本发明涉及一种异戊二烯基黄酮化合物及其衍生物制备方法以及该类化合物在预防或治疗患者心脑血管系统疾病、骨质疏松症、癌症、性功能障碍中的应用。
背景技术：
：天然产物的主要有效成分的单一化合物作为化学药物本身或药物研发的先导化合物是多年来药物研发人员从事化学药物研发的重要研究方法之一，黄酮苷类化合物具有抗自由基、抗氧化、防治心血管疾病、抑菌、激素的调节和提高人体免疫的作用。然而，淫羊藿苷的价格高，部分成分每公斤的价格达到10万元，原料的价格和来源大大限制了淫羊藿的应用。技术实现要素：其它植物来源的黄酮糖苷的价格较低(大部分不高于1000元/公斤)，如芹菜素、槲皮素。因此本发明通过利用成本较低的黄酮化合物通过生物酶催化法来合成淫羊藿次苷ⅰ类化合物——异戊二烯基黄酮化合物及其衍生物，具有很高的医用价值和经济价值。技术方案如下：一种异戊二烯基黄酮化合物及其衍生物，其结构式如式i所示的化合物或式i所示化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；其中，1)r1选自h、oh、och3、ch3coo、nh2、ch3nh、(ch3)2n、ch3conh或cn；2)r2选自h、oh、och3、ch3coo、nh2、ch3nh、(ch3)2n、ch3conh或cn；3)r3选自h、oh、och3、ch3coo、nh2、ch3nh、(ch3)2n、ch3conh或cn；4)r4选自h、oh、och3、ch3coo、nh2、ch3nh、(ch3)2n、ch3conh或cn；5)r5选自h、oh、och3、ch3coo、nh2、ch3nh、(ch3)2n、ch3conh或cn；6)r6选自h或异戊二烯基。优选的异戊二烯基黄酮衍生物的官能团被指定为：r1为oh或och3；r2为h、oh或och3；r3为h、oh或och3；r4为h、oh或och3；r5为h、oh或och3；r6为再进一步，将r1、r2、r3、r4、r5限定为och3；r6为一种药物组合物，上述的异戊二烯基黄酮化合物或衍生物，还包含药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、媒介物或它们的组合。一种异戊二烯基黄酮化合物及其衍生物的合成方法，具体为：利用生物酶催化法将异戊二烯基与黄酮化合物连接，所述黄酮化合物包括槲皮素、芹菜素、山奈酚、黄芩素、野黄芩素、白杨素、黄豆苷元、染料木素、异鼠李素、杨梅黄酮、木犀草素、漆黄素、淫羊藿素或柚皮素。使用异戊二烯基转移酶在r6上连接异戊二烯基；应用o-甲基转移酶在r1、r2、r3、r4、r5连接och3。还包括通过udp糖基化转移酶合成异戊二烯基黄酮化合物的衍生物糖基化异戊二烯基黄酮。另一方面，本公开涉及了一种化合物、衍生物或组合物用于制备药物的用途，该药物用于预防、减轻或治疗心脑血管系统疾病中的用途。同时还涉及到一种化合物、衍生物或组合物用于制备药物的用途，该药物用于预防、减轻或治疗骨质疏松症中的用途。以及涉及到一种化合物、衍生物或组合物用于制备药物的用途，该药物用于预防、减轻或治疗癌症中的用途。目前国内外并没有通过芹菜素、槲皮素等天然黄酮化合物来合成异戊二烯基黄酮化合物及其衍生物的报道，且通过发明人对本发明的化合物进行了一系列的生物实验，证明了本发明的化合物-异戊二烯基黄酮化合物具有预防或治疗心脑血管系统疾病、骨质疏松症和治疗癌症中的用途。因此，本发明所述异戊二烯基黄酮化合物及其衍生物具有很好的应用前景。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步说明，本发明以槲皮素为实例来说明本发明构思，但并不局限于芹菜素，亦包括柚皮素、槲皮素、山奈酚、黄芩素、野黄芩素、白杨素、黄豆苷元、染料木素、异鼠李素、杨梅黄酮、木犀草素、漆黄素、淫羊藿素等。本发明的实例并不局限于具体的实例，只是一种合成思路。