一种多重RT-PCR检测试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种多重pcr检测试剂盒，特别涉及一种同时检测诺如病毒gi、gii型和大肠杆菌噬菌体ms2的多重pcr检测试剂盒及方法。

(二)

背景技术：

诺如病毒(norovirus,nov)属于杯状病毒科(caliciviruses)的诺瓦克病毒属。1972年由kapikian等学者首次用电镜的方法发现。该病毒基因组分子大小为7.3-7.6kb，通常根据nv病毒rna聚合酶编码区核苷酸或外壳蛋白区氨基酸序列的差异，可将nv分为5个不同的基因型(ggi、ggii、ggiii、ggiv和ggv)，其中ggi和ggii为常见的致病型。诺如病毒对外界的抵抗力较强，通常能引起自限性、轻中度的胃肠道感染症，其特点是高发病率、低致病剂量。诺如病毒目前被认为是世界范围内流行性、非细菌胃肠炎暴发的主要原因。

大肠杆菌噬菌体ms2属于非细胞原生物的细菌病毒，专性感染和寄生于相应的活细菌体内，具有作为水体中肠道病毒指示物的基本条件；对人没有致病性，且在有肠道病毒污染的水环境中普遍存在；可实验室培养，数量高于肠道病毒，在形态特征、理化特性、对自然环境条件和消毒剂的抗性等方面与肠道病毒类似；检测操作具有简便快速、安全可靠、受环境影响小和设备简单等优点。基于以上几点考虑，在目前的病毒检测中通常加入ms2作为食品以及水体中病毒样本的提取及pcr检测的质量控制标品。

近年来，随着当前国际贸易、国际旅游业的快速增长，食品市场的全球化引发了食品的高风险性，并使食源性疾病有在全球蔓延的趋势。全球食源性疾病和恶性食品污染事件频频的发生，使食品安全已成为一个严重并不断扩大的世界卫生问题，并日益成为全球关注的热点。作为食品安全的头号问题，食源性疾病的发生中多数是由诺如病毒引起的。2006年11月，日本、新加坡、意大利等地相继发生了与食品有关的诺如病毒集体感染事件，特别是日本，不到两个月累计发生了35.76万人感染了诺如病毒。中国自1995年报告首例诺如病毒感染病例后，国内许多地区多次暴发诺如病毒感染性急性胃肠炎(疫情主要集中在广东和浙江省)。诺如病毒已日益成为重要的公共卫生问题。

长期以来，由于病毒检测技术落后，且病毒个体较小(直径约为50-300nm)，难于直接检测等原因，阻碍了病毒检测的发展。近年来，随着分子生物学技术的进步，常规核酸pcr和半数组织细胞感染量(tcid50)成为了病毒的主要方法。随着新技术的发展，相对于常规核酸pcr而言，新出现的多重荧光定量pcr技术使得病毒的整个检测过程具有了实时检测、定量准确、高效、高灵敏度和重复性好等优点。目前，由于诺如病毒还不能够完全在实验室条件下进行培养，荧光定量pcr技术已成为诺如病毒的主要检测方法。发达国家应用该技术对诺如病毒检测研究已从单纯的检测诺如病毒gi/gii型到同时检测两种或者三种不同类型的病毒。而我国对诺如病毒检测技术研究起步较晚，多重荧光定量pcr技术的引入，将进一步增强诺如病毒检测的范围、高效性和灵敏度。

综上所述，尽管目前国际上关于不同诺如病毒检测的方法已有不少报道，但由于病毒往往附着在食品、水以及其他物品的表面或者内部，在具体操作过程中往往需要加入质控样品ms2，才能保证每次操作的准确性和重复性。因此，我们针对混合病毒样本(目的病毒和质控病毒)中的核酸扩增进行了优化，提高了检测效率和准确性，对控制诺如病毒感染，保障人民生命健康具有重要的理论和实践意义。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是克服现有检测方法的不足，提供一种高效、快捷、同时检测诺如病毒gi、gii型和大肠杆菌噬菌体ms2的多重rt-pcr检测试剂盒及方法，为环境检测、商品检验检疫、食品卫生等领域中大通量的样品的诺如病毒检测提供技术支持。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种多重rt-pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)rna提取试剂，以大肠杆菌噬菌体ms2为样品rna提取质控，即向待检测样品中加入大肠杆菌噬菌体ms2(优选加入量1.3×10⁵pfu/ml≈1.27×10⁸copies/ml)，提取含ms2和待测样品的混合病毒rna作为pcr反应模板；

