微流控芯片、含有该芯片的装置及其用途，利用该芯片或装置制备液滴的方法与流程

本发明涉及微流控芯片检测领域，特别涉及微流控芯片、含有该芯片的装置及其用途，利用该芯片或装置制备液滴的方法。
背景技术：
：数字pcr(digitalpcr，dpcr)是一种基于单分子pcr方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。数字pcr的关键是稀释模板，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含0个或一个(至多个拷贝)的目标分子。在每个反应单元中分别对目标分子进行pcr扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行统计学分析。数字pcr通过直接计数的方法进行定量分析，即在扩增结束后，有荧光信号的反应单元记为1，无荧光信号则为0，理论上，在样品中dna浓度极低的情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标分子的拷贝数。与传统定量pcr不同，数字pcr无需采用内参和标准曲线，可以实现起始dna模板的绝对定量。而且在数字pcr标准反应体系分配的过程(稀释过程)能够极大地降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字pcr也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。数字pcr的灵敏度，除了与检测器的灵敏度和pcr扩增效率因素有关外，很大程度上取决于反应单元的数目，反应单元的数目越多，数字pcr的灵敏度越高，准确度也越高。根据反应单元形成的不同方式，主要有微反应室/孔板、微流控芯片和微滴。早期技术采用96/384孔作为反应单元，通常是首先通过手工逐级稀释并分配样品至微孔板中，然后将微孔板置于热循环仪上进行pcr反应，反应结束后通过仪器读取每个微孔中的荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，结合分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。这种方式操作繁琐、通量小、效率低，而且较少的液滴分解数目也限制了其精度和可测的动态范围，应用方面有很大的局限。目前，微流控芯片技术的快速发展，使数字pcr能够快速并准确地将样品流体分解为纳升甚至皮升级，获得更多的样品分解数目，进行多步平行反应，从而大大提高数字pcr技术的检测灵敏度、可信度和动态范围度。另外，微流控技术自动化、易集成、通量高的优势，也可极大地提高数字pcr技术的检测效率。借助微流控技术在微流体操控方面的优势，最近国际上已有多个研究小组和公司开发了基于微流控技术的数字pcr系统。比较典型的包括fluidigm公司推出的基于微室型的biomarktm系统和bio-rad公司推出的基于液滴型的qx100tm系统。微液滴技术是指利用不互溶相形成油包水或水包油的相对稳定的独立微体积液滴。乳化方式有多种，其中基于微流控芯片的液滴生成技术最近几年得到快速发展，广泛应用于生物界和材料界，是一种非常重要的技术。其原理主要是通过两相液流之间一定角度户型挤压作用下，其中一相连续液流断裂形成液滴。目前常用的液滴制备方式有正交结构(t-junction)和流式聚焦(flow-focusing)等。这些方法整体设备的系统比较复杂，对流体控制系统的要求比较高，并且最终获得的有效液滴数目相对较少。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种多层液滴微流控芯片结构及其制备方法，使用本发明方法可以快速方便地在芯片内部生成多层大量大小均一、稳定的液滴，检测时可配合激光共聚焦成像系统逐层对芯片整体进行扫描成像检测，无需像流式细胞仪那样对液滴进行单颗的检测。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种微流控芯片，包括上片和基片6；所述上片设置有液滴形成流道1和液滴存储部件2；所述液滴形成流道1与所述液滴存储部件2之间通过台阶结构12连接；所述基片6与所述液滴存储部件2之间设置有液滴存储腔8。在本发明的一些具体实施方案中，所述基片6设置有凹槽7，所述凹槽7与所述液滴存储部件2紧密配合，形成液滴存储腔8。在本发明的一些具体实施方案中，所述微流控芯片还包括进样孔4和进样腔10，所述进样孔4、所述进样腔10、所述液滴形成流道1、所述台阶结构12与所述液滴存储部件2依次连接。