用于鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的引物对及RT-PCR检测方法与流程

本发明涉及动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一种用于鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的引物对及rt-pcr检测方法。

背景技术：

猪瘟病毒（classicalswinefevervirus,csfv）是猪的一种急性、高度接触性的传染性病毒。它引起的猪瘟（classicalswinefever,csf），临床上主要表现为稽留高热、皮肤和粘膜有大量出血点以及白细胞减少症等。csf被世界动物卫生组织（oie）和我国农业部列为一类动物传染病。各年龄段、各类型猪均易感。因其流行广，发病率及死亡率高，给养猪业造成了巨大的经济损失。我国生产的csf兔化弱毒疫苗在猪瘟的防控方面起着重要的作用，使csf的发病率明显降低，但近年来猪瘟发病趋势出现了明显的变化，由csf野毒感染直接诱发致死较少，而出现csf隐性带毒现象增多，野毒感染和疫苗毒接种的区分变得非常困难但又十分必要。

csfv基因组是单股正链有囊膜的rna病毒，长约12.3kb，由5’端非编码区、一个大的开放阅读框（orf）和3’端非编码区构成。orf编码一个大的多聚蛋白，并最终裂解形成病毒的4种结构蛋白（c、erns、e1和e2）和8种非结构蛋白（npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b）。现有的csfv强弱毒鉴别诊断方法包括限制性片段长度多态性聚合酶链反应（pcr-rflp），但该技术无法确诊早期感染，且操作步骤较为复杂，临床应用难以推广。其他的包括荧光定量rt-pcr检测方法，但该方法成本较高，且需要特殊的配套仪器，目前仅应用于实验室检测。因此，建立一种对csfv临床样本快速、简便的检测技术，以区分csf野毒和疫苗毒感染，为规模化猪场csf净化奠定基础。

公开号为cn104988243a的专利文献公开了一种荧光定量rt-pcr实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，包括以下步骤：1)设计特异性引物3-utr；2)对采集的血样进行编号，提取血样总rna；3)以提取的总rna为模板，用taraka试剂盒进行反转录得cdna；4)以步骤3)反转录所得cdna为模板，加入特异性引物，用taraka的sybrgreen试剂盒进行荧光定量pcr扩增，记录实时荧光定量pcr扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，根据记录结果鉴别猪瘟病毒株；其中，特异性引物的终浓度为0.4μmol/l，pcr反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40循环。该方法为猪瘟疫病控制及净化提供了可靠技术保障，但是，该方法操作步骤复杂，成本较高，需要特殊的配套仪器，仅应用于实验室检测，不适合猪场大规模检测使用。

公告号为cn103320535b的专利公开了一种鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的方法。该发明在两者共同的保守区域设计了用于鉴别猪瘟野毒株与疫苗弱毒株的专用引物，其特异性好，能够很好的扩增出野毒株与疫苗弱毒株，结合rt-pcr与hrm技术，能够明显的区分野毒株与疫苗毒株。该发明方法是一种简便、快捷、实用的鉴别猪瘟病毒野毒株与疫苗株的新型技术。但是，该发明采用p1、p2两组引物，荧光饱和染料扩增，扩增过程步骤复杂，时间长，不适合猪场大规模检测使用，检测精度和准确性低。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种用于鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的引物对及rt-pcr检测方法，选取较为保守的ns5b和e2基因区域，建立一种可鉴别疫苗毒株和流行毒株的方法，不进行测序、酶切就可以直观区分两种毒株，为临床快速鉴别诊断猪瘟提供依据，为规模化猪场csf净化奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种用于鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的引物对，所述引物对包括针对ns5b基因的特异性引物1对，针对e2基因特异性引物2对，各个所述引物的序列如下所示：