(2)pcr反应体系：含诺如病毒gi型(简称novgi)、诺如病毒gii型(简称novgii)和大肠杆菌噬菌体ms2(简称ms2)各自的正向引物、反向引物和特异性探针；

本发明以诺如病毒gi型、诺如病毒gii型和大肠杆菌噬菌体ms2的rna多聚酶高保守区为靶序列设计诺如病毒gi型(seqidno.10)、诺如病毒gii型(seqidno.11)和大肠杆菌噬菌体ms2(seqidno.12)正向、反向引物和特异性探针，其碱基序列分别为：

诺如病毒gi型引物、特异性探针：

正向引物gi-f：5’-ggcagatgatgagcgtgagg-3’(seqidno.1)；

反向引物gi-r：5’-agaaaccccatccagacccaaact-3’(seqidno.2)；

特异性探针probe-p:5-hex-cactttatggagcagagtgac-bhq-3’(seqidno.3)；

诺如病毒gii型引物、特异性探针：

正向引物gii-f：5’-ctagaaacgctccaggtgaaat-3’(seqidno.4)；

反向引物gii-r：5’-tctggccaaatgggaaaggtaa-3’(seqidno.5)；

特异性探针probe-p:5’-fam-cccttgggccctgatttga-tamrar-3’(seqidno.6)；

大肠杆菌噬菌体ms2引物和特异性探针：

正向引物ms-f：5’-attccgactgcgagcttattgtt-3’(seqidno.7)；

反向引物ms-r：5’-ggagtttgctgcgattgctgagg-3’(seqidno.8)；

特异性探针probe-p:5’-rox-aatcgggtttccatcttttag-bhq2-3’(seqidno.9)；

(3)pcr质控反应体系：以含seqidno.10所示核苷酸序列的质粒pcda-nov-gi(2.5×10⁸copies/ml,7545bp)、含seqidno.11所示核苷酸序列的质粒pcda-nov-gii(1.5×10⁸copies/ml,7521bp)及含seqidno.12所示核苷酸序列的质粒pcda-ms2(1.3×10⁸copies/ml,6556bp)的混合质粒作为pcr质控反应模板：

诺如病毒gi型引物对应的序列：norovirusgi(ncbiaccessionnumbersmg599789.1)(seqidno.10)：

5’-ggcagatgatgagcgtgaggtggattacaatgagaagatcagttttgaggcgccccccactttatggagcagagtgacaaagtttgggtctggatggggtttct-3’(3191bp-3294bp)；

诺如病毒gii型引物对应的序列：norovirusgii(ncbiaccessionnumbersmf140656.1)(seqidno.11)：

5’-ctagaaacgctccaggtgaaatactatggagcgcgcccttgggccctgatttgaatccttacctttcccatttggccaga-3’(5271bp-5350bp)；

大肠杆菌噬菌体ms2引物对应的序列：enterobacteriaphagems2(atcc15597-b1)(genbankaccessionnumbersnc001417)(seqidno.12)：

5’-attccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagcaaactcc-3’(1630bp-1715bp)。

进一步，所述的多重rt-pcr检测试剂盒，pcr反应体系还包括反应缓冲液，逆转录酶，dna聚合酶和depc水。

再进一步，本发明所述pcr反应体系组成为：2×buffer12.5μl，逆转录酶和dna聚合酶各0.5μl，20μmol/l正向引物各0.1μl，20μmol/l反向引物各0.1μl，20μmol/l特异性探针各0.05μl，模板5μl，depc水补齐至25μl；所述模板为含有待测样品和ms2混合病毒rna。所述pcr质控反应体系组成同pcr反应体系，不同在于质控体系以含目的基因的混合质粒pcda-nov-gi、pcda-nov-gii及pcda-ms2为模板。

