻酸、壳多糖或壳聚糖，仍然可以提高上述不溶性物质的聚集能力并提高分解能力。此外，为了提高上述不溶性物质的聚集能力和分离能力，可以实施加热处理步骤。加热可以比通常使酶失活或灭菌进行的加热处理温和。加热可以在如下条件下进行加热时间是10(s"-,xT)分钟或更短(其中T是加热温度(。C))。当加热时间超过此时间时，分解的大豆蛋白水解物出现着色的问题，从品质的观点看是不优选的。根据具体的应用，如上述那样获得的大豆肽混合物的溶液可以直接使用或者浓缩后使用。可选择地，也可以经过灭菌和干燥步骤。灭菌和干燥步骤中使用的设备是不受特别限制的，只要是普通的灭菌设备即可，例如，蒸汽注入型的连续直热式灭菌设备是优选使用的。具体地，灭菌可以在下述条件下进行温度为100-160。C,优选105-145°C;灭菌时间是l秒-3分钟。此外，干燥方法不受特别限制，只要是常规已知的干燥方法即可，例如，可优选使用冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥等。而且，在灭菌和干燥之前，可以加入各种配合成分，其例子包括乳化剂、稳定剂、营养剂和甜味剂。当计划应用于酸性食品和饮料例如酸性饮料和酸性果冻时，大豆肽混合物的平均分子量为200-5000，优选200-3000为宜。此外，在大豆肽混合物的干固体成分中，植酸(六磷酸中肌醇)的量为0.7重量％以下，优选为0.2重量％以下，更优选检测不到植酸，所述量由钼兰酸吸光光度法测得(检测极限5mg/100g)。如上所述，在使用(a)的大豆蛋白的情况下，结合(b)步骤、(c)步骤和(d)步骤，并且最后在(e)步骤中去除不溶性物质，可以获得在酸溶液中不形成渣滓的大豆蛋白水解物。接下来说明本发明中使用的分析方法。TCA、溶解率将蛋白质以1.0重量％的浓度分散在水中并且充分搅拌制成溶液，用凯氏定氮法、Lowry法或其它类似方法测定溶液中15%三氯乙酸(TCA)溶解的蛋白质相对于总蛋白质的比率。平均分子量通过使用高效液相色谱的凝胶过滤法所获得的色谱的分子量分布来计算大豆肽混合物的平均分子量。具体地，按如下方法进行。(1)将大豆肽混合物溶解在洗脱剂(45%乙腈、0.05%三氟乙酸溶液)中，浓度为0.1重量％，并且用孔径为0.2jim的膜过滤器过滤，以制备测试溶液。(2)用下述凝胶过滤法获得测试溶液的色谱柱TSK凝胶G3000PWXL(ToshoCorporation)和TSK凝胶G2500PWXL(ToshoCorporation)，两柱串联；洗脱剂的流速0.3ml/min;柱温40°C;检测方法在220rnn的波长下检测吸光度。(3)以横轴为持续时间、纵轴为220nm处的吸光值，绘制样品的分子量分布曲线来计算平均分子量。使用JASCOCorporation生产的JASCO-BORWIN色谱数据处理程序，进行色谱的数据处理。游离氨基酸的量大豆肽混合物中游离氨基酸的量以如下方式定量大豆肽混合物以0.4重量％的浓度分散在3%磺基水杨酸中，沉淀和去除肽成分，用HitachiCo.，Ltd.生产的L-8500型高性能氨基酸分析仪检测可溶性成分。以下实施例中的游离氨基酸的量表示为干固体成分中的含量。实施例以下，用实施例具体说明本发明的实施方式。然而，本发明不局限于这些实施例的技术范围内。除了另外指出的之外，实施例中的全部百分比为重量百分比。实施例1向6重量份45。C温水中，缓慢加入1重量份NS190的低度变性脱脂大豆片。在用盐酸调整到pH4.2的同时轻轻搅拌混合物IO分钟后洗涤，然后用离心分离器(1500G，IO分钟)分离和去除溶出的乳清成分，获得2重量份浓缩大豆蛋白。向2重量份的这种浓缩大豆蛋白中，加入6重量份的45。C温水。轻微搅拌10分钟后洗涤，溶出的乳清成分用离心分离器(1500G,IO分钟)分离和去除，获得6重量份乳清和2重量份浓缩大豆蛋白，该浓缩大豆蛋白的含水量为63%、每份固体成分的粗蛋白含量为72%。向该2重量份的浓缩大豆蛋白中，加入4重量份水，将混合物调整到pH7.0，搅拌30分钟，离心获得提取残留物和4重量份提取物(固体成分8.0%)。提取在60'C进行，用1500G、IO分钟的离心分离条件进行固-液分离，用20。/。氢氧化钠溶液调整提取物的pH值。如此获得的大豆蛋白提取物用蒸汽注入型连续直热式灭菌器在14(TC灭菌10秒钟，然后喷雾干燥制得水分含量为5%的大豆蛋白分离物粉末。每份干固体成分中的粗蛋白含量为90%。将如此获得的大豆蛋白分离物粉末在58。C下溶解制成pH8.5的8%溶液，然后，加入1.5%E/S比例的"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo.，Ltd.生产)作为蛋白水解酶，然后在58。C水解3小时(15。/。TCA溶解率70%)。"