ns5b上游5’-3’：ccttaactatgcacatgtcag

ns5b下游5’-3’：tcagttgacaacaccaataag

e2-1上游5’-3’：cggctgtcctgtaaggaag

e2-1下游5’-3’：cacttgcattgttttacttgcc

e2-2上游5’-3’：gcaaatatgtgtgtgttagaccaga

e2-2下游5’-3：gtgtgggtaattaagttccctatca。

优选的，一种用于鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的rt-pcr检测方法，包含以下步骤：

s1：pcr引物的设计与合成；

s2：pcr模板的制备；

s3：pcr扩增结果及分析。

优选的，所述步骤s1合成的引物ns5b、e2-1、e2-2如权利要求1所述。

优选的，所述步骤s2中，pcr模板的制备方法为：待pk-15细胞长到单层约90%密度时，将培养基弃去并用pbs溶液洗涤，将病毒液分别加入不同的t25培养瓶中，并补充无血清的dmem培养，将培养瓶放入培养箱中继续培养，然后将培养瓶放入冰箱，反复冻融后将病毒液取出，离心，取上清液保存备用。

优选的，所述步骤s2中，临床上疑似csfv感染的组织样品为肺、脾、肾和淋巴结中的一种或几种混合或血清样品，匀浆后，离心，取上清保存备用。

优选的，所述步骤s3中，pcr扩增方法为：pcr反应体系为20μl：10×hifibufferi：2μl；2.5mmdntps：2μl；上游引物：1μl终浓度为0.1μm；下游引物1μl终浓度为0.1μm；hifidnapolymerase：0.5μl；cdna：1μl；ddh2o:12.5μl；反应条件为：95℃预变性，再以35个循环进行pcr扩增，扩增条件为95℃变性，不同引物对进行退火，72℃延伸45-90秒，最后再72℃延伸10分钟。

优选的，所述步骤s3中，pcr扩增完成后，用琼脂糖凝胶电泳确定，鉴定为阳性的pcr产物进行回收纯化，然后克隆到pmd18-t载体，并转化到dh5α平板，挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。

本发明的有益效果是：

csfv基因组是单股正链有囊膜的rna病毒，长约12.3kb，由5’端非编码区、一个大的开放阅读框（orf）和3’端非编码区构成。orf编码一个大的多聚蛋白，并最终裂解形成病毒的4种结构蛋白（c、erns、e1和e2）和8种非结构蛋白（npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b）。

本发明参考目前国内流行的csfv野毒株以及普遍使用的疫苗c株，选取较为保守的ns5b和e2基因区域，建立一种可鉴别疫苗毒株和流行毒株的方法，不进行测序、酶切就可以直观区分两种毒株。本发明中的3对csfv特异性pcr引物相互结合，可以通过pcr扩增直观区分csfv野毒和疫苗两类毒株，为临床快速鉴别诊断猪瘟提供依据，为规模化猪场csf净化奠定基础。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

图1是本发明实施例1的ns5b引物对pcr扩增结果。

图2是本发明实施例1的e2-2引物对pcr扩增结果。

图3是本发明实施例1的e2-1引物对pcr扩增结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-3，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

（1）pcr引物的设计与合成

根据本实验室近年来监测的以及报道流行的csfv野毒株基因序列，结合临床上普遍使用的csfv弱毒疫苗（c株）的基因序列，设计分别针对ns5b基因的特异性引物1对，针对e2基因特异性引物2对（表1）。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1本发明中的csfv特异性pcr引物

（2）pcr模板的制备

待pk-15细胞长到单层约90%密度时，将培养基弃去并用pbs溶液洗涤2次，按照moi:0.5的量将csfvshimen（accessionno.af092448）和jszl（accessionno.kt119352）株病毒液分别加入不同的t25培养瓶中，并补充无血清的dmem培养基至5ml，将培养瓶放入37℃5%co2培养箱中继续培养4-5天，然后将培养瓶放入-80℃冰箱，反复冻融三次后将病毒液取出，以9000g离心5min，取上清-80℃保存备用。商品化csfv疫苗毒c株（accessionno.af091507）分别购自哈尔滨维科生物技术开发公司、吉林特研生物技术有限责任公司、齐鲁动物保健品有限公司和广东永顺生物制药股份有限公司。按照每瓶（20头份）加入无血清dmem2ml，充分混匀后，以9000g离心5min，取上清-80℃保存备用。临床上疑似csfv感染的组织样品（肺、脾、肾和淋巴结等）或血清样品，匀浆后，以12000g离心5min，取上清-80℃保存备用。

