本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达o型口蹄疫包涵体工程菌的培养基。
背景技术：
随着生物制药的发展，利用重组dna技术克隆大肠杄菌制得的工程菌，生产生物药物数量越来越多，为生物技术获得生物药物产品的主要途径。
一般情况下，生物药物的产率与大肠杆菌发酵密度密切相关，大肠杆菌的收率直接关系到生物药物的产率。所以在菌体表达蛋白效率相当的情况下，大肠杆菌的发酵密度直接影响到生物药物的效率和成本。特别是在同样的纯化技术条件下，不断有学者进行这方面的研究，如根据化学计量模式(stoichiometricmode1)的方法重新对培养基配方进行设计和优化。在发酵策略方面，为了提高细菌发酵密度，发酵工艺普遍采用补料－分批发酵(fed－batch)的方式提高菌体生长密度和目标产物的表达总量。开发出一种适用于工程菌高密度发酵培养的培养基是非常有必要的。
技术实现要素：
为了解决工程菌的高密度发酵培养问题，本发明提出了一种表达o型口蹄疫包涵体工程菌的培养基。
一种表达o型口蹄疫包涵体工程菌的培养基，包括基础培养基及补料培养基；
所述基础培养基每升包含下列配比组分：酵母提取物2～6g/l，胰蛋白胨1～4g/l，七水硫酸镁0.5～1.5g/l，六水氯化钴0.1～0.3g/l，四水氯化锰0.1～0.2g/l，磷酸二氢钾0.3～0.6g/l，磷酸氢二钾1.2～1.6g/l，泛酸钙0.1～0.4g/l，生物素0.05～0.15g/l，叶酸0.05～0.15g/l；
所述补料培养基每升包含下列配比组分：酵母提取物30～50g/l，胰蛋白胨20～30g/l，磷酸二氢钾4～5g/l，磷酸氢二钾13～16g/l，天冬酰胺4～7g/l，丝氨酸4～7g/l，甘氨酸1.5～2.2g/l,谷氨酸3～4g/l,丙氨酸3～4g/l,精氨酸1.5～2.1g/l,亮氨酸1.5～2.1g/l,赖氨酸1.1～1.8g/l，l-甲硫氨酸0.5～1.2g/l，l-异亮氨酸0.5～1.2g/l，l-缬氨酸0.5～1.2g/l，组氨酸0.2～0.6g/l。
一种表达o型口蹄疫包涵体的工程菌制的备方法，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：所用培养基为权利要求1所述的基础培养基，用冻存菌种于摇瓶培养基中，在摇床中37℃，180～220rpm条件下培养6～10h至对数生长期；
(2)基础培养阶段：取500ml菌液接种到发酵罐的发酵培养基中，温度控制在37℃；通过流加60％葡萄糖控制ph在7.2；溶氧控制在30％，开始阶段搅拌速度为40～60rpm，通气量为4～6l/min；当溶氧水平低于阈值30％时，搅拌速度和溶氧与溶氧30％偶联，发酵阶段转速设为400～600rpm，通气量设为80～100l/min；
(3)补料培养阶段：当a600值达到15时，基础培养基营养快消耗完，开始进入补料培养阶段，根据菌量和生长速度，呈指数增加变化流加权利要求1所述补料培养基，当菌生长到预定的密度时开始加入诱导剂进行诱导，诱导4～6小时后进行收菌。
有益效果：本发明的培养基成分较为明确，不含速效碳源，通过流加60％葡萄糖来缓慢补充碳源，能够降低乙酸的产生，也防止了氨水调节ph导致活菌数下降的发生。本培养基补料培养基通过菌体合成所需氨基酸比例，合理添加不同种类氨基酸，避免了营养过剩的浪费。本培养基能显著提高大肠杆菌工程发酵密度，同时保证高密度下有高的活菌数，不降低每单位菌体蛋白表达量。提高目的蛋白表达总量，提高生产效率，降低生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
