本发明属于微生物发酵工艺优化领域，具体涉及一种利用多聚磷酸盐提高环磷酸腺苷发酵性能的工艺方法。
背景技术：
环磷酸腺苷(camp)是人体内广泛存在的一种具有生理活性的物质，作为细胞内的第二信使，对糖代谢、脂肪代谢以及核酸和蛋白质合成等具有重要的调节作用。该物质作为药物和饲料添加剂广泛应用于心血管类疾病的治疗和畜禽产品的生产中，具有十分重要的应用价值。
目前，camp主要通过化学合成的方法进行生产，所涉及的原料和试剂昂贵，生产成本偏高，每公斤camp的成本在6000元人民币左右，严重制约了camp的应用。另外，生产过程中大量使用吡啶等有机溶剂和强酸强碱，而这些物质对人体皮肤和呼吸道的刺激性很强危害很大，易造成环境污染。微生物发酵生产camp的方法具有反应条件温和、成本低、环境友好等优点，具有良好的工业生产应用前景。利用清洁高效的生物制造过程替代化学制造过程，实现制造过程的节能、降耗、减排，可以为国家带来重大经济效益，同时也能带来巨大的社会效益。
然而，微生物合成camp的过程存在两个主要问题，制约着其发酵性能的提高。首先，camp是由atp在腺苷酸环化酶的催化下直接环化形成的，atp不仅是合成产物的原料，还要为细胞生长以及蛋白质、核酸、脂肪等的合成提供能量，因此，camp合成常常受到能量供应不足的限制。此外，由糖类物质从头合成腺苷酸的过程要经过十几步反应，同时消耗十几分子的atp，一方面能量消耗巨大影响atp的供应，另一方面该途径受到多种物质的反馈抑制与阻遏作用，人为调控收效甚微。
微生物中还存在一条合成核苷酸的补救途径，可以利用细胞内现成的前体物质，该途径不仅一定程度上缓解了由反馈抑制造成的代谢通量低下的问题，还能大大降低了atp的耗费。研究表明，环磷酸腺苷前体物质达到一定浓度时会抑制prpp脱氨酶的活性，导致从头合成途径弱化并激活补救途径。因此，通过控制发酵液中前体物质的浓度可以有效利用补救途径进行camp的生产。但是，产物合成过程仍然面临着能量供给不足的问题，有研究表明多聚磷酸盐分子中含有高能磷酸键，在化学合成一些大量需能物质时，可以通过添加多聚磷酸盐替代atp作为能量供体。此外，绝大多数微生物细胞内存在一种多聚磷酸转移酶，该酶可以将多聚磷酸盐中的磷可逆的转移，使amp/ump转化为adp/udp进而转化为atp/utp。传统工艺在初始培养基中添加前体结合中途补碳源的方式进行生产，为合理调节代谢流还添加naf等emp途径抑制剂，能量供应成为主要的限制因素。针对上述问题，提出了利用多聚磷酸盐提高环磷酸腺苷发酵性能的工艺方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用多聚磷酸盐提高环磷酸腺苷发酵性能的工艺方法，环磷酸腺苷产量是传统工艺产量的2.18倍，生产效率提高了119.5％。
为实现以上目的，本发明所采取的技术方案是：
一种利用多聚磷酸盐提高环磷酸腺苷发酵性能的工艺方法，包括以下几个主要控制要点：
1)在分批发酵进行至对数生长期后，向发酵液中添加多聚磷酸盐保证能量供给；
2)添加多聚磷酸盐之后，通过间歇脉冲补加前体物质的工艺，保证前体浓度保持在1～5g/l；
3)发酵初始培养基中前体物质浓度控制在1～5g/l；
4)发酵菌株保藏号为cctccno：m2013431的节杆菌。
要点1)中所述多聚磷酸盐的聚合度为2～10，且为其钠盐或钾盐。
要点1)中所述多聚磷酸盐的添加时间、添加方式和添加量为在发酵20～40h一次性添加到发酵液中，添加量为1～5g/l。
要点2)中所述的环磷酸腺苷前体物质选自腺苷、腺嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、肌苷酸中的一种或几种。
要点2)中所述前体物质的添加时间和方式为在多聚磷酸盐添加后，每隔4～15h补加一次，每次添加量为1～5g/l，添加次数为3～6次。
