本发明提供了一种小球藻免疫活性肽的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
小球藻(chlorella)是普生性单细胞绿藻，在自然界分布广泛，既能自养，也能在异养条件下利用有机碳源进行生长繁殖，生物量大，是地球上唯一能在20小时增长4倍的生物。小球藻营养极其丰富，其中粗蛋白含量高达50％以上，必需氨基酸组成基本平衡，同时还含有不饱和脂肪酸、生物活性多糖、核酸、维生素、微量元素、矿物质、叶绿素等，营养价值极高，具有防治消化性溃疡、抗肿瘤、增强免疫力、抗辐射、抗病原微生物、防治贫血、降血脂和抗动脉粥样硬化等多种生物药理活性。因此，小球藻除了被广泛应用于水产养殖外，在不少国家和地区已被先后开发成食品、饮料和医药保健制品等。
目前小球藻保健品的生产均以破壁干粉为原材料。经破壁、浓缩和萃取得到小球藻干粉是一类由核蛋白、核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、多种维生素、氨基酸、多糖、复杂的蛋白质体、酵素、糖蛋白、多种植物荷尔蒙等物质组成的混合物。由于小球藻具有如此有效的保健功能，通常把其干粉混合物又称为小球藻生长因子(chlorellagrowthfactor，cgf)。同时，还有不少研究认为其干粉中还含有具备独特生物学活性及生理功能的“莫名因子”。但是，目前尚无相关研究证明小球藻中发挥高生物活性的主要物质有何种组分构成，不同的组分有何各自的生物学活性和功能。显然，这些研究上的不足严重制约了小球藻医学价值的进一步开发，特别是高值化小球藻保健品的开发。
蛋白质是生命活动的主要承担者，它与生命及各种形式的生命活动紧密相关，生命运动离不开蛋白质。可以认为，小球藻中的核酸、维生素、微量元素、矿物质、叶绿素等物质与其他来源的类似营养物质不会有本质上的差别。小球藻中蛋白质含量高达干重的50％，小球藻具备的保健功能必定与其所含蛋白质和多肽密切关系相关，其活性功能有很大一部分应该来自于其所含的蛋白质及多肽组分。
生物活性肽是一类具有增强免疫力、抗疲劳、辅助降血压、调节免疫力、抗肿瘤、抗菌、降血糖等功能的重要活性物质，通常含3至20个氨基酸残基。这些氨基酸组成的短肽链在亲本蛋白质的序列内是无活性的，但通过胃肠道消化，食品加工或发酵后得到释放。食物蛋白通过水解作用得到的生物活性肽具有安全性高和易被吸收等特点。生物活性肽具备的生物活性与自身肽链的结构特性、氨基酸序列、相对分子质量、氨基酸侧链基团等密切相关。同一来源的食物蛋白经不同的蛋白酶酶解后，由于不同蛋白酶识别位点不同，可得到不同肽链结构、氨基酸序列、分子量大小和侧链基团的多肽。已有非常多的国内外研究证实，同一来源的蛋白经不同的蛋白酶酶解后得到的生物活性肽往往具有不同的生物活性，同时不同来源的蛋白经同一蛋白酶酶解后往往具有相同的生物活性，如：同样的牛奶蛋白经不同微生物酶或胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶解后得到的不同多肽分别具有降血压、抗氧化、增强免疫力等不同的生物活性；而不同食物(牛奶、大豆、鱼、微藻等)来源的蛋白质均经胃蛋白酶酶解后得到的不同分子量区间和氨基酸序列的多肽往往都具有明显的增强免疫力的保健功效。因此，很有必要根据我们所需要获得的不同生物活性来筛选最适的用于酶解特定食物蛋白的蛋白酶种类。