病毒rna提取按照北京全式金生物技术有限公司easypure®viraldna/rnakit试剂盒说明书，取200μl已离心的病毒液上清进行总rna提取。按照北京全式金生物技术有限公司transscript®-unione-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书进行反转录，总cdna样品保存至-80℃备用。

（3）pcr扩增结果及分析

按照北京全式金生物技术公司transtaqdnapolymerasehighfidelity(hifi)试剂盒说明书进行pcr。pcr反应体系为20μl：10×hifibufferi：2μl；2.5mmdntps：2μl；上游引物：1μl（终浓度为0.1μm）；下游引物1μl（终浓度为0.1μm）；hifidnapolymerase：0.5μl；cdna：1μl；ddh2o:12.5μl。反应条件为：95℃预变性5分钟，再以35个循环进行pcr扩增，扩增条件为95℃变性30秒，不同引物对按表1所示进行退火30秒，72℃延伸45-90秒，最后再72℃延伸10分钟。

pcr扩增完成后，取10μl产物用1%琼脂糖凝胶电泳确定，鉴定为阳性的pcr产物用omegagelextractionkit试剂盒纯化回收，然后克隆到pmd18-t载体，并转化到dh5α平板，挑取阳性克隆，并进行测序鉴定。

参见说明书附图1-3，其中，图1为ns5b引物对pcr扩增结果。

泳道1-3：csfvshimen株、阴性对照和csfvjszl株；4-9：临床上疑似csfv感染组织样品；10：dna2000marker；11-14：不同厂家csfvc株疫苗。阴性对照组中添加的为纯水。

如图1所示，ns5b引物对可以对csfv野毒株、临床疑似csfv感染的组织样品进行有效扩增，且通过csfv基因测序得到进一步证实，而对疫苗株的扩增结果均为阴性。

图2为e2-2引物对pcr扩增结果，泳道1-2：csfvshimen株、jszl株；3-6：不同厂家csfvc株疫苗；7：阴性对照；8-9,11-14：临床上疑似csfv感染组织样品；10：dna2000marker。

如图2所示，e2-2引物对可以对csfv野毒株和疫苗株进行有效扩增，对临床疑似csfv感染的组织样品只能部分有效扩增。这些结果通过csfv基因测序得到进一步证实。

图3为e2-1引物对pcr扩增结果，泳道1-8：临床上疑似csfv感染组织样品；9-10,12-13：不同厂家csfvc株疫苗；11：dna2000marker；14-15：csfvshimen和jszl株；16：阴性对照。

如图3所示，e2-1引物对可以对所有csfv野毒株和疫苗株进行有效扩增，对临床疑似csfv感染的组织样品也可以有效扩增。这些结果通过csfv基因测序得到进一步证实。

ns5b引物对扩增序列结果：

shimen：

ccttaactatgcacatgtcagaagtacccgtaatctgtgccgacggggaagtatacataaggaaagggcaaagaggcagcggacaacctgacacaagcgcaggcaatagcatgctaaatgtgttaacaatggtttacgccttctgcgaggccacgggagtaccctacaagagctttgacagggtggcaaaaattcatgtgtgcggggatgatggtctcctgatcacagaaagagctctcggtgagaaattcgcgagcaagggagtccagatcctatatgaagctgggaagccccagaagatcactgaaggggacaaaatgaaagtggcctaccaatttgatgatattgagttttgctcccatacaccaatacaagtaaggtggtcagacaacacttctagttacatgccggggagaaatacaaccacaatcctagctaaaatggccacaaggttagattccagtggtgagaggggtaccatagcatgtgagaaagcagtagcattcagcttcctgctgatgtactcctggaacccactaattagaaggatctgcttattggtgttgtcaactga