本发明还提供一种所述多重rt-pcr检测试剂盒在同时检测诺如病毒gi型、诺如病毒gii型和大肠杆菌噬菌体ms2中的应用，所述应用方法如下：

(1)rna提取：向待测样本中加入大肠杆菌噬菌体ms2作为质控，提取混合病毒rna；所述大肠杆菌噬菌体ms2加入量为1.3×10⁵pfu/ml≈1.27×10⁸copies/ml；

(2)pcr扩增：以步骤(1)混合病毒rna为模板，加入pcr反应体系中(反应缓冲液，逆转录酶，dna聚合酶和depc水)进行pcr扩增；pcr扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，58-64℃退火、延伸35s，39个循环，退火温度处同时收集荧光信号；同样条件下，以混合质粒作为pcr质控反应模板进行pcr扩增，以校准混合病毒rna的扩增效率；

(4)步骤(2)中hex荧光信号对应的ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒gi型；若fam荧光信号对应的ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒gii型；若rox荧光信号对应的ct值小于等于30，则样品中含有大肠杆菌噬菌体ms2，ct值小于等于30时，测定结果为有效阳性，ct值在30到40之间，可重复2次，如扩增曲线有明显对数增长期，测定结果为有效阳性，其它情况视为检测结果阴性。

本发明为了进一步验证阳性结果，取步骤(2)ct值小于等于30的有效阳性扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以溴化银为染料，以100bp标准分子量对照，如果104bp出现扩增条带，则样品存在诺如病毒gi型；如果80bp出现扩增条带，则样品存在诺如病毒gii型；如果86bp出现扩增条带，则样品存在大肠杆菌噬菌体ms2。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种高效、快捷、同时检测诺如病毒gi型、诺如病毒gii型和大肠杆菌噬菌体ms2的多重rt-pcr检测试剂盒，该试剂盒与现有技术相比，检测信号干扰性小，灵敏度高，可达到10¹个拷贝数，为环境检测、商品检验检疫、食品卫生等领域中大通量的样品的诺如病毒检测提供技术支持。

(四)附图说明

图1novgi、gii和ms2阳性病毒样本rt-qpcr荧光检测结果(a)和电泳图(b)。

图2诺如病毒(novgi和gii)浓度与ct值的标准曲线。a:诺如病毒gii型；b:诺如病毒gi型；c:大肠杆菌噬菌体ms2。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：多重rt-pcr检测试剂盒

1、试剂盒组成

(1)ran提取试剂：以大肠杆菌噬菌体ms2(atcc15597-b1)为待测样本rna提取的质控病毒，即向待检测样品中加入大肠杆菌噬菌体ms2(优选加入量1.3×10⁵pfu/ml≈1.27×10⁸copies/ml)，提取含ms2和待测样品的混合病毒rna作为pcr反应模板；

(2)pcr反应体系组成：2×buffer12.5μl，逆转录酶和dna聚合酶各0.5μl，引物(20μmol/lnovgi、novgii、ms2)各0.1μl，探针(20μmol/lnovgi、novgii、ms2)各0.05μl，模板5μl，depc水补齐至25μl；所述模板含待测样品和质控病毒的混合病毒rna。

本发明以诺如病毒gi型、诺如病毒gii型和大肠杆菌噬菌体ms2的rna多聚酶高保守区为靶序列(seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12)设计诺如病毒gi型、诺如病毒gii型和大肠杆菌噬菌体ms2正向、方向引物和特异性探针，其碱基序列分别为：