免疫活性肽在自然界的很多食物中都存在，具有活性强、用量少、稳定性强等特点，主要通过促进或抑制机体的某些免疫反应来实现增强免疫力效果，如促进抗体合成、调节细胞因子活性、提高吞噬细胞活性等。目前，研究报道可以从各类动物骨，水产及水产下脚料，大米、小麦、玉米等植物的蛋白酶解液中获得免疫活性肽。此外，刘小娟等从螺旋藻中通过碱性蛋白酶水解获得免疫活性肽。这类多肽经腹腔注射后，能有效降低炎症细胞因子的表达，促进抗炎细胞因子的表达，具有降低免疫活性的作用。对于小球藻的应用，林峰将蛋白核小球藻高压均质后，利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，获得小球藻蛋白活性肽，具备增强免疫力功效。
此外，已有研究证实，制备不同来源蛋白的免疫活性肽所需的蛋白酶不同。瞿瑗等以小鼠脾细胞增殖率为评价指标，比较了胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等酶解制备耗牛骨蛋白免疫活性肽的活性，发现木瓜蛋白酶的效果最好。但是，黄美佳等以同样评价指标，比较了菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等酶解制备蚕蛹蛋白免疫活性肽的活性，发现碱性蛋白酶的效果最好；曾珍同样利用不同蛋白酶，酶解制备猪骨蛋白的免疫活性肽，发现碱性蛋白酶的效果最好，进一步截留不同分子量的多肽，发现分子量＜2kda的肽段组合对应的脾细胞增殖率最高。鉴于此，利用现代生物技术对小球藻这一优质微藻蛋白资源进行高值化开发，通过选用最适蛋白酶，优化酶解液配方及酶解工艺，进一步经多级膜分离技术，可望获得增强免疫力效果好的小球藻免疫活性肽，用于进一步开发免疫活性肽相关的食品、保健和医药产品。
技术实现要素：
本发明提供了一种小球藻免疫活性肽的制备方法，能够获得在体外、细胞和动物体内增强免疫力效果佳的小球藻免疫活性肽，从而更好拓展小球藻在食品、保健和医药领域的应用。
本发明采用如下技术方案：
1.小球藻细胞壁酶解液和特定蛋白酶解液的配制
1)所述的小球藻细胞壁酶解液组份配比为：
小球藻细胞壁酶解液配制后用质量分数为36％的浓盐酸调节ph至3.0～5.0。
2)所述的特定蛋白酶解液组份配比为：
特定蛋白酶解液配置后用质量分数为37％的浓盐酸溶液调节ph至2.0～3.0。
2.小球藻免疫活性肽由以下步骤制备：
1)以蛋白核小球藻粉为原料，按照小球藻粉和naoh稀碱溶液质量比为1:7～10将小球藻粉加入到0.2～0.3mol/lnaoh稀碱溶液中，60℃条件下，浸泡60min，获得预处理小球藻液；
2)将预处理小球藻液，于30～60mpa压力下高压均质2～4次，于5000rpm下离心20min，获得的上清液a暂置于4℃条件下保存；获得的沉淀物加入到小球藻细胞壁酶解液中进行第一次酶解，酶解条件为酶解温度40～60℃、酶解时间3～7h、搅拌转速为150rpm，酶解后于5000rpm下离心20min，获得上清液b；
3)将上清液a和上清液b混合，在常压条件下进行单效节能浓缩，直至浓缩体积比达到1:3～6，浓缩液经真空冷冻干燥即可得小球藻蛋白粉；
4)将小球藻蛋白粉加入特定蛋白酶解液中进行第二次酶解，于40～55℃条件下酶解时间120～300min，之后在90℃水中灭酶处理30min，迅速冷却至室温，4000rpm下离心20min，获得上清液c；
5)上清液c在1mpa入膜压力、40ml/min透析流量条件下通过截留分子量分别为10kda、5kda、3.5kda、1kda的超滤膜，超滤分离获得分子量大小范围分别为＞10kda、5～10kda、3.5～5kda、1～3.5kda和0～1kda的小球藻免疫活性肽液，进一步真空冷冻干燥后获得小球藻免疫活性肽粉。