jszl：

ccttaactatgcacatgtcagaagtacccgtaattagtgccgacggggaggtgtacgtaaggaaggggcagagaggcagtggacaacctgatacgagcgcaggcaacagtatgttgaatgtgttaacaatggtttatgccttctgtgaggccacgggagtgccctataagagcttcgatagagtggcaaagatccacgtctgcggggatgatggtttcttgatcactgaaagggctcttggtgaaaaatttgcgagcaaaggagtccagatcctatatgaagctggtaagccccaaaaaattacagaaggggataagatgaaagtggcctatcagtttgacgacatcgagttctgctcccatacgccagtgcaagtaagatggtcagacaatacttctagttacatgcctgggaggaatacgactacaatcctggcaaaaatggctacaaggttagattccagtggtgagaggggtactatagcatatgagaaggcagtggcgttcagcttcttattgatgtactcctggaacccactgattagaaggatatgcttattggtgttgtcaactga

c株疫苗：

ccttaactatgcacatgtcagaagtacccgtgattagtgctgatggggaagtatacataaggaaagggcaaagaggcagtggacaacctgacacaagtgcgggcaacagcatgctaaatgtcttaacaatggtttacgccttctgcgaggccacaggagtaccctacaagagctttgacagggtggcaaaaattcatgtgtgcggggatgatggcttcctgatcacagaaagagctctcggtgagaaatttgcaagtaagggagtccagatcctttatgaagctgggaagccccagaagatcactgaaggggacaaaatgaaagtggcctaccaatttgatgatattgagttttgctcccatacaccaatacaagtaagatggtcagataacacttctagttacatgccggggagaaatacaaccacaatcctggcaaagatggccacgaggttagattccagcggtgaaaggggtaccatagcatatgagaaagcagtagcatttagcttcctgctgatgtattcctggaacccactaattagaaggatctgcttattggtgttgtcaactga

e2-2引物对扩增序列结果：

shimen:

gcaaatatgtgtgtgttagaccagactggtggccatatgaaaccaaggtggctttgttatttgaagaggcaggacaggtcgtaaagttagccttacgggcactgagggatttaaccagggtctggaatagcgcatcaaccacggcattcctcatctgcttgataaaagtattaagaggacagatcgtgcaaggtgtgatctggctgctactagtaactggggcacaaggccggctagcctgcaaggaagattacaggtacgcaatatcatcaaccaatgagatagggctactcggggccggaggtctcactaccacctggaaagaatacagccacgatttgcaactgaatgacgggaccgttaaggccatttgcgtggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtcagtaggaggtatttggcatcattgcataagggggctttactcacttccgtgacattcgagctcctgttcgacgggaccaacccatcaaccgaagaaatgggagatgacttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgtcaagggaaagtacaatacaaccttgttgaacggtagcgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgttatagagtgcacagcagtgagcccaacaactctgagaacagaagtggtaaagaccttcaggagagagaagccttttccacacagaatggattgtgtgaccaccacagtggaaaatgaagatctattctactgtaagttggggggcaactggacatgtgtgaaaggtgaaccagtggtctacacaggggggcaagtaaaacaatgcaaatggtgtggcttcgacttcaacgagcctgacggactcccacactaccccataggtaagtgcattttggcaaatgagacaggttacaggatagtagattcaacggactgtaacagagatggcgttgtaatcagcgcagaggggagtcatgagtgcttggtcggcaacacaactgtcaaggtgcatgcatcagatgaaagactgggccctatgccatgcagacctaaagagattgtctctagtgcaggacctgtaaggaaaacttcctgtacattcaa