诺如病毒gi型引物、特异性探针：

正向引物gi-f：5’-ggcagatgatgagcgtgagg-3’(seqidno.1)；

反向引物gi-r：5’-agaaaccccatccagacccaaact-3’(seqidno.2)；

特异性探针probe-p:5’-hex-cactttatggagcagagtgac-bhq-3’(seqidno.3)；

诺如病毒gii型引物、特异性探针：

正向引物gii-f：5’-ctagaaacgctccaggtgaaat-3’(seqidno.4)；

反向引物gii-r：5’-tctggccaaatgggaaaggtaa-3’(seqidno.5)；

特异性探针probe-p:5’-fam-cccttgggccctgatttga-tamrar-3’(seqidno.6)；

大肠杆菌噬菌体ms2引物、特异性探针：

正向引物ms-f：5’-attccgactgcgagcttattgtt-3’(seqidno.7)；

反向引物ms-r：5’-ggagtttgctgcgattgctgagg-3’(seqidno.8)；

特异性探针probe-p:5’-rox-aatcgggtttccatcttttag-bhq2-3’(seqidno.9)。

(3)pcr质控体系组成：2×buffer12.5μl，逆转录酶和dna聚合酶各0.5μl，引物(20μmol/lnovgi、novgii、ms2)各0.1μl，探针(20μmol/lnovgi、novgii、ms2)各0.05μl，质控模板5μl，depc水补齐至25μl；所述质控模板是以含seqidno.10所示核苷酸序列的质粒pcda-nov-gi、含seqidno.11所示核苷酸序列的质粒pcda-nov-gii及含seqidno.12所示核苷酸序列的质粒pcda-ms2组成的混合质粒；

所述诺如病毒gi型的rna多聚酶高保守区为靶序列：norovirusgi(ncbiaccessionnumbersmg599789.1)

5’-ggcagatgatgagcgtgaggtggattacaatgagaagatcagttttgaggcgccccccactttatggagcagagtgacaaagtttgggtctggatggggtttct-3’(3191bp-3294bp)(seqidno.10)；

诺如病毒gii型的rna多聚酶高保守区为靶序列：norovirusgii(ncbiaccessionnumbersmf140656.1)

5’-ctagaaacgctccaggtgaaatactatggagcgcgcccttgggccctgatttgaatccttacctttcccatttggccaga-3’(5271bp-5350bp)(seqidno.11)；

大肠杆菌噬菌体ms2的rna多聚酶高保守区为靶序列：enterobacteriaphagems2(atcc15597-b1)(genbankaccessionnumbersnc001417)

5’-attccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagcaaactcc-3’(1630bp-1715bp)(seqidno.12)。

2、试剂盒的使用方法：

(1)提取病毒核酸：向待测样品中加入1.3×10³pfu/ml的大肠杆菌噬菌体ms2(atcc15597-b1)，按照qiaampviralrnaminikit说明书提取待测样品与ms2的混合rna；

(2)pcr扩增：按上述步骤1的pcr反应体系(2×buffer12.5μl，逆转录酶和taq酶各0.5μl，20μmol/l引物(ms2，novgi和novgii)各0.1μl，20μmol/l探针(ms2，novgi和novgii)各0.05μl)配置反应液，并加入含有5μl待测样品与ms2的混合rna的反应管中，depc水补齐至25μl，逆转录和扩增反应所需的试剂一次性加入反应管中，两步反应在一个反应管内完成，整个pcr扩增过程无需开盖。pcr扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，58-64℃退火、延伸35s，39个循环，退火温度处同时收集荧光信号。

(3)pcr扩增质控：以步骤1(3)含有目的片段的质粒pcda-nov-gi(7545bp)、pcda-nov-gii(7521bp)和pcda-ms2(6556bp)为混合质粒为质控模板，按步骤1(3)质控体系，与待测病毒样本参与同一批次pcr扩增反应，作为pcr扩增反应质控，pcr反应条件与待测病毒相同，以校准混合待测病毒rna的扩增效率。