ProtinAY40"是内切型碱性蛋白酶。酶促反应后向大豆蛋白水解物溶液中加入柠檬酸调整到pH4.5,然后对混合物进行加热处理(85。C超过10分钟)，然后离心(1500G,20分钟)分离和去除含有未分解残渣的不溶性物质。获得的离心上清液中水解物的15。/。TCA溶解率是99。/。，平均分子量是1200，游离氨基酸的量大约是0.6%。向获得的离心上清液中，加入0.5。/qE/S比例的植酸分解酶"S腿izymePHY"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生产)和0.04%E/S比例的才艮霉菌属来源的"肽酶R"(由AmanoEnzymeInc.生产)，混合物在50。C反应10分钟。"肽酶R，，是中性肽酶，但是含有内切型和外切型的酸性蛋白酶。酶反应后的大豆蛋白水解物溶液用蒸汽注入型连续直热式灭菌器在120'C灭菌7秒钟，然后喷雾干燥，制、成水分含量为4%的大豆肽混合物粉末。获得的大豆肽混合物，15。/。TCA溶解率是99。/。，平均分子量是1100，游离氨基酸的量大约是1%。而且，当用钼兰酸吸光光度法检测这种大豆肽混合物的干固体成分中的植酸(六磷酸中肌醇)含量时，没有检测到植酸(检测极限5mg/100g)。实施例2除了在酸性条件下反应的"肽酶R，，(由AmanoEnzymeInc.生产)的加入量不同，其它按照实施例1中所述的相同步骤，制备大豆肽混合物粉末。而且，以不同添加量单独使用以下各种酶来代替这种酶，如来源于根霉菌属的"Newlase3FG，，(由AmanoEnzymeInc.生产)，及来源于曲霉菌属的"SumizymeAP"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生产)、"SumizymeFP"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生产)、"SumizymeLP"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生产)、"SumizymeLPL，，(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生产)、"蛋白酶M，，(由AmanoEnzymeInc.生产)和"蛋白酶A"(由AmanoEnzymeInc.生产)，均按照相同的步骤制备大豆肽混合物粉末。上述这些酶都含有内切和外切型酸性蛋白酶。渣滓的检测用浊度计(OD:光密度)检测上述实施例1、参考例1(后述)和比较例1-3(后述)所得各种大豆肽混合物的酸性溶液在冷藏下形成的渣滓。分别制备实施例1、2、参考例1(后述)和比较例1、2、3(后述)获得的大豆肽混合物粉末的5%水溶液，用柠檬酸调整到pH3.8，然后冷却到4°C，检测其浊度(OD61Gnm)。实施例1、参考例1和比较例1、2、3的结果如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在实施例1中，OD6H)鹏是0.013，抑制了渣滓的形成。下面，实施例2每种蛋白酶的添加量和其冷藏时的浊度的结果如表2中所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>从表2中可以看出，即使冷藏，在弱酸性条件下(pH4.5)反应也不形成渣滓的酶是来源于根霉菌属的"肽酶R"和"Newlase3FG"，来源于曲霉菌属的"SumizymeFP"、"SumizymeLP"、"SumizymeLPL"、"蛋白酶M"和"蛋白酶A"。尽管加入0.3%"SumizymeAP"也不能完全防止渣滓形成，但是其可以降低所形成的漆滓量。当制备由实施例1和下述参考例1获得的大豆肽混合物的5%水溶液时，对比味道，发现实施例1制备的产品与参考例1相比降低了不受欢迎的气味和坏的味道例如涩味，其味道优良。参考例1由方法A制备的大豆蛋白的蛋白酶处理。向1重量份低度变性脱脂大豆片(NS1卯)中，加入12重量份40°C温水，用氲氧化钠溶液将混合物调整到pH7.0。用匀浆器(TokuahuKikakouCo.，Ltd.生产)将此大豆分散液在5000rpm搅拌1小时，提取蛋白质，然后用离心分离器(1500G,10分钟)去除"豆渣"获得脱脂豆乳。向此脱脂豆乳中，加入盐酸调整到pH4.5，用离心分离器收集沉淀的蛋白凝乳。向此蛋白凝乳中加入水，搅拌混合物制成凝乳淤浆(DM9.0%)。当pH调整到7.0后，用蒸汽注入型连续直热式灭菌器将混合物在140。C灭菌IO秒钟，获得大豆蛋白提取物。将其喷雾干燥制成水分含量为5%的大豆蛋白分离物粉末，然后在58"制成pH8.5的8%溶液。