ctacgcaaaaaccttgaagaacaagtactatgagcccagggacagctacttccagcaatatatgctcaagggcgagtatcagtactggtttgacctggacgtgacagaccgccactcagattacttcgcagaatttgttgtcttggtggtggtagcactgttaggaggaagatatgtcctgtggctgatagtgacctacatagttctaacagaacaactcgccgctggtctaccattgggtcagggtgaggtagtgttgatagggaacttaattacccacac

jszl：

gcaaatatgtgtgtgttagaccagawttggtggccgtatgaaactaaggtggccctactgtttgaagaggcgggacaggtcgtaaagttagctctacgggcactgagggatttaactagagtctggaacagtgcatcaactactgcattcctcatctgcttgataaaaatattaagagggcaggttgtgcaaggtataatatggctgctgctagtgaccggggcacaagggcggctgtcctgtaaggaagactacaggtatgcgatatcatcaaccaacgagatagggccgctaggggctgaaggtctcaccaccacctggagagagtatagtcatggtttgcagctggatgacgggactgtcagggccatttgcactgcagggtcctttaaagtaatagcacttaacgtggtcagcaggaggtacctggcatcattacacaagagggctctgcccacctcagtaacatttgaactcctatttgatgggactagtccagcgattgaggagatgggagatgattttggatttgggctgtgcccttttgacacaaccccagtggtaaaagggaagtacaataccactctattaaacggtagtgctttctacctagtctgcccaataggatggacgggtgtcatagagtgcacagcagtaagccctacaaccttgagaacagaagtggtgaagaccttcaagagagagaagcctttcccacacagagtggattgcgtgaccactatagtagagaaagaagacctgttctactgcaagtgggggggtaattggacgtgtgtgaaaggcaacccggtgacctacatgggggggcaagtaaaacaatgcaagtggtgtggttttgacttcaaggggcccgatgggctcccacactaccccataggcaagtgcatcctagcaaatgagacgggttacagggtagtggattccacagactgcaatagagatggcgttgttatcagcactgaaggagaacacgagtgcttgattggcaacaccaccgtcaaggtgcacgccttggatgggagactgggccctatgccatgcagacccaaagaaatcgtctctagtgcgggacctgtaaggaaaacttcctgtactttcaattacacaaagacactaaaaaacaagtactatgagcccagggacagctattttcagcaatatatgcttaagggcgagtaccaatactggtttgacctggacgcgactgaccaccacacagactactttgccgaatttgttgtcttggtggtagtggcactattgggtgggaggtacgtcctgtggctaatagtgacctatatagttctaacagagcaacttgctgccggttcacagctgggccaaggcgaagtggtacwtgatagggaacttaattacccacac

c株疫苗：

gcaaatatgtgtgtgttagaccagactggtggccatatgaaaccgaggtggctctgttatttgaagaggcaggacaggtcgtaaagttagtcttacgggcgctgagggatttgactagggtctggaatagcgcatcaaccattgcattcctcatctgcttgataaaagtattaaggggacagatcgtgcaaggtgtggtatggctgttactagtaactggggcacaaggccggctagcctgcaaggaagattacaggtacgcaatatcgtcaaccaatgagatagggctactcggggcgggaggtctcactaccacctggaaagaatacagccaggatttgcaactgaatgacgggaccgttaaggccatttgcgtggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtcagtaggaggtatttggcatcattgcataagggggctttactcacttccgtgacattcgagctcctgttcgacgggaccaacccattaaccgaagaaatgggagatgacttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgtcaagggaaagtacaatacaaccttgttgaacggtagtgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgttatagaatgcacagcagtgagcccaacaactctgagaacagaagtggtaaagaccttcaggagagacaagccctttccgcacagaatgggttgtgtgaccaccacagtggaaaatgaagatttattctattgtaagttggggggcaactggacatgtgtgaaaggcgagccagtggtctacacagggggggtagtaaaacaatgtagatggtgtggcttcgacttcgatgggcctgacggactcccgcattaccccataggtaagtgcattttggcaaatgagacaggttacagaatagtagattcaacggactgtaacagagatggcgttgtaatccgcacagaggggagtcatgagtgcttgatcggtaacacgactgtcaaggtgcatgcattagatgaaagactgggccctatgccatgcagacctaaagagattgtctctagtgctggtcctgttatgaaaacctcctgtacattcaa