3、特异性判断：步骤(2)中hex荧光信号对应的ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒gi型；若fam荧光信号对应的ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒gii型；若rox荧光信号对应的ct值小于等于30，则样品中含有大肠杆菌噬菌体ms2。取步骤2中(2)和(3)中ct值小于等于30的有效阳性扩增产物5ul，制备2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以溴化银为染料，凝胶成像分析系统观察结果，与100bp标准分子量对照，如果出现104bp扩增条带，切胶回收测序后可证明该样品存在诺如病毒gi型；如果出现80bp扩增条带，切胶回收测序后可证明该样品存在诺如病毒gii型；如果出现86bp扩增条带，切胶回收测序后可证明该样品存在ms2。

4、灵敏性判断：以含seqidno.10所示核苷酸序列的质粒pcda-nov-gi(7545bp)、含seqidno.11所示核苷酸序列的质粒pcda-nov-gii(7521bp)及含seqidno.12所示核苷酸序列的质粒pcda-ms2(6556bp)的混合质粒为质控模板，梯度稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6后，各个浓度取5μl模板，按照步骤(2)质控体系和扩增条件进行多重rt-pcr扩增，以ct值为横坐标，以拷贝数(copies)为纵坐标，分别获得诺如病毒gi型标准曲线(图2中b)、诺如病毒gii型标准曲线(图2中a)和大肠杆菌噬菌体ms2标准曲线(图2中c)；扩增结束后所检测到最低稀释度病毒核酸的ct值定位最高灵敏度值。本发明中将ct值小于等于30时，测定结果定义为有效阳性。ct值在30到40之间，可重复2次，如扩增曲线有明显对数增长期，测定结果为有效阳性，其它情况视为检测结果阴性。

实施例2、果蔬中诺如病毒的快速检测和定量方法

在浓缩蓝莓样品中病毒之前，先对病毒浓缩容器等进行消毒处理(高温高压灭菌处理)。

1、生菜和蓝莓样品中诺如病毒的洗脱

novgi和novgii病毒液的制备：分别取诺如病毒novgi和novgii腹泻病人粪便标本0.5g，加入pbs缓冲液1ml后涡旋振荡器上混匀5min，之后于8000g离心10min，去沉淀，将上清液经0.45μm膜过滤，收集滤液并采用rt-qpcr方法(同实施例1pcr扩增)检测滤液中诺如病毒含量(ct值)，并根据实施例1诺如病毒gi型标准曲线(图2中b)、诺如病毒gii型标准曲线(图2中a)，得到诺如病毒novgi浓度为1.6×10⁵copies/ml；novgi浓度为3.5×10⁵copies/ml。

新鲜生菜(lettuces)和蓝莓(blueberries)各一份，每份10g分装。分别取10μl质控病毒ms2(130pfu)、10μl诺如病毒novgi(1600copies)和10μl诺如病毒novgii(3500copies)混合液，点状涂布于生菜和蓝莓表面(0.5μl每点)，置于二级生物安全柜中30-60min。待室温下风干后，装入50ml离心管中，加入15ml洗脱液(tris12.11g，甘氨酸3.75g，牛肉浸膏20g，ddh2o1l，ph＝9.5)，加入果胶酶(30000u/g，0.02g/ml)和纤维素酶(10000u/g，0.01g/ml)各150μl，室温下漩涡振荡30min，10000rpm离心15min，上清转移至另一个50ml离心管中。

2、利用负电荷膜浓缩洗脱液中诺如病毒

用1mol/l的盐酸调节步骤1上清使ph＝3.5，将调整后的上清移入超滤杯中，采用真空抽滤使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜，再次往超滤杯中加入500mlpbs(0.1mol/l，ph＝3.5)缓冲液使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜(该步骤可达到去除部分果蔬中rna抑制剂的目的)，取出滤膜，剪碎后，放入1.5ml的ep管中，待下一步核酸提取。

3、rna提取

采用qiaampviralrnaminikit试剂盒提取负电荷滤膜上的病毒rna，首先向装有滤膜碎片的ep管中加入560μlavl裂解液，混匀后放入振荡器中剧烈振荡30min，8000g离心后取上清至另一个ep管中，余下步骤按照qiaampviralrnaminikit试剂盒说明书进行rna的提取，提取完毕的混合(ms2、novgi和gii)病毒rna于－20℃保存备用。

