本发明涉及缓释材料及微生物技术领域，具体涉及一种利用锐孔法制备解磷微生物缓释海藻酸钠微球的方法。
背景技术：
海藻酸钠是从褐藻中提炼出的一种天然杂多糖，其独特的结构特征使其常用作基质包封或者传递各种活性成分和生物试剂。微球作为微储存器可以用来保护并储存某些物质，通过囊膜的扩散渗透释放出其中的活性成分，这种机制是微球发挥作用的主要途径。缓释微球是用特殊材料将功能分子或菌种包埋制成的微球制剂，其能够在一定条件下缓慢释放出包埋的物质，或者成为一个受外界环境影响较小的微反应器产生特定物质并释放出来。由于海藻酸钠具有优良的生物相容性，用其作为微生物的包覆材料在一定程度上保证了菌种的活性。此外，海藻酸钠具有良好的生物降解性，应用于生物肥料中可以很大程度上避免对环境的影响。
解磷微生物用于农业生产实践已经有较长时间，但是效果并不理想，一方面其与当地微生物相比缺乏强有力的竞争能力，此外还存在缺乏较好的腐生能力、受外界环境影响较大等问题。现有技术中(如cn106591278a、cn102476964a)通过微球包覆缓释虽然在一定程度上能够解决这些问题，但是依然存在微球强度不够、缓释效果不够持久等不足。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有微生物缓释海藻酸钠微球存在的上述问题，采用锐孔法制得缓释微球后再在其表面包覆一层壳聚糖类物质，不仅提高了微球强度而且进一步提高了微生物缓释效果。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
利用锐孔法制备解磷微生物缓释海藻酸钠微球的方法，包括以下步骤：
(a)以低品位磷矿粉为驯化剂，对磷矿矿区微生物菌群或农田土壤微生物菌群等进行筛选、富集、驯化，得到目标解磷微生物菌群备用；
(b)将培养好的目标解磷微生物菌群加入到海藻酸钠溶液中，得到解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液；
(c)通过针孔将解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液滴加到cacl2溶液中，固液分离得到微球。
还可以根据实际情况对上述微球进行二次包覆，即增加步骤(d)：将步骤(c)所得微球分散在壳聚糖溶液中，振荡处理后固液分离得到解磷微生物缓释海藻酸钠微球。壳聚糖二次包覆有助于进一步提高微球强度使其不容易破裂，并且有助于提升缓释效果和持续时间。步骤(d)中利用0.1-1mol/l的稀醋酸水溶液配制质量分数为0.1％-2％的壳聚糖溶液，微球与壳聚糖溶液的质量比为1:2-5，振荡处理时间为10-30min，振荡处理完成后过滤，所得微球自然风干。经过实验对比发现，真空干燥所得微球彼此之间粘连严重，而冷冻干燥所得微球表面会出现明显的内陷，并且影响微球性能以及菌种活性。
进一步的，步骤(a)中筛选方法如下：按照50-100g：1l的比例将磷矿矿区土壤或农田土壤与无菌水混合，搅拌均匀后取上层浑浊液，依次用纱布、滤纸过滤多次，所得滤液即为筛选好的初始菌液。从磷矿矿区或农田土壤取样主要是因为这些地方解磷微生物种类较多，容易筛选到适应性较好的解磷微生物。
进一步的，步骤(a)中富集方法如下：将体积比为8-30:1的富集培养基和筛选好的初始菌液置于培养器中，在28-30℃下恒温振荡培养3-5天，取第一次培养后的菌悬液按照同样的方法重复培养3-4次，得到富集好的解磷微生物菌群悬浮液。通过多次富集可以提高优势解磷菌的活性和菌群密度，确保所得菌群具有高效解磷能力。
进一步的，步骤(a)中驯化方法如下：将体积比为5-15:1的驯化培养基和富集好的解磷微生物菌群悬浮液置于培养器中，在28-30℃下恒温振荡培养3-5天，取第一次驯化培养后的菌悬液按照同样的方法重复驯化培养3-4次，在此过程中逐渐提高驯化培养基中低品位磷矿的含量，最终得到具有较好适应性的目标解磷微生物菌群。通过多次驯化提高所得菌群的适应能力对后续缓释肥料的制备具有重要意义，实际使用过程中缓释的少量解磷微生物菌群只有具有较好的适应能力才能在土壤中定殖并发挥作用。