所述的真空冷冻干燥，其条件为：冷冻控制设定温度-40℃、时间30min、保持时间120min；一次干燥设定第1阶段干燥温度-20℃、干燥时间30min、保持时间120min、真空0.25psi；第2阶段干燥温度-15℃、干燥时间30min、保持时间120min、真空0.25psi；第3阶段干燥温度-5℃、干燥时间30min、保持时间500min、真空0.25psi；第4阶段干燥温度0℃、干燥时间30min、保持时间1500min、真空0.3psi；第5阶段干燥温度5℃、干燥时间30min、保持时间120min、真空0.3psi；第6阶段干燥温度10℃、干燥时间30min、保持时间120min、真空0.3psi；解析干燥设定温度20℃、时间30min、保持时间120min、真空0.3psi。
与现有技术相比，本发明具有如下明显的优势和更好的功能效果：
1、本发明以小球藻蛋白为出发点，通过高压均质联合优化后的纤维素酶/果胶酶细胞壁酶解液，有效提高小球藻蛋白提取率；获得的小球藻蛋白经特定蛋白酶解液、酶解工艺控制和超滤分离，获得具有最佳增强免疫力活性的特定分子量区间(0-1kda)的小球藻多肽产物。
2、本发明得到的小球藻免疫活性肽具备最佳的增强免疫力活性：(1)具有比其他蛋白酶酶解的小球藻酶解产物更好的体外raw264.7细胞增殖和吞噬能力；(2)具有比同一特定蛋白酶解液酶解后的其他分子量大小的多肽产物更好的体外raw264.7细胞增殖和吞噬能力，更佳的促进小鼠迟发型变态反应和小鼠体内淋巴细胞增殖、转化的能力。因而，本发明得到的小球藻免疫活性肽更有利于进一步开发免疫活性肽相关的食品、保健和医药产品。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施作进一步说明，凡依照本发明申请专利范围内所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
实施例1
1.小球藻细胞壁酶解液和特定蛋白酶解液的配制
1)小球藻细胞壁酶解液组份配比为：
用质量分数为36％的浓盐酸调节ph至4.0。
2)所述的特定蛋白酶解液组份配比为：
用质量分数为37％的浓盐酸溶液调节ph至2.5；
2.小球藻免疫活性肽由以下步骤制备：
1)称取500g小球藻粉加入到4.5l0.3mol/lnaoh稀碱溶液中，60℃条件下，浸泡60min，获得预处理小球藻液；
2)步骤1)所述获得的预处理小球藻液，于45mpa压力下高压均质3次，5000rpm下离心20min，获得的上清液a暂置于4℃条件下保存，获得的沉淀物加入到小球藻细胞壁酶解液中，于45℃、搅拌转速为150rpm条件下酶解6h，酶解后于5000rpm下离心20min，获得上清液b；
3)步骤2)所述获得的上清液a和上清液b混合，在常压条件下进行单效节能浓缩，直至浓缩体积比达到1:5，浓缩液经真空冷冻干燥即可得小球藻蛋白粉；
4)将步骤3)获得的小球藻蛋白粉加入特定蛋白酶解液中酶解，于45℃条件下酶解时间240min，之后在90℃水中灭酶处理30min，迅速冷却至室温，4000rpm下离心20min，获得上清液；
5)步骤4)所述的上清液在1mpa入膜压力、40ml/min透析流量条件下通过截留分子量分别为10kda、5kda、3.5kda、1kda的超滤膜，超滤分离获得分子量大小范围分别为＞10kda、5～10kda、3.5～5kda、1～3.5kda和0～1kda的小球藻免疫活性肽液，进一步真空冷冻干燥后获得小球藻免疫活性肽粉。
其中，真空冷冻干燥条件为：冷冻控制设定温度-40℃、时间30min、保持时间120min；一次干燥设定第1阶段温度-20℃、时间30min、保持时间120min、真空0.25psi，第2阶段温度-15℃、时间30min、保持时间120min、真空0.25psi，第3阶段温度-5℃、时间30min、保持时间500min、真空0.25psi，第4阶段温度0℃、时间30min、保持时间1500min、真空0.3psi，第5阶段温度5℃、时间30min、保持时间120min、真空0.3psi，第6阶段温度10℃、时间30min、保持时间120min、真空0.3psi；解析干燥设定温度20℃、时间30min、保持时间120min、真空0.3psi。