要点3)中所述初始发酵培养基中含有碳源、氮源、无机盐和前体物质；碳源为葡萄糖或淀粉水解液，初始浓度为40～100g/l；氮源为酵母粉、玉米浆、尿素、蛋白胨、硫酸铵中的一种或几种，初始浓度为5～10g/l；无机盐为磷酸盐、镁盐、钠盐、盐酸盐和硫酸盐中的一种或几种，初始浓度为0.01～10g/l。
所述分批发酵的一般操作条件包括：接种量5～15(v/v)，初始ph调节至7～8，发酵过程中ph控制在5.5～6.5，发酵温度25～35℃，通气量0.6～1.2vvm，搅拌转速400～600r/min，培养时间50～80h，并且在发酵对数生长期后，例如36h开始，一次性添加1～5g/l的多聚磷酸盐，并每隔4～15h补加前体物质1～5g/l，共添加3～6次。
所述分批发酵的流程包括以下步骤：
1)斜面培养：将保存的菌株接种到斜面上，25～35℃培养30～36h；
2)种子培养：从活化的斜面挑取一环菌体接入种子培养基，摇床30℃，200r/min，培养20～24h；
3)分批发酵培养：接种量5～15(v/v)，初始ph调节至7～8，发酵过程中ph控制在5.5～6.5，发酵温度25～35℃，通气量0.6～1.2vvm，搅拌转速400～600r/min，培养时间50～80h，并且在发酵对数生长期后，例如36h开始，一次性添加1～5g/l的多聚磷酸盐，并每隔4～15h补加前体物质1～5g/l，共添加3～6次。
本发明的有益效果：本发明使用多聚磷酸盐提供能量并耦合前体的脉冲式补加策略解除前体抑制的同时保证充足的原料供给，通过该工艺环磷酸腺苷的产量提高为传统工艺的2.18倍，发酵强度及其他指标也得到显著改善。
具体实施方式
下述实例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
发酵培养基(g/l)：葡萄糖80，磷酸氢二钾10，磷酸二氢钾10，硫酸镁3，蛋白胨5，生物素0.03，次黄嘌呤5，尿素10，ph7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min。
将斜面试管上的节杆菌arthrobactersp.cctcc2013431接3环于种子培养基，30℃，摇床220r/min，培养24h，获得指数期的种子液。
将种子液按发酵体积的15％(v/v)的接种量接入含5l发酵液的发酵罐中，发酵温度32℃，通气量1.0vvm，搅拌转速500r/min。
培养到72h发酵结束，hplc检测，产物camp含量为3.32g/l，生产强度为0.046g/(l·h)。
实施例2
发酵培养基组成、各组分浓度及主要发酵条件及步骤与实施例1相同。
在发酵进行36h，一次性添加足量的三聚磷酸钠使发酵液中该物质浓度达到5g/l。
培养到60h发酵结束，hplc检测，产物camp含量为3.74g/l，生产强度为0.062g/(l·h)。
实施例3
发酵培养基组成、各组分浓度及主要发酵条件及步骤与实施例1相同。
在发酵进行36h，每隔8h脉冲式添加一定量次黄嘌呤溶液使发酵液中该物质浓度提高1g/l，添加4次。
培养到72h发酵结束，hplc检测，产物camp含量为2.92g/l，生产强度为0.041g/(l·h)。
实施例4
发酵培养基组成、各组分浓度及主要发酵条件及步骤与实施例1相同。
在发酵进行36h，一次性添加足量的三聚磷酸钠使发酵液中该物质浓度达到5g/l，并从此刻开始每隔8h脉冲式添加次黄嘌呤溶液使发酵液中该物质浓度提高1g/l，添加4次。
培养到72h发酵结束，hplc检测，产物camp含量为7.24g/l，生产强度为0.101g/(l·h)。
实施例5
与实施例4条件相当，培养到72h发酵结束，hplc检测，产物camp含量为7.35g/l，生产强度为0.102g/(l·h)。(产量、生产强度也相当)。