在本发明的一些具体实施方案中，所述微流控芯片还包括进样部件9、排油流道3、排油腔11和排油孔5；所述进样部件9包括进油端口9.1和储油端口9.2；所述进油端口9.1、所述液滴存储部件2、所述排油流道3、所述排油腔11、所述排油孔5与所述储油端口9.2依次连接。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供了一种微流控芯片，包括上片、基片6和进样部件9，所述上片设置有液滴形成流道1、液滴存储部件2、排油流道3、进样孔4、进样腔10、排油腔11和排油孔5；所述基片6设置有凹槽7，所述凹槽7与所述液滴存储部件2紧密配合，形成液滴存储腔8；所述进样部件9包括进油端口9.1和储油端口9.2；所述液滴形成流道1与所述液滴存储部件2之间通过垂直方向的台阶结构12连接；所述进样孔4、所述进样腔10、所述液滴形成流道1、所述台阶结构12与所述液滴存储部件2依次连接；所述进油端口9.1、所述液滴存储部件2、所述排油流道3、所述排油腔11、所述排油孔5与所述储油端口9.2依次连接。在本发明的一些具体实施方案中，所述进样孔4、所述进样腔10设置于所述液滴存储部件2的一侧，所述排油腔11设置于所述液滴存储部件2的其余侧边的外周，所述排油孔5设置于所述液滴存储部件2的另一侧。在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴存储部件2横截面的长度与待生成液滴的直径之比为(3～10):1。在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴存储部件2横截面的长度为200～1000μm。在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1与所述液滴存储部件2连接的端部设置有倒角14，所述倒角在液滴形成方向上的长度为1～100μm，所述倒角的角度为30°～60°。在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1、所述排油流道3的数目分别至少为1个。在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1的横截面为矩形，宽度为10～200μm，长度为1～100μm。在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1的排布密度两侧较为稀疏，中间较为密集。在本发明的一些具体实施方案中，所述进样部件9设有硅胶材质的密封接口塞，所述密封接口塞设有连通进样腔10的通孔。在本发明的一些具体实施方案中，所述芯片的上片、基片为透明材料，如玻璃、透明pc等材质。所述进样部件9为黑色材料。本发明还提供了一种装置，包括所述的微流控芯片。本发明还提供了所述的微流控芯片和/或所述的装置在制备液滴、储存液滴、核酸扩增和/或检测液滴中的应用。在此基础上，本发明还提供了液滴的制备方法，将油相通过所述进油端口9.1充满所述液滴存储腔8和排油腔11，将样本通过所述进油端口9.1注入，经与所述进油端口9.1连通的所述进样孔4通入，流经所述进样腔10、所述液滴形成流道1，于所述台阶结构12形成液滴，所述液滴存储于所述液滴存储腔8中，多余的油相经所述排油流道3、所述排油腔11通过排油孔5存储于所述储油端口9.2。在本发明的一些具体实施方案中，所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分包括矿物油和烷烃，所述烷烃为12～16烷中的一种或其两者以上的混合物；所述表面活性剂包括em90和tritonx-100。在本发明的一些具体实施方案中，所述烷烃为正十四烷，所述烷烃占所述主体成分的质量百分含量为10％～50％。在本发明的一些具体实施方案中，所述表面活性剂中，em90的质量为主体成分质量的1％～3％，tritonx-100的质量为主体成分质量的1％～3％。本发明提供了一种多层液滴微流控芯片结构及其制备方法，使用本发明方法可以快速方便地在芯片内部生成多层大量大小均一、稳定的液滴，检测时可配合激光共聚焦成像系统逐层对芯片整体进行扫描成像检测，无需像流式细胞仪那样对液滴进行单颗的检测。