下述实施例所用o型口蹄疫包涵体工程菌由中国农业科学院兰州兽医研究所构建表达。菌种形态：在含75μg/ml卡那霉素的lba琼脂平板上生长的菌落应为圆凸起、光滑、边缘整齐的灰白色菌落。菌体培养物结晶紫染色后，呈红色，在显微镜下观察为无芽孢的直杆菌，两端钝圆。生化特性：可发酵乳糖和山梨醇；吲哚和甲基红试验均为阳性，vp试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性。
实施例1
按照本发明配方配制的培养基大规模发酵工艺研究实验
(1)发酵采用fed-batch模式，发酵罐50l(沃力信)，配制20l基础培养基，发酵罐原位灭菌后备用，配制补料培养5l,灭菌备用。
基础培养基按如下配方配制：酵母提取物4g/l,胰蛋白胨2.5g/l,七水硫酸镁1g/l,六水氯化钴0.2g/l,四水氯化锰0.15g/l,磷酸二氢钾0.45g/l,磷酸氢二钾1.45g/l,泛酸钙0.25g/l,生物素0.1g/l,叶酸0.1g/l，培养基用naoh等碱性溶液调至合适ph值。
补料培养基按如下配方配制：酵母提取物40g/l,胰蛋白胨25g/l,磷酸二氢钾4.5g/l,磷酸氢二钾14.5g/l,天冬酰胺5.4g/l,丝氨酸5.4g/l,甘氨酸1.62g/l,谷氨酸3.6g/l,丙氨酸3.6g/l,精氨酸1.89g/l,亮氨酸1.89g/l,赖氨酸1.35g/l,l-甲硫氨酸0.96g/l,l-异亮氨酸0.96g/l,l-缬氨酸0.72g/l,组氨酸0.47g/l。
(2)实验过程：
(1)摇瓶培养：所用培养基为所述的基础培养基，用冻存菌种于摇瓶培养基中，在摇床中37℃200rpm条件下培养8h至对数生长期；
(2)基础培养阶段：取500ml菌液接种到发酵罐的发酵培养基中，温度控制在37℃；通过流加60％葡萄糖控制ph在7.2；溶氧控制在30％，开始阶段搅拌速度为50rpm，通气量为5l/min；当溶氧水平低于阈值30％时，搅拌速度和溶氧与溶氧30％偶联，发酵阶段转速设为500rpm，通气量设为90l/min；
(3)补料培养阶段：当a600值达到15时，基础培养基营养快消耗完，开始进入补料培养阶段，根据菌量和生长速度，呈指数增加变化流加补料培养基，当菌生长到预定的密度时开始加入诱导剂进行诱导，诱导5小时后进行收菌。
(4)在发酵过程中，每隔1h取样，检测菌量。主要采用紫外分光光度计测定600nm波长的a值，同时测量菌的湿重和cfu进行辅助分析。
表达产物的sds-page电泳图谱表明，所有的重组蛋白均以包涵体的形式存在。且经westernblot分析证实，重组蛋白能够与口蹄疫o型阳性血清发生特异性反应。传代稳定性实验表明传代代次限定在9代以内。
实施例2
在变指数流加补料策略培养大肠杆菌工程菌时，采用葡萄糖溶液和氨水两种方式调节ph值实验。
1.发酵参数控制
a罐和b罐都是2l基础培养基+1l补料培养基，流加补料培养基的策略也一样，不同的是，a罐在发酵罐中糖不够时加入一定量的葡萄糖溶液，再通过25％氨水来调控ph；b罐通过60％葡萄糖溶液来调节ph，具体发酵参数如表1、表2所示：
表1a罐发酵控制参数
表2b罐发酵控制参数
说明：1.a罐和b罐都是2l基础培养基+1l补料培养基。
2.a罐和b罐流加补料培养基的策略完全一样。
3.a罐分多次在当发酵罐中糖不够时加入一定量的葡萄糖溶液，再通过25％氨水来调控ph；b罐通过60％葡萄糖溶液来调节ph。
2.检测od600、菌体湿重、活菌数(cfu)、乙酸、血糖，实验数据如表3、表4所示：
表3a罐实验数据
表4b罐实验数据
由实验结果可知，采用60％葡萄糖溶液调控ph值的方法能取得较高生物量的同时保证较高的活菌数。
c罐是2l基础培养基+1l补料培养基，流加补料培养基的策略也同b罐一样，所不同的是c罐的补料培养基中还加入扭口藓提取物2g/l；所述扭口藓提取物的提取方法为：将扭口藓晒干，磨成粉末，加3-8被重量份数的水回流提取3次，合并滤液，蒸干制成。检测od600、菌体湿重、活菌数(cfu)、乙酸、血糖，实验数据如表5所示。
表5c罐实验数据
由表5可以看出，加入扭口藓提取物后，可以显著提高发酵菌体的湿重，活菌数，降低乙酸含量。