向由此获得的大豆蛋白溶液中，以1.5%E/S比例加入"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo.，Ltd.生产)作为蛋白水解酶，混合物在58°C水解3小时(15。/。TCA溶解率70%)。酶反应后，向大豆蛋白水解溶液中加入柠檬酸调整到pH4.5，对混合物进行加热处理(85。C10分钟)，然后离心(1500G，20分钟)分离和去除含有未分解残渣的不溶性物质。用蒸汽注入型连续直热式灭菌器将生成的大豆蛋白水解物溶液在120。C灭菌7秒钟，然后喷雾干燥制成水分含量为4%的大豆肽混合物粉末。如表l中所示，由方法A制成的这种大豆肽混合物的溶液的浊度(OD61()nm)低至0.043。即，仅仅使用(b)步骤(中性到碱性条件下的蛋白酶处理)和(e)步骤(分离和除去不溶性物质)就不形成渣滓。换句话说，这种大豆肽混合物，没有经过酸性条件下的蛋白酶处理和植酸分解酶处理，如表l中所示即使在酸性条件下也不形成渣滓。比较例1页除了不加入在酸性条件下反应的"肽酶R"(由AmanoEnzymeInc.生产)之外，其它按照实施例1中的相同步骤，制备大豆肽混合物粉末。如表l中所示，不在酸性条件下进行蛋白酶处理，浊度(OD^^)高达1.184，形成了渣滓。比较例2除了在植酸酶反应(酸性条件)中不加入"肽酶R，，(由AmanoEnzymeInc.生产)而在水解过程(pH6.3-8.5)中以0.05%的E/S比例加入"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo"Ltd.生产)之外，其它按照实施例l中的相同步骤，制备大豆肽混合物粉末。然而，ODh。目是1.356并且即使在弱碱性到中性条件下(pH6.3-8.5)的蛋白质水解过程中加入"肽酶R，，(由AmanoEnzymeInc.生产)也不能抑制渣滓的形成。比较例3除了不加入"SumizymePHY，，作为植酸酶(由ShinNihonChemicalsCo.,Ltd.生产)之外，其它按照实施例1中的相同步骤制备大豆肽混合物粉末。如表l中所示，OD61()nmA1.349并且因为没有加入植酸酶而形成了渣滓。工业适用性根据本发明，可以制备大豆肽混合物，其比普通的大豆肽混合物具有更好的味道并且即使在酸溶液中(特别是pH3-4.5)也不形成渣滓。由此，即使将此大豆肽混合物用于酸性条件下的食品和饮料例如酸性饮料和酸性果冻，得到的产品也具有良好的口感并且不形成渣滓。因此，此大豆肽混合物可以用于广泛的酸性食品和饮料，尤其是，酸性液态食品。本发明中使用的大豆蛋白原料是由
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中描述的方法B制备的，而使用方法A制备的大豆蛋白可以获得在酸性冷藏液体中不形成渣滓的大豆肽混合物是不言而喻的。然而，从味道的角度，使用由方法B制备的大豆蛋白提供了比使用由方法A获得的大豆蛋白原料具有更好味道的大豆肽混合物。权利要求1.大豆肽混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(a)用水提取浓缩大豆蛋白获得提取物；(b)在碱性到中性条件下用蛋白酶处理提取物；(c)在酸性条件下用蛋白酶进一步处理生成的产物；(d)用植酸分解酶处理生成的产物；和(e)从产物中分离和去除不溶性物质。2.根据权利要求1所述的方法，其中，(b)步骤中使用的酶包括内切型。3.根据权利要求1所述的方法，其中，(b)步骤中的水解度，以根据蛋白质成分在15%三氯乙酸中的溶解率计算的大豆蛋白分解率计，为20-98%。4.根据权利要求1所述的方法，其中，(c)步骤中使用的酶包括外切型。5.根据权利要求1所述的方法，其中，(c)步骤中使用的酶是曲霉菌属或根霉菌属来源的酶。6.根据权利要求1所述的方法，其中，(d)步骤在(c)步骤之后或同时进行。7.根据权利要求1所述的方法，其中，大豆肽混合物的平均分子量是200-5000。全文摘要本发明的目的是提供一种大豆蛋白水解物，特别是一种具有相对低分子量的大豆肽混合物，其中所述大豆蛋白水解物可由说明书中所述“方法B”制备的大豆蛋白水解而得到，其即使在酸性条件下冷藏也不形成渣滓。本发明公开了大豆肽混合物的制备方法，包括步骤(a)用水提取浓缩大豆蛋白获得提取物；(b)在碱性到中性条件下用蛋白酶处理提取物；(c)在酸性条件下用蛋白酶进一步处理生成的产物；(d)用植酸分解酶处理生成的产物；和(e)从产物中分离和去除不溶性物质。文档编号A23J3/00GK101336076SQ20068005200公开日2008年12月31日申请日期2006年12月6日优先权日2005年12月6日发明者中森俊宏,刘新旗,片濑满申请人:不二制油株式会社