所述富集培养基按照重量份数计的配方为：葡萄糖10.0份，(nh4)2so40.1份，mgso4或其水合物0.25份，kcl0.2份，mgcl2或其水合物0.5份，ca3(po4)21份，蒸馏水1000份，ph＝7.0。所述驯化培养基按照重量份数计的配方为：葡萄糖10.0份，(nh4)2so40.1份，mgso4或其水合物0.25份，kcl0.2份，mgcl2或其水合物0.5份，低品位磷矿粉1-5份，蒸馏水1000份，ph＝7.0。驯化培养基在富集培养基的基础上增加了低品位磷矿粉成分。
进一步的，步骤(a)中所得目标解磷微生物菌群为混悬液或者冷冻离心后的菌泥。
进一步的，步骤(b)中将培养好的目标解磷微生物菌群加入到质量分数为0.5％-3％的海藻酸钠溶液中，目标解磷微生物菌群与海藻酸钠溶液的体积比为1:4-15。配制海藻酸钠溶液时可加热至50℃左右并机械搅拌或者调节溶液ph至碱性，以便促进海藻酸钠溶解，溶解完成后需冷却至室温才可加入菌液或菌粉。经过实验验证，0.5％-3％的海藻酸钠溶液制得的微球强度适中，具有较好的缓释效果。
进一步的，步骤(b)所述解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液中还包括含量为2-20g/l的致孔剂，所述致孔剂选自碳酸氢钠、纳米碳酸钙、碳酸钠中的一种。
进一步的，步骤(c)中所述针孔的孔径为0.2mm-0.5mm，液滴下落高度为6-15cm，注射速度为1-10ml/min，液滴匀速滴入cacl2溶液中，所述cacl2溶液的质量分数为0.5％-5％。
进一步的，步骤(c)中解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液加入到cacl2溶液中固化0.5-1h后过滤，所得固体物质用水分散后超声振荡5-20min后再次过滤，重复水分散-过滤步骤3-5次，最后自然风干得到粒径2mm-3.3mm的微球。
锐孔法是通过针孔或挤压器将海藻酸钠以球状滴入cacl2溶液中，海藻酸钠是一种线性嵌段共聚物，由于其主链上带有羧基，在与二价阳离子(mg2+除外)接触瞬间，通过古洛糖酸上的na+与二价阳离子交换发生凝胶化形成热不可逆性凝胶。锐孔法所需设备简单、成球粒径分布较窄、不易团聚，工业应用成本较低且不产生有毒有害废弃物。
本发明的有益效果体现在以下方面：(1)通过采用一系列不同孔径的针孔并严格控制溶液的浓度，制得了粒径更小、形状更规则的解磷微生物缓释海藻酸钠微球；(2)利用海藻酸钠和壳聚糖对解磷微生物菌群实现了双重包覆，微球的强度更好不容易破裂，因而缓释效果好、持续时间长；(3)所选用的海藻酸钠和壳聚糖均为生物相容性好、可自然降解的材料，不会对土壤造成污染和破坏，安全性好。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
本发明富集菌种所使用的富集培养基成分(简称nbrip，以重量份数计)为：葡萄糖10.0份，(nh4)2so40.1份，mgso4·7h2o0.25份，kcl0.2份，mgcl2·6h2o0.5份，ca3(po4)21份，蒸馏水1000份，ph＝7.0。驯化培养基的配方与富集培养基基本相同，不同之处在于将ca3(po4)2替换为低品位磷矿粉，且其用量随着驯化次数的增加逐渐加大，从1份逐渐增加到5份。低品位磷矿使用前需磨细过筛，选择粒径在100-200目之间的矿粉备用。
实施例1
(1)筛选：取磷矿矿区土壤20g，与200ml的无菌水混合，机械搅拌30min后，将所得混合物依次利用纱布、滤纸过滤，收集滤液作为供试菌液。
富集：取5ml供试菌液加入到40mlnbrip培养基中，在恒温振荡器(培养温度30℃，转速165rpm)中培养3d。取5ml第一次富集后的菌液按照同样的方法重复富集3次，得到具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群。