实施例1：以槲皮素为例来制备异戊二烯基黄酮化合物及其衍生物包括以下步骤：(1)以槲皮素为底物，将其用缓冲液配制成槲皮素溶液；槲皮素(纯度为98％)；缓冲液为含有0.1mm含有(mg2+(50％)，ba2+(11.3％)，ca2+(13.6％)，fe2+(5.8％)，co2+(7.9％)，cu2+(7.6％)，zn2+(7.8％))缓冲盐溶液，该缓冲盐为硫酸盐、氯化盐、硝酸盐或硼酸盐等，用盐酸调节ph5；(2)先加入异戊二烯基转移酶和二甲基烯丙基二磷酸酯，反应1h；所述的异戊二烯基转移酶的浓度为50μg/ml，二甲基烯丙基二磷酸酯的浓度为100μg/ml，反应的ph值为5.0，在加入s-腺苷甲硫氨酸和o-甲基转移酶前每半小时加入二甲基烯丙基二磷酸酯，使浓度维持在100μg/ml；(3)反应3小时后，加入s-腺苷甲硫氨酸和o-甲基转移酶，用盐酸调节ph4.0，o-甲基转移酶的浓度为150μg/ml，s-腺苷甲硫氨酸浓度为600μg/ml，继续反应3-7小时；(4)沸水浴加热5min灭活酶后，得到产物。实施例2：糖基化异戊二烯基黄酮(ycia)的制备将实施例1合成的化合物20克溶于ph6.8的磷酸盐缓冲溶中，加入固定化葡萄糖基转移酶10克，udp葡萄糖18克，在60℃，搅拌下反应12小时，析晶，过滤收集固体，甲醇重结晶处理。得13.5克糖基化异戊二烯基黄酮(ycia)。实施例3：毒理学实验在28±1℃的温度，70±5％的湿度条件下，选取7～8周龄，健康的清洁级nih小鼠20只雌雄各半，体重在18～20g。将饲料和水消毒，试验前和试验的观察期内，均按正常饲料条件饲养。将酶法合成实施例2中得到的ycia溶解在0.5％tween80中，浓度为300mg/ml，将该液体经口给药小鼠，给药剂量为0.4ml/20g小鼠体重。给药后观察1,4,8,12小时，以后每8h观察一次。观察死亡情况，每天记录小鼠体重变化以及其他的症状。第10天，断颈处死小鼠，取各器官进行病理检查。在第10天，全部小鼠存活，2.2g/kg剂量的ycia未见毒性反应。小鼠各器官病理检查正常，没有发现病变，10天内小鼠体重未见减轻。因此，说明本发明的ycia药物在口服给药动物时未见毒性。实施例4：ycia在防护、处理、治疗、心脑血管系统疾病药物中的用途对大鼠“兔脑粉-高分子葡聚糖”造成脑梗塞的治疗作用的药效学试验。材料：动物：大鼠，体重250～350g，雌雄各半。器材：锥板粘度计、离心机、刻度离心、试管、眼科剪、眼科镊及常用手术器械、0号手术丝线、血管夹等。药品及试剂：试验组1：淫羊藿次苷ⅰ；试验组2：ycia对比组1：芹菜素；对比组2：槲皮素。以上药物采用常规方法制备得供试品。以市售灯盏花素注射液为阳性药对照；兔脑粉(兔脑粉凝血活酶粉)。取分样筛120～150目之间的兔脑粉，颗粒为100～120μm。高分子葡聚糖：分子量500万。栓塞剂的配制：将25mg兔脑粉混于10％高分子葡聚糖溶液100ml中，置于37℃水浴中40分钟。然后，放于-18℃冰箱备用。快速医用zt胶。小牛血清白蛋白、任氏液。肝素钠：按20u/ml血剂量加入试管，40℃以下烘干备用。试验方法：1、大鼠脑梗塞模型制备：大鼠乙醚麻醉，仰卧固定，皮肤剪毛消毒，颈部切开，分离左侧颈总动脑、颈内、颈外动脉。分别夹闭颈外动脉、颈总动脉近心端。在远心端处再夹一血管夹。将栓塞剂摇匀后，用0.25ml注射器按0.03ml/100g大鼠剂量刺进颈总动脉，打开远心端血管夹，将栓塞剂注入。然后，夹闭颈总动脉远心端，拔出针头，用医用胶粘合针孔。1分钟后依次放开颈总动脉远心端、近心端、颈外动脉的血管夹，恢复血流，清理创口，缝合皮肤。药物对脑梗塞后不同时间的血液流变学影响：将大鼠分为给药组(试验组1～3组或对照例1～3组+动物模型组)、生理盐水组(生理盐水+动物模型组)、假手术组(对照组)，每组12只大鼠。给药组、生理盐水组均按上述方法施以手术操作，假手术组手术操作完全相同，但不注射栓塞剂，以生理盐水代替栓塞剂，注射于颈内动脉。给药组于手术前3天口服药物(试验组、对照例)1.42g/kg。阳性药于手术前1小时腹腔注射药物1.0mg/kg。生理盐水组注射同量生理盐水。假手术组不注射任何药物。以后每天上午给药1次，连续3天。在术后第3天将大鼠麻醉(25％乌拉坦0.3ml/100g体重，腹腔注射)，右颈总动脉放血于肝素试管中，在2小时内用锥板粘度计测定不同切变率下的全血粘度。