3.细胞水平免疫活性的测定
1)对raw264.7细胞增殖活性的测定
取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105个/ml，以100μl/孔接种于96孔培养板中，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养2h，待细胞贴壁，去掉上清液，每孔加入100μl不同分子量区间的小球藻免疫活性肽液，使其终浓度分别为10、20、40、80、160、320μg/ml(含10％胎牛血清的高糖dmem培养基配制)，空白对照组加入不含小球藻免疫活性肽液的培养液，以1μg/mllps作为阳性对照组，每组设置4个复孔。在37℃、5％co2恒温培养箱中继续培养24h后，加入10μl5mg/ml的mtt工作液，继续培养4h，弃去培养基，小心用pbs冲2～3遍后，每孔加入150μldmso溶解液，避光振荡20min，使甲瓒彻底溶解，利用酶标仪测570nm处的od值，按照下面公式计算raw264.7细胞的增殖率。
2)对raw264.7细胞吞噬活性的测定
按照细胞增殖活性测定中的培养方法，设置空白、阳性和不同质量浓度的样品组，每组设置4个复孔，在37℃、5％co2条件下培养24h后弃掉上清液，加入0.075％中性红溶液100ul，于37℃、5％co2培养箱中继续培养1h，弃去中性红溶液，小心用pbs洗2遍后，加入醋酸-乙醇(1:1，v/v)细胞溶解液100ul/孔，室温静置过夜，利用酶标仪，于波长540nm处测定od值，按照下面公式计算raw264.7细胞的吞噬指数。
4.动物体内免疫活性的测定
1)dnfb诱导小鼠迟发型变态反应(dth)实验
实验分组和多肽灌胃：实验前，让小鼠在动物房适应一周，自由饮水进食。参照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》中增强免疫力功能检验的方法进行实验：将60只小鼠随机分成6组，每组10只，分别为：阴性对照组、样品1组(灌胃总小球藻免疫活性肽液，剂量50mg/d)、样品2组(灌胃分子量区间为0～1kda的小球藻免疫活性肽液，剂量50mg/d)、样品3组(灌胃分子量区间为1～3.5kda的小球藻免疫活性肽液，剂量50mg/d)、样品4组(灌胃分子量区间为3.5～5kda的小球藻免疫活性肽液，剂量50mg/d)、样品5组(灌胃分子量区间为5～10kda的小球藻免疫活性肽液，剂量50mg/d)。各组每日按照上述剂量灌胃给药，体积为0.2ml，阴性对照组每日灌胃同体积的单蒸水，连续30d。
dnfb诱导小鼠迟发型变态反应检测：于灌胃的第26d，用电动剃须刀给每只鼠腹部皮肤脱毛，范围大约3cm×3cm，然后用50μl的dnfb溶液均匀涂抹小鼠腹部致敏；致敏5d后，用10μldnfb溶液均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，10μl单蒸水均匀涂抹于小鼠左耳(两面)作为对照。24h后麻醉小鼠，剪下小鼠的左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，分别称量。用左右耳的重量差值来代表迟发型变态反应的程度。
2)有丝分裂原(cona)诱导小鼠体内脾淋巴细胞转化实验