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示本发明芯片上片结构示意图；图2示本发明芯片纵向全剖示意图；图3示进样部件9示意图；图4示进样部件9局部放大示意图；图5示芯片液滴形成流道1局部放大示意图；图6示芯片排油流道3局部放大示意图；图7示芯片台阶结构12放大示意图；图8示实施例7中试剂拷贝数与理论拷贝数关系图；其中，1-液滴形成流道；2-液滴存储部件；3-排油流道；4-进样孔；5-排油孔；6-基片；7-凹槽；8-液滴存储腔；9-进样部件；9.1-进油端口；9.2-储油端口；10-进样腔；11-排油腔；12-台阶结构；13-倒角；14-倒角。具体实施方式本发明公开了一种微流控芯片、含有该芯片的装置及其用途，利用该芯片或装置制备液滴的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。一种多层液滴微流控芯片结构及其制备方法，所述芯片结构包括上片、基片6和进样部件9，上片和基片6之间具有储存多层液滴的液滴存储腔8以及与所述液滴存储腔连通的液滴形成流道1和排油流道3，所述液滴形成流道1的高度低于上片液滴存储部件2，使得液滴形成流道1与所述液滴存储部件2的连接处具有形成液滴的台阶结构12，上片、基片之间的液滴存储腔8距离为所生成液滴直径的3-10倍，从而使液滴能够以多层的形式存储在腔内。进样部件9由两个端口9.1和9.2组成，主要是储存多余的水相和油相。所述方法包括：(1)将油相通过进样部件9的一个端口9.1充满整个液滴存储腔8和排油腔11；(2)将水相通过压力泵从液滴形成流道1输入芯片，水相在所述台阶结构12处形成液滴，液滴在剪切力的作用下落入所述液滴存储腔8内，充满整个液滴存储腔8和排油腔11，同时油相从排油流道3排出，最终溢出的油相储存在进样部件9的另一端口9.2。所述芯片本体内部还设有进样腔10和排油腔11，所述进样腔10和液滴存储部件2之间、液滴存储部件2与排油腔11之间分别设有多个液滴形成流道1和排油流道3，芯片本体表面设有分别与进样腔10和排油腔11连通的进样孔4和排油孔5。所述液滴存储部件2为矩形结构，进样腔10位于液滴存储部件2上方一侧，进样腔10和液滴存储部件2之间设有多个平行布置的液滴形成流道1，提高液滴制备的通量；所述排油腔11设于液滴存储部件2的外周，左、右和下方三侧，排油腔11和液滴存储部件2之间设有多个平行布置的排油流道3，可在液滴落入液滴存储腔8和排油腔11的同时，快速将原液滴存储腔的油相排出。所述液滴形成流道1连接液滴存储部件2的端部设有倒角13，所述倒角13在液滴形成方向上的长度为1～100μm。设置倒角13也是为了利于液滴的生成和移动。所述倒角13在液滴形成方向上的长度大小会影响生成液滴的大小，在一定范围内，液滴大小随着这个长度增加而增大。所述液滴形成流道1的横截面为矩形，宽度为10～200μm，长度为1～100μm。液滴的大小与液滴形成流道1的大小有直接关系，液滴形成流道1的宽度与长度越大产生的液滴就越大，相同液滴存储腔8深度下，形成液滴的层数变少。所以液滴形成流道1的大小需要在合适的范围内。所述液滴形成流道1的排布密度，两侧较为稀疏，中间较为密集，这种排列可以使各处生产液滴的速度接近。此设计可避免通道均匀分布所造成的离进样端较近的通道压力过大，水相流速过快，产生液滴过多。所述进样孔4入口设有硅胶材质的密封接口塞，所述密封接口塞设有连通进样腔10的通孔。硅胶材质具有良好的弹性，使用具有弹性的密封接口塞可以保证加油相和水相时，移液管可以与密封塞紧密配合，确保加样时芯片流道内的密闭性，使流速和压力都能稳定实施，促使液滴形成的均匀一致。芯片上集成多个反应区可以增加反应的通量，方便进行多个样品的实验。微流控芯片是具有产生微滴颗粒复杂结构的，是用来生成和储存微液滴颗粒的载体，在微流控芯片内首先要注入油相成分溶液，而油相成分溶液是用来生成微滴颗粒必备条件，(这就是水相试剂在油相溶液中，由于表面张力的作用而形成的一个独立的油包水颗粒)也是为微液滴颗粒生存提供环境，同时也为微液滴颗粒进行扩增时需要提供温度的热传导介质。因此需要有一种液滴制备的油相组合物，使生成的液滴大小均一，热稳定性好，不易挥发，不易产生气泡，不抑制pcr扩增。所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分为矿物油和烷烃，所述表面活性剂为em90和tritonx-100，其中，所述烷烃为12-16烷中的一种或两者以上的混合物。所述烷烃为正十四烷，烷烃的体积占所述主体成分质量的10％-50％。所述表面活性剂中，em90的质量为主体成分的1％-3％，tritonx-100的质量为主体成分的1％-3％。所述烷烃为正十四烷，烷烃的体积占所述主体成分质量的10％-50％。