再将全血以1500rpm离心，吸去上层血浆。然后用0.25％牛血清白蛋白-任氏液漂洗红细胞三次，每次1500rpm离心10分钟。最后，在刻度试管内配制成红细胞：蛋白任氏液＝6:4的红细胞蛋白任氏液，在20秒1切变率下测定其粘度。以红细胞蛋白任氏液粘度作为红细胞变形能力。所有实验均在25℃恒温下进行，对实验结果进行统计学检验。具体数值及结果见表1。表1：对大鼠脑梗塞后不同时间的全血粘度影响(单位：mpa.s)注：**p＜0.05***p＜0.01均与生理盐水组比较。由表1试验结果可知，梗塞3天时，生理盐水组与假手术组相比，全血粘度上升(p<0.05)，说明动物模型造模成功，各给药组均可不同程度地降低全血粘度，其中以本申请药物效果最好(p<0.01)，淫羊藿效果次之，对照药物效果较差。与生理盐水组比，全血粘度下降，统计学处理有显著性意义。实施例5：ycia的防护、处理、治疗癌症药物中的用途1)培养细胞：选用前列腺癌细胞作为实验对象。将细胞接种于直径为10cm的培养皿后，使用10％的胎牛血清dmem培养基，37℃，5％co2环境中培养。2)接种细胞：将细胞接种于96孔板的培养皿中，细胞密度约为2000/ml,然后在37℃，5％co2环境中培养15h。3)吸走板空中培养液，加入配好浓度的本发明化合物溶液。本发明化合物用dmso溶液配制，处理浓度分别为0μm、0.1％dmso、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm。每个浓度处理三次。4)将药物处理后的96孔板置于在5％co2、37℃培养箱中分别培养24h、48h以及72h。5)吸取培养液，往每孔中加入5mg/ml的mtt，20μl。再次放入培养箱中静置4h。6)形成甲醇结晶后，吸走多余mtt溶液，在每孔中加100μldmso溶液并充分震荡，使黄色结晶溶解。7)用酶标仪检测吸光值并读数，记录读出结果并用软件计算细胞的抑制率。最后，对结果进行统计分析表2。表2：本发明化合物不同浓度对前列腺癌细胞的抑制率样本浓度细胞存活率空白对照0.1％dmso94.2％实例15μm100.7％实例210μm93.6％实例320μm75.4％实例430μm61.5％实例540μm42.8％实例650μm32.3％从表2中可以看出，本发明的ycia对前列腺癌细胞具有良好的抑制作用，可以作为抗癌药物的选择。实施例6：ycia的防护、处理、治疗骨折和骨质疏松症药物中的用途本发明化合物对破骨细胞的增殖和分化作用的活性实验原理：单核的破骨前体细胞在分化细胞因子(如rankl，m-csf)诱导下，能够逐渐融合分化为多核的成熟破骨细胞。破骨前体细胞不具备溶骨的能力，只有分化成熟的破骨细胞才具有溶解固执的能力，因此，破骨细胞的分化水平能够反应其溶骨能力。方法：将破骨前体细胞系或原代分离培养的小鼠破骨前体细胞接种到12孔培养板中，10000细胞/孔。设置对照组，单加药组1(ycia)、单加药组2(rankl)和双加药组(ycia+rankl)。待细胞贴壁过夜后，加入不同剂量的本发明化合物和/或50ng/ml的rankl，持续培养3～5天。等单加rankl的细胞融合完全后，用37度预热的蒸馏水洗细胞一次，加入甲醇固定30秒，37度预热的蒸馏水洗细胞三次，然后进行trap染色，在显微镜下计数trap阳性的多核细胞数。结果与评价：结果见表3所示。与对照组相比较，加入本发明化合物后，无论在破骨前体细胞系或原代分离培养的小鼠破骨前体细胞中，由rankl诱导分化的破骨细胞数量明显减少，这个结果证明：本发明化合物能够有效地抑制rankl诱导的破骨细胞的分化。表3ycia对原代培养的骨髓bmms细胞向破骨细胞分化的影响化合物浓度增值率(％)空白对照-/-0.00单加药组10.5μm28.6％单加药组21.0μm22.5％双加药组1.0μm20.1％从表3可以看出，与对照组相比较，加入ycia后，无论在破骨前体细胞系或原代分离培养的小鼠破骨前体细胞中，由rankl诱导分化的破骨细胞数量明显减少，这个结果证明：ycia能够有效地抑制rankl诱导的破骨细胞的分化。当前第1页12