同样按照上述dnfb诱导小鼠迟发型变态反应实验进行小鼠分组和多肽灌胃30d。灌胃结束后无菌取脾，制备脾细胞悬液，即将收集到的脾细胞置于培养皿中，在37℃、5％co2培养箱培养2h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即为脾淋巴细胞，将收集到的脾细胞置于新的培养皿中，调整小鼠脾淋巴细胞悬液细胞密度为3×106个/ml。
将脾细胞悬液分两孔加入24孔板中培养，每孔1ml，一组每孔加入7.5μg/mlcona溶液刺激细胞，另一孔作为对照，每组3个复孔，置于37℃、5％co2培养箱培养中培养72h。于培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi-1640培养液，同时加入mtt(5mg/ml)50μl/孔，继续培养4h。用酶标仪在od570nm处测量各孔的吸光值。用cona孔的吸光值减去不加cona孔的吸光值就代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的吸光值明显高于对照组的吸光值，可以判断该项实验结果为阳性。
体外细胞和体内动物免疫活性检测结果表明：分子量为0-1kda的多肽具备最佳的增强免疫力活性，其具有比其他蛋白酶酶解的小球藻酶解产物以及本发明同一特定蛋白酶解液酶解后的其他分子量区间的多肽更好的体外raw264.7细胞增殖和吞噬能力，由表1可以看出其具有比本发明同一特定蛋白酶解液酶解后的其他分子量大小的多肽产物更佳的小鼠迟发型变态反应能力。
表1：不同小鼠灌胃由本发明得到的不同分子量大小的小球藻免疫活性肽液后，经二硝基氟苯(dnfb)诱导小鼠发生迟发型变态反应程度的比较。
表1
表2：为不同小鼠灌胃由本发明得到的不同分子量大小的小球藻多肽后，体内淋巴细胞增殖和转化能力的比较。
表2
由表2可以看出其具有比本发明同一特定蛋白酶解液酶解后的其他分子量大小的多肽产物更佳的促进小鼠体内淋巴细胞增殖和转化的能力。
本实施例所用纤维素酶、果胶酶和各类蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例2
1.小球藻细胞壁酶解液和特定蛋白酶解液的配制
所用纤维素酶、果胶酶和各类蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。
1)所述的小球藻细胞壁酶解液重量份比为：
用质量分数为36％的浓盐酸调节ph至4.0；
2)所述的特定蛋白酶解液重量份比为：
用质量分数为37％的浓盐酸溶液调节ph至2.0；
2.由以下步骤制备：
1)称取750g小球藻粉加入到4.25l0.3mol/lnaoh稀碱溶液中，60℃条件下，浸泡60min，获得预处理小球藻液；
2)步骤1)所述获得的预处理小球藻液，于55mpa压力下高压均质2次，5000rpm下离心20min，获得的上清液a暂置于4℃条件下保存，获得的沉淀物加入到小球藻细胞壁酶解液中，于50℃、搅拌转速为150rpm条件下酶解5h，酶解后于5000rpm下离心20min，获得上清液b；
3)步骤2)所述获得的上清液a和上清液b混合，在常压条件下进行单效节能浓缩，直至浓缩体积比达到1:4，浓缩液经真空冷冻干燥即可得小球藻蛋白粉；
4)将步骤3)获得的小球藻蛋白粉加入特定蛋白酶解液中酶解，于42℃条件下酶解时间180min，之后在90℃水中灭酶处理30min，迅速冷却至室温，4000rpm下离心20min，获得上清液。
5)步骤4)所述的上清液在1mpa入膜压力、40ml/min透析流量条件下通过截留分子量分别为10kda、5kda、3.5kda的超滤膜，超滤分离获得分子量大小范围分别为＞10kda、5-10kda、3.5-5kda和0-3.5kda的小球藻酶解多肽液，收集不同分子量区间的小球藻酶解多肽液，经真空冷冻干燥即为小球藻多肽粉。体外细胞和体内动物增强免疫力检测方法与结果同实施例1。