由于单独使用矿物油作为油相的主体成分，运动粘度仍然偏高，液滴形成和沉降速度偏低，所以还需要添加其他成分解决这个问题。经实验发现，烷烃类，特别是正十四烷，具有良好的效果，能够形成较好的液滴，且液滴经pcr扩增等步骤后，仍具有良好的形态，不易破碎或融合。进一步优选的，所述烷烃的质量占所述主体成分质量的30％-40％。实验发现，所述烷烃添加的量有一定的限度，添加量过高的话，所得的液滴容易破碎或发生融合。所述表面活性剂中，em90的质量为主体成分的1％-3％，tritonx-100的质量为主体成分的1％-3％。进一步优选的，所述表面活性剂中，em90的质量为主体成分的2％-3％，tritonx-100的质量为主体成分的2％-3％。更进一步优选的，所述表面活性剂中，em90的体积质量为主体成分的3％，tritonx-100的质量为主体成分的3％。在表面活性剂的选择上，需有优异的高温稳定性，与其它活性成分有良好的相容性。表面活性剂em90属硅酮表面活性剂，硅氧烷链上接聚氧乙烯醚链，以peg作为亲水基，聚硅氧烷作为亲油基。表面活性剂tritonx-100是一种非离子型表面活性剂，在溶液中不是以离子状态存在，所以稳定性高，与其它类型表面活性剂能混合使用，相容性较好，在各种溶剂中均有良好的溶解性。本发明方法通过将油相充满整个液滴存储腔，然后将水相通过压力泵从液滴形成流道输入芯片，水相在所述台阶结构处形成液滴，落入所述液滴存储腔内，同时油相从排油流道排出，因液滴存储腔深度为所形成液滴直径的3-10倍，从而大量液滴能以多层的形式存在于整个液滴存储腔中，然后可以直接将芯片放置到pcr仪器上进行反应，反应后再使用成像装置进行成像，数据分析。本发明提供的微流控芯片、含有该芯片的装置及其用途，利用该芯片或装置制备液滴的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1热压模具的制备，利用镍模制备上片结构，详细结构见图1，其中液滴形成流道1宽度为60微米；整个液滴存储腔2尺度：约15mm×18mm；排油流道3宽度为60微米；液滴存储部件2的高度约为100微米；将制备好的镍模加热约135℃之后，利用pc板材热压制备成结构上片，将上片进样孔4和排油孔5激光打孔，直径为1.5mm。芯片上片的加工也可以通过玻璃蚀刻加工制成。实施例2芯片的制备和键合，将pc基片6对应上片液滴存储部件2的位置做成凹槽7，其中深度约为300微米，将芯片基片与上片，利用溶剂辅助热压键合的方式键合在一起，完成芯片的制备，通过上述方式可形成一个密封的液滴储存腔8，见图2。芯片基片液滴储存部件2对应位置的凹槽7也可以通过玻璃蚀刻而成，然后将玻璃上片和基片通过溶剂辅助键合的方法，也可以形成一个密封的液滴储存腔8。实施例3在液滴形成流道1连接液滴存储部件2的端部设有倒角14，所述倒角在液滴形成方向上的长度为1～100μm，在此范围内随着倒角的长度增大，液滴的大小会随之改变。实施例4在进样部件9的上表面四周设置有45度倒角13，在对芯片进行检测时，此倒角能够将光线通过45度角垂直反射而不是产生漫反射，使得杂光不能够进入ccd。实施例5多层液滴的pcr扩增和信号检测将该芯片放入pcr仪进行原位pcr扩增(insitupcr)，按如下程序进行pcr扩增：96℃预变性10min；98℃变性30s，62℃退火延伸1min，共39个循环；62℃延伸1min，25℃保温。扩增结束后，显微镜观察液滴形态。通过ccd或者激光共聚焦扫描显微镜计数荧光信号阳性乳滴。实施例6灵敏度检测(1)配制油相，按照以下比例配制好油相(均以质量计)：2/3矿物油+1/3正十四烷+3％em90+3％tritonx-100，将油相超声波除气后备用。(2)芯片存储腔18mm×20mm×500um，上样量75ul；(3)配制水相，即pcr反应体系，模板为将1％t790m突变比例的标准品采用野生型标准品稀释为0.0005％，引物序列为：f：5’-gcctgctgggcatctg-3’(如seqidno.1所示)，r：5’-tctttgtgttcccggacatagac-3’(如seqidno.2所示)，探针序列为：5’-fam-atgagctgcatgatgag-mgb-nfq-3’(如seqidno.3所示)，5’-vic-atgagctgcgtgatgag-mgb-nfq-3’(如seqidno.4所示)，其中fam为荧光报告基团，nfq为荧光淬灭基团。