驯化：取5ml对数期的上述具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群，加入到40ml驯化培养基中驯化培养3d。取5ml第一次驯化培养的菌液加入驯化培养基中(逐渐提高低品位磷矿含量)，重复驯化3次，得到具有较好适应性的解磷微生物菌群，将其培养至对数期待用。
(2)将20ml质量分数为1％的海藻酸钠溶液加入到5ml处于对数生长期的菌悬液中，搅拌均匀备用。
(3)用三种不同规格(2.5ml、5ml、10ml，对应的针头内径分别为0.25mm、0.33mm、0.41mm)的一次性针筒注射器将(2)中制得的混合菌液以10cm的下落高度、1ml/min的注射速度匀速滴入到50ml质量分数为1％的氯化钙溶液中，固化30min后过滤，用无菌水洗涤3次，接着自然风干，得到三种不同粒径(分别为2mm、2.6mm、3.3mm)的解磷微生物缓释海藻酸钠微球。所成微球成型完好，粒径分布较窄，未发生溶胀。
为充分了解步骤(3)制得的不同粒径微球的性能，分别称量8g该载菌海藻酸钠微球与2g低品位磷矿(磷含量为17.59％)和170mlnbrip培养基混合进行摇床培养，培养温度30℃，转速165rpm。对照组：8g未用微球包覆的同种磷矿矿区微生物菌群和2g低品位磷矿(磷含量为17.59％)加入到170mlnbrip培养基中，在相同条件下培养。
为比较不同微球的缓释解磷效果，每2d对培养液中可溶磷含量进行测量。结果表明：培养8d左右，添加载菌海藻酸钠微球的样品中解磷量开始优于没有经过处理的对照样；粒径较小的载菌海藻酸钠微球具有更好的缓释保活效果。
实施例2
(1)筛选：取农田土壤20g，与200ml无菌水混合，机械搅拌30min后，所得混合物依次利用纱布、滤纸过滤，收集滤液作为供试菌液。
富集：取5ml供试菌液加入到40mlnbrip培养基中，在恒温振荡器(培养温度28℃，转速160rpm)中培养4d。取5ml第一次富集后的菌液按照同样的方法重复富集3次，得到具有解磷效果的农田土壤微生物菌群。
驯化：取5ml对数期的上述具有解磷效果的农田土壤微生物菌群，加入到40ml驯化培养基中驯化培养3d。取5ml第一次驯化培养所得菌液加入到驯化培养基中(逐渐提高低品位磷矿含量)，重复驯化4次，得到具有较好适应性的解磷微生物菌群，将其培养至对数期待用。
(2)将20ml质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液加入到5ml处于对数生长期的解磷微生物菌群(菌悬液)中，搅拌均匀备用。
(3)用2.5ml(针头内径0.25mm)的一次性针筒注射器将(2)中制得的混合菌液以10cm的下滴高度、1ml/min的注射速度匀速滴入到50ml质量分数为1％的氯化钙溶液中，固化30min后过滤，用无菌水洗涤3次，接着自然风干，得到粒径2mm的载菌海藻酸钠微球。
(4)用0.1mol/l的稀醋酸超声溶解0.1g壳聚糖，得到质量分数为1％的壳聚糖溶液。将5g载菌海藻酸钠微球加入到20ml壳聚糖溶液中，缓慢振荡20min使壳聚糖均匀的包覆在微球表面，过滤后自然风干得到壳聚糖二次包覆的解磷微生物缓释海藻酸钠微球。
实施例3
(1)筛选：取磷矿矿区土壤20g，与200ml无菌水混合，机械搅拌30min后，所的混合物依次利用纱布、滤纸过滤，收集滤液作为供试菌液。
富集：取5ml供试菌液加入到40mlnbrip培养基中，在恒温振荡器(培养温度30℃，转速170rpm)中培养3d。取5ml第一次富集后的菌液按照同样的方法重复富集3次，得到具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群。