4、一步法荧光定量pcr

(1)pcr扩增反应：以步骤3提取的含有ms2、novgi和novgii混合病毒rna为共同模板5μl，加入实施例1试剂盒中pcr反应体系(2×buffer12.5μl，逆转录酶和taq酶各0.5μl，20μmol/l引物(ms2，novgi和novgii)各0.1μl，20μmol/l探针(ms2，novgi和novgii)各0.05μl)，depc水补齐至25μl)中，在荧光定量pcr仪(abi7500realtime，美国abi)上进行rt-pcr，扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，56℃退火、延伸35s，39个循环，分别获得ms2(rox荧光)、novgi(hex荧光)和novgii(fam荧光)荧光值。

(2)pcr质控反应：以实施例1质控体系进行相同条件的rt-pcr扩增，通过对质控模板和混合病毒rna模板扩增效率(e)的比较，以校准混合病毒rna的扩增效率，并将ct值带入实施例1质控模板的标准曲线获得相应的浓度值，用于计算检测效率。以上实验重复三份。

表1诺如病毒(novgi和gii)和大肠杆菌噬菌体ms2特异性引物与探针

5、rt-qpcr对果蔬中诺如病毒gi和gii的定量(copies/ml)分析

每份果蔬样品检测时均包含1份检测样本(加入已知浓度的ms2(130pfu)、novgi(1600copies)和novgii(3500copies))、1份阴性对照(不加病毒的果蔬样品)、1份空白对照(实时荧光rt-qpcr体系中以ddh2o代替rna)。三种荧光信号ct值≤30则判定为检出ms2、novgi和novgii，以上实验重复三份。

检出限的计算：分别取1份已知浓度的(130pfu)ms2、(1600copies)novgi和(3500copies)novgii病毒液，按1:10进行梯度系列稀释(10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、…….)后，将各稀释度的病毒混合液分别污染果蔬，再洗脱回收病毒，并提取病毒rna，以上每个稀释度样品重复六份，每份按照步骤3方法提取rna和步骤4方法检测病毒浓度，以每个稀释度中的六份检测样品首次出现全为阴性时，上一个稀释度所对应的病毒含量为本方法在果蔬样本中的检出限。

6、诺如病毒检测效率计算

相关公式如下：

(1)

(2)

(3)e＝10^[-1/slope]-1e为扩增效率；^slope为曲线斜率

7、结论

根据rt-qpcr的结果，生菜和蓝莓样品中诺如病毒的提取率和检出限的计算结果如表2所示，使用该方法检测生菜样品中诺如病毒novgi的检测率和检出限分别为4.72±2.56％和160copies/10g；novgii检测率和检出限分别为13.46±3.53％和350copies/10g；ms2的检测率和检出限分别为10.46±5.65％和13pfu/10g。检测蓝莓样品中诺如病毒novgi的检测率和检出限分别为8.22±1.62％和160copies/10g；novgii检测率和检出限分别为18.43±6.65％和350copies/10g；ms2的检测率和检出限分别为21.68±7.83％和13pfu/g。与传统方法相比，该方法该试剂盒检测信号干扰性小，灵敏度高，可达到10¹个拷贝数，具有显著的优越性。

实施例3：贝类中诺如病毒的快速检测和定量方法

在浓缩贝类样品中病毒之前，先对病毒浓缩容器等进行消毒处理(高温高压灭菌处理)。

1、贝类样品中的诺如病毒的洗脱

牡蛎(oyster)和文蛤(clam)去壳后每份10g分装。分别将10μl质控病毒ms2(130pfu)、10μl诺如病毒novgi(1600copies)和10μlnovgii(3500copies)混合液(诺如病毒novgi和gii过滤液采用案例2的方法制备)，点状涂布于牡蛎和文蛤表面(0.5μl每点)，置于二级生物安全柜中30-60min。待室温风干后，剪碎，装入50ml离心管中，加入30ml洗脱液(甘氨酸3.75g，nacl8.775g，ddh2o1l，ph＝9.5)，调节洗脱液ph值在9.2-9.5之间，室温下漩涡振荡30min，10000rpm离心15min，上清转移至另一个50ml离心管中，如发现油脂状物质漂浮于上清，可按特定比例(上清：混合液＝3:1，v/v)加入氯仿-正丁醇(1:1v/v)混合液的，振荡离心后取水相备用。