ctacacaaaaactttgaagaacaggtactacgagcccagggacagctacttccagcaatatatgcttaagggtgagtatcagtactggtttgacctggatgcgactgaccgccactcagattacttcgcagaatttgttgtcttggtggtggtagcactgttaggaggaagatatgtcctgtggctgatagtgacctacgtagttctaacagaacaactcgccgctggtttaccattgggccagggtgaggtagtgttgatagggaacttaattacccacac

e2-1引物对扩增序列结果：

shimen：

cggctgtcctgtaaggaagattacaggtacgcaatatcatcaaccaatgagatagggctactcggggccggaggtctcactaccacctggaaagaatacagccacgatttgcaactgaatgacgggaccgttaaggccatttgcgtggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtcagtaggaggtatttggcatcattgcataagggggctttactcacttccgtgacattcgagctcctgttcgacgggaccaacccatcaaccgaagaaatgggagatgacttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgtcaagggaaagtacaatacaaccttgttgaacggtagcgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgttatagagtgcacagcagtgagcccaacaactctgagaacagaagtggtaaagaccttcaggagagagaagccttttccacacagaatggattgtgtgaccaccacagtggaaaatgaagatctattctactgtaagttggggggcaactggacatgtgtgaaaggtgaaccagtggtctacacaggggggcaagtaaaacaatgcaagtg

jszl：

cggctgtcctgtaaggaagactacaggtatgcgatatcatcaaccaacgagatagggccgctaggggctgaaggtctcaccaccacctggagagagtatagtcatggtttgcagctggatgacgggactgtcagggccatttgcactgcagggtcctttaaagtaatagcacttaacgtggtcagcaggaggtacctggcatcattacacaagagggctctgcccacctcagtaacatttgaactcctatttgatgggactagtccagcgattgaggagatgggagatgattttggatttgggctgtgcccttttgacacaaccccagtggtaaaagggaagtacaataccactctattaaacggtagtgctttctacctagtctgcccaataggatggacgggtgtcatagagtgcacagcagtaagccctacaaccttgagaacagaagtggtgaagaccttcaagagagagaagcctttcccacacagagtggattgcgtgaccactatagtagagaaagaagacctgttctactgcaagtgggggggtaattggacgtgtgtgaaaggcaacccggtgacctacatgggggggcaagtaaaacaatgcaagtg

c株疫苗：

cggctgtcctgtaaggaagattacaggtacgcaatatcgtcaaccaatgagatagggctactcggggcgggaggtctcactaccacctggaaagaatacagccaggatttgcaactgaatgacgggaccgttaaggccatttgcgtggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtcagtaggaggtatttggcatcattgcataagggggctttactcacttccgtgacattcgagctcctgttcgacgggaccaacccattaaccgaagaaatgggagatgacttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgtcaagggaaagtacaatacaaccttgttgaacggtagtgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgttatagaatgcacagcagtgagcccaacaactctgagaacagaagtggtaaagaccttcaggagagacaagccctttccgcacagaatgggttgtgtgaccaccacagtggaaaatgaagatttattctattgtaagttggggggcaactggacatgtgtgaaaggcgagccagtggtctacacaggggggcaagtaaaacaatgcaagtg

综合以上结果表明，本发明中的3对csfv特异性pcr引物相互结合，可以通过pcr扩增直观区分csfv野毒和疫苗两类毒株，为临床快速鉴别诊断猪瘟提供依据，为规模化猪场csf净化奠定基础。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。