驯化：取5ml对数期的上述具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群，加入到40ml驯化培养基中驯化培养3d。取5ml第一次驯化培养后的菌液加入驯化培养基中(逐渐提高低品位磷矿浓度)，重复驯化3次，得到具有较好适应性的解磷微生物菌群，将其培养至对数期待用。
(2)分别配制3份质量分数为1％的海藻酸钠溶液，各取20ml海藻酸钠溶液分别加入到3份5ml处于对数生长期的解磷微生物菌群(菌悬液)中，搅拌均匀得到混合菌液。3份混合菌液中分别按照以下方式处理：不加任何致孔剂、加0.05g碳酸氢钠、加0.05g碳酸钙。
(3)用2.5ml(针头内径0.25mm)的注射器将(2)中制得的3种混合菌液以10cm的下滴高度、1ml/min的注射速度匀速滴入到50ml质量分数为1％的氯化钙溶液中，固化30min后过滤，用无菌水洗涤4次，接着自然风干，得到三种不同的载菌海藻酸钠微球。
实验发现：加不加致孔剂及致孔剂种类对微球形貌及粒径没有多大的影响，但会影响微球的缓释速率和有效作用时间。
(4)分别称取5g三种载菌海藻酸钠微球，与0.3g磷矿粉(磷含量为17.59％)和60mlnbrip培养基混合进行摇床培养，培养温度30℃，转速160rpm。
按照前述方法测定溶液中可溶磷含量，结果发现：以碳酸氢钠为致孔剂的微球解磷量比碳酸钙的要高；与未加入致孔剂的微球相比，加入致孔剂后解磷效果均有一定程度的提升，可能是未加致孔剂的微球表面孔径较小，菌群释放较慢，达不到更好的解磷效果。
实施例4
(1)筛选：取磷矿矿区土壤20g，与200ml的无菌水混合，机械搅拌30min后，所的混合物依次利用纱布、滤纸过滤，收集滤液作为供试菌液。
富集：取5ml供试菌液加入到40mlnbrip培养基中，在恒温振荡器(培养温度30℃，转速165rpm)中培养3d。取5ml第一次富集后的菌液按照同样的方法重复富集4次，得到具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群。
驯化：取5ml对数期的上述具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群，加入到40ml驯化培养基中驯化培养3d。取5ml第一次驯化培养后的菌液加入到驯化培养基中(逐渐提高低品位磷矿含量)，重复驯化4次，得到具有较好适应性的解磷微生物菌群，将其培养至对数期待用。
(2)分别配制4份质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液，各取20ml海藻酸钠溶液分别加入到4份5ml处于对数生长期的菌悬液中，搅拌均匀得到混合菌液，编号1、2、3和4。向2号和4号混合菌液中加入0.15g碳酸氢钠，1号和3号中不加任何致孔剂。
(3)用2.5ml(针头内径为0.25mm)的注射器将(2)中制得的4种混合菌液以10cm的下滴高度、1ml/min的注射速度为匀速滴入到50ml质量分数为1％的氯化钙溶液中，固化30min后过滤，用无菌水洗涤4次，接着自然风干，得到4种不同的载菌海藻酸钠微球。
(4)用0.1mol/l的稀醋酸超声溶解0.1g壳聚糖，得到质量分数为1％的壳聚糖溶液。编号1和2的海藻酸钠微球用壳聚糖二次包覆：分别取编号1和2的微球10g，加入到40ml1％的壳聚糖溶液中，缓慢振荡20min使壳聚糖均匀的包覆在微球表面，过滤后自然风干得到经壳聚糖二次包覆的载菌海藻酸钠微球。
(5)分别称取8g上述四种不同的载菌海藻酸钠微球，与0.3g磷矿粉(磷含量17.59％)和60mlnbrip培养基混合进行摇床培养，培养温度30℃，转速165rpm。对照组：将未用微球包覆的同种磷矿矿区微生物菌群与0.3g磷矿粉(磷含量17.59％)和60mlnbrip培养基混合培养。共计培养14d，期间每2d对培养液中可溶磷含量进行测量，结果表明：编号为2的微球(加入碳酸氢钠作为致孔剂并用壳聚糖进行二次包覆)具有最好的缓释效果，对低品位磷矿的解磷效果较好。