一种鱼类雄性不育模型的建立方法与流程

本发明涉及一种鱼类雄性不育模型的建立方法，属于分子生物学领域。

背景技术：

鱼类从外界获取能量，一部分用于生长，一部分用于生殖，在生殖期间，生长缓慢甚至停止，且诸多鱼类的生殖期处于生长期之间。因鱼类全雄性生长较快，个体相对较大，因而成为大家争相养殖的对象，所以近几年，鱼类雄性不育系如何建立是较为热门的研究方向之一。spo11是ⅱ型拓扑异构酶的同源蛋白，参与dna双链断裂复合物（dsbs）的形成，在减数分裂同源重组的发生中发挥重要功能。在大多数有性生殖的生物的减数分裂中，重组扮演着至关重要的角色，它是遗传多样性的重要来源，能够产生单倍体的配子，同时姐妹染色单体交叉互换也增加了配子的多样性。发明人在多年的实验中，发现敲除一个减数分裂相关基因spo11，导致斑马鱼雄性特异性不育，雌性几乎不受影响，而目前还没有人报道基因spo11具有这种功能。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种鱼类雄性不育模型的建立方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，利用crispr/cas9技术对减数分裂相关基因spo11进行敲除，杂合体可育，杂合体自交得到的纯合体群体中的雄性个体不育，从而建立鱼类雄性不育模型。

优选地，建立时，利用pcr技术区分纯合雄性和杂合雄性。

优选地，上述通过crispr/cas9基因编辑技术敲除斑马鱼spo11基因的步骤如下：

（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ensdart00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为seqidno：1，即：tggaaacggtcgacagatgccagg；

（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；

（3）grna的获得：

以grna-plasmid为模板，以grna-f/grna-r为引物，grna-f的序列为seqidno：2：taatacgactcactatagggtggaaacggtcgacagatgccgttttagagctagaaataag；grna-r的核苷酸序列为seqidno：3：agcaccgactcggtgccact,利用kodplus（takara）高保真酶进行pcr扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pmd18-t载体(takara)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒dna，然后质粒dna测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒dna作为下一步转录grna的模板；再利用megascript®t7transcriptionkit(invitrogen^tm)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：

10xreactionbuffer2ｕl；

plasmiddna4ｕl(约1ｕg）；

t7enzyme2ｕl；

10mmol/lntp1ｕl；

depcwater11ｕl；

以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；

（4）体外转录获得cas9mrna：

cas9质粒来自addgene^tm(#63154),使用maxiscript®t7/t3transcriptionkit(invitrogen^tm),合成cas9mrna，体系及反应条件同步骤3；

（5）cas9mrna和grna显微共注射：首先配置显微注射体系如下：

cas9mrna300ng/ｕl；

grna30ng/ｕl；

phenol-red0.2ｕl；

depcwaterupto2ｕl；

将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率；

（6）spo11f1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：

经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交f1代，f1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组dna，以f-spo11/r-spo11为引物，f-spo11：5’-atggcttaccagtttactg-3’;r-spo11:5’-cgtagctctttcagtaactc-3’，利用kodplus高保真酶(takara)进行pcr扩增,pcr产物连接pmd18-t载体(takara)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒dna，然后质粒dna测序比对后筛选获得10条f1代个体突变效率和突变类型；

（7）spo11f2代纯合突变个体的获得：

待spo11f1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄f1代个体各一条进行人工受精，获得spo11f2代纯合突变个体；

（8）雄性不育雄性个体的选取：

spo11f2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。

与现有技术相比，本发明的有益效果：通过本发明的方法，可以特异性获得雄性不育个体，可以通过建立敲除家系，源源不断提供雄性不育个体，操作简单，节省时间。

附图说明

图1为本发明涉及到的相关靶位点、突变类型及靶位点突变基因序列所对应的氨基酸变化，其中a为crispr/cas9技术作用靶位点；b为靶位点序列突变检测（虚线所框为建立家系所选突变类型）；c为靶位点突变基因序列所对应的氨基酸变化（虚线所框为建立家系所选氨基酸突变型）