2、利用负电荷膜浓缩洗脱液中诺如病毒

用1mol/l的盐酸调节步骤1上清使ph＝3.5，将调整后的上清移入超滤杯中，采用真空抽滤使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜，再次往过滤漏斗中加入500mlpbs(0.1mol/l，ph＝3.5)缓冲液使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜(该步骤可达到去除部分食品中rna抑制剂的目的)，取出滤膜，剪碎后，放入1.5ml的ep管中，待下一步核酸提取。

3.rna提取

采用qiaampviralrnaminikit试剂盒提取负电荷滤膜上的诺如病毒rna，首先向装有滤膜碎片的ep管中加入560μlavl裂解液，混匀后放入振荡器中剧烈振荡10min，8000g离心30s后取上清至另一个ep管中，余下步骤按照其说明书进行rna的提取，提取完毕的待测混合病毒rna于－20℃保存备用。

4.一步法荧光定量pcr

(1)pcr扩增反应：以步骤3提取的含有ms2、novgi和novgii混合病毒rna为共同模板5μl，加入实施例1试剂盒中pcr反应体系中(2×buffer12.5μl，逆转录酶和taq酶各0.5μl，20μmol/l引物(ms2，novgi和novgii)各0.1μl，20μmol/l探针(ms2，novgi和novgii)各0.05μl)，depc水补齐至25μl)，在荧光定量pcr仪(abi7500realtime，美国abi)上进行rt-pcr扩增反应，扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，56℃退火、延伸35s，39个循环，对结果荧光检测。

(2)pcr质控扩增：以实施例1质控体系进行相同条件的rt-pcr扩增。以上实验重复三份。

检出限的计算：分别取1份已知浓度的(130pfu)ms2、(1600copies)novgi和(3500copies)novgii病毒液，按1:10进行梯度系列稀释(10⁰、10^-1、10^-2、10^-3)后，将各稀释度的病毒混合液分别污染贝类，再洗脱回收病毒，并提取病毒rna，以上每个稀释度样品重复六份，每份按照步骤3方法提取rna和步骤4方法检测病毒浓度，以每个稀释度中的六份检测样品首次出现全为阴性时，上一个稀释度所对应的病毒含量为本方法在贝类样本中的检出限。

5.诺如病毒检测效率的计算，同实施例2。

6.结论

根据rt-qpcr的结果，牡蛎和文蛤样品中诺如病毒的提取率和检出限的计算结果如表2所示，使用该方法检测牡蛎样品中诺如病毒novgi的检测率和检出限分别为2.57±1.68％和1600copies/10g；novgii检测率和检出限分别为1.32±0.53％和3500copies/10g；ms2的检测率和检出限分别为4.56±1.42％和130pfu/10g。文蛤样品中诺如病毒novgi的检测率和检出限分别为3.43±1.94％和1600copies/10g；novgii检测率和检出限分别为2.84±1.32％和3500copies/10g；ms2的检测率和检出限分别为3.83±1.51％和130pfu/10g。如表2所示，与传统方法(sn/t2626-2010和sn/t4055-2014)中分别对ms2、novgi和novgii病毒进行单一检测比，该方法可同时检测以上三种病毒，在检测效率和时间上显著优于传统方法。

表2粪便标本及三种污染食品中诺如病毒(novgi和gii)和ms2的回收率与检测限

^a检测含有不同浓度诺如病毒和ms2病毒的食品样本的实验重复5次

^b诺如病毒采用copies/10g为计量单位

^cms2病毒采用pfu/10g为计量单位

^d.括号中的数值代表回收率％

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其构架形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出简单的推演活替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

序列表

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>一种多重rt-pcr检测试剂盒及应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>未知(unknown)

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<210>2

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