按照表1中体系配制水相：(4)表12×pcr反应缓冲液(包括taq酶、dntp、镁离子)37.5μlbsa(1％)7.5μl上游引物f(10μm)1.5μl下游引物r(10μm)1.5μlfam探针(5μm)1.5μlvic探针(5μm)1.5μl模板20.0μl去离子水4μl总体积75μl(4)多层液滴生成通过进样杯装置9的第一端口9.1，使油相首先通过进样腔10，然后通过液滴形成流道1，充满整个液滴存储腔8和排油腔11。然后通过9.1，注入pcr反应体系，通过压力泵，将pcr反应体系从进样腔注入芯片，pcr反应体系在所述台阶结构12处形成纳升级的液滴(直径约80μm左右)，在剪切力的作用下落入液滴存储腔8内，液滴在液滴存储腔8中聚集浓缩，填满腔体，因液滴存储腔高度约为500μm，液滴以多层的形式存在于液滴存储腔8内，同时油相从排油流道3排出，最终存储在进样杯装置的第二端口9.2，此时用两滴油相封闭进样杯装置的第一端口9.1。(5)pcr扩增及信号检测将该芯片放入pcr仪进行原位pcr扩增(insitupcr)，按如下程序进行pcr扩增：96℃预变性10min；98℃变性30s，62℃退火延伸1min，共39个循环；62℃延伸1min，25℃保温。扩增结束后，通过ccd或者激光共聚焦扫描显微镜计数荧光信号阳性液滴数量，分别计算fam和vic的拷贝数，得出突变率。(6)分析得到的fam拷贝数为0.193copies/μl，vic拷贝数为39976.52copies/μl，突变率为0.0005％。而lifequantstudio3ddigitalpcr和bio-radqx-200目前最高只能检测0.001％，且多层液滴微流控芯片增加了上样量，本实验中，模板上样量为20μl，故无法通过lifequantstudio3ddigitalpcr或bio-radqx-200进行检测。实施例7按照实施例6中的操作方法检测her2线性，模板为自主构建的质粒，用te溶液分别稀释成106、5×105、2.5×105、1.25×105、6.25×104copies五个浓度，引物序列为，f：5’-acaaccaagtgaggcaggtc-3’(如seqidno.5所示)，r：5’-gtattgttcagcgggtctcc-3’(如seqidno.6所示)，探针序列为5’-fam-ggacatcctttggcttttga-bhq-3’(如seqidno.7所示)，其中fam为荧光报告基团，bhq为荧光淬灭基团，pcr反应液配制方法如表2所示：表22×pcr反应缓冲液(包括taq酶、dntp、镁离子)37.5μlbsa(1％)7.5μl上游引物f(50μm)1.35μl下游引物r(50μm)1.35μlfam探针(25μm)0.75μl模板20.0μl去离子水6.55μl总体积75μl计算得到fam拷贝数后作图，横坐标为理论拷贝数，纵坐标为实际拷贝数，最终得到的r2＝0.9996。表3本发明提供的多层液滴微流控芯片生成的液滴数量增加，从而增大了检测范围，此外由于上样量增多，模板加入量增加，无法用lifequantstudio3ddigitalpcr和bio-radqx-200进行检测。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>领航基因科技（杭州）有限公司<120>微流控芯片、含有该芯片的装置及其用途，利用该芯片或装置制备液滴的方法<130>mp1815795<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcctgctgggcatctg16<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tctttgtgttcccggacatagac23<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atgagctgcatgatgag17<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atgagctgcgtgatgag17<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5acaaccaagtgaggcaggtc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gtattgttcagcgggtctcc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ggacatcctttggcttttga20当前第1页12