图2为spo11雌鱼生殖细胞（100倍）显微镜图：其中a为对照性成熟雌鱼性腺组织中的卵细胞，b为spo11性成熟雌鱼性腺组织中的卵细胞；

图3为spo11雄鱼生殖细胞（100倍）显微镜图：其中a为对照性成熟雄与性腺组织中精细胞数量，b为spo11性成熟雄鱼性腺组织中无精细胞。

具体实施方式

现结合具体实施例来说明本发明的技术方案和技术效果，但并不是限制本发明保护范围的依据。

实施例一

鱼类雄性不育模型的建立方法，是利用crispr/cas9技术对减数分裂相关基因spo11进行敲除，spo11的序列号为no:ensdart00000005373.9；杂合体可育，利用pcr技术区分杂合体自交得到的纯合体雄性和杂合体雄性，其中纯合体群体中的雄性个体不育，从而建立鱼类雄性不育模型，建立方法的具体步骤如下：

（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ensdart00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为序列1：tggaaacggtcgacagatgcc[agg]，中括号内为pam序列。

（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性（snp）：

随机选取6条斑马鱼分别提取尾鳍组织的基因组dna，以此为pcr模板，以f-spo11/r-spo11为引物，f-spo11：5’-atggcttaccagtttactg-3’;r-spo11:5’-cgtagctctttcagtaactc-3’，利用kodplus高保真酶(takara)进行pcr扩增,pcr产物连接pmd18-t载体(takara)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒dna，然后质粒dna测序比对后发现所选靶位点中无snp位点。

（3）grna的获得：

以grna-plasmid为模板，以grna-f/grna-r为引物，grna-f的核苷酸序列如序列2：taatacgactcactatagggtggaaacggtcgacagatgccgttttagagctagaaataag；grna-r的核苷酸序列如序列3：agcaccgactcggtgccact,利用kodplus（takara）高保真酶进行pcr扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pmd18-t载体(takara)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒dna，然后质粒dna测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒dna作为下一步转录grna的模板；再利用megascript®t7transcriptionkit(invitrogen^tm)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：

10xreactionbuffer2ｕl；

plasmiddna4ｕl(约1ｕg）；

t7enzyme2ｕl；

10mmol/lntp1ｕl；

depcwater11ｕl；

以上体系37℃反应一个小时后纯化备用。

（4）体外转录获得cas9mrna：

cas9质粒来自addgene^tm(#63154),使用maxiscript®t7/t3transcriptionkit(invitrogen^tm),合成cas9mrna，体系及反应条件同步骤3。

（5）cas9mrna和grna显微共注射：首先配置显微注射体系如下：

cas9mrna300ng/ｕl；

grna30ng/ｕl；

phenol-red0.2ｕl；

depcwaterupto2ｕl；

将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率。方法如下：随机选取8个胚胎提取基因组dna，以f-spo11/r-spo11为引物，f-spo11：5’-atggcttaccagtttactg-3’;r-spo11:5’-cgtagctctttcagtaactc-3’，利用kodplus高保真酶(takara)进行pcr扩增,pcr产物连接pmd18-t载体(takara)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取20个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒dna，然后质粒dna测序比对后获得突变效率。

（6）spo11f1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：

经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交f1代，f1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组dna，以f-spo11/r-spo11为引物，f-spo11：5’-atggcttaccagtttactg-3’;r-spo11:5’-cgtagctctttcagtaactc-3’，利用kodplus高保真酶(takara)进行pcr扩增,pcr产物连接pmd18-t载体(takara)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒dna，然后质粒dna测序比对后筛选获得10条f1代个体突变效率和突变类型。

（7）spo11f2代纯合突变个体的获得：

待spo11f1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄f1代个体各一条进行人工受精，获得spo11f2代纯合突变个体。选择附图1b中标出的突变类型，该突变类型在突变位点附近产生了终止密码，即突变个体中只能产生spo11突变位点之前序列对应的氨基酸。

（8）雄性不育雄性个体的选取：

spo11f2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，如附图2，spo11f2代纯合突变雄性个体精巢中无精子，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。

序列表

<110>湖南文理学院

<120>一种鱼类雄性不育模型的建立方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggaaacggtcgacagatgccagg24

<210>2

<211>47

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaacgaccacaagggggaaacggcgacagagccgagagcagaaaaag47

<210>3

<211>17

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agcaccgaccgggccac17