本发明涉及一种从芒果苷原料中高效提取和分离高纯芒果苷的方法，具体涉及通过前处理、析取处理、离心处理、色谱分离处理和后处理等工序从芒果叶及芒果果皮等原料中提取和分离高纯芒果苷的方法，属于天然药物提取领域。
背景技术：
芒果苷，又称莞知母宁，在50％乙醇溶液中是一种淡灰黄色针状结晶。芒果苷可用于治疗慢性支气管炎，是藏茵陈治疗肝炎的主要有效成分，还是知母根茎中抗病毒的活性成分。研究发现，存在于芒果枝条、叶、树皮和扁桃叶等中的芒果苷具有抗炎、解热镇痛、抗菌、免疫调节、降血糖、抗氧化等广泛的药理作用，其结构式如下所示。
目前，市场上芒果苷主要销往制药企业、保健品企业以及海外客户，其价格昂贵。为提取和分离芒果苷，人们普遍采用的技术主要有四类：(1)水基溶剂法，该方法工艺简单，设备要求低，但该方法得到的芒果苷纯度并不高；(2)有机溶剂法，该方法得到的芒果苷的平均纯度可达97％，但使用有机溶剂会额外增加生产成本，并有可能造成产品污染；(3)酶法，由该方法得到的芒果苷的得率相对稳定，但纯度不稳定，极易受外界因素影响；(4)超声波法，该方法的提取效率高，但设备成本高、操作复杂。在芒果苷的提取和分离上，本领域相关工作人员进行过大量探索和尝试，部分工艺和方法已成功应用于实际生产中。例如，中国专利(cn201010292465.0)公开一种芒果苷的制备方法，该方法以芒果叶等为原料，用醇和水的混合溶液提取，过滤，滤液浓缩，所得浓缩液用有机溶剂萃取，然后取萃取水相结晶，用丙酮和水的混合溶液重结晶即得芒果苷，其产品纯度高，生产周期短，转移率较高，有机溶剂用量少，但因在芒果苷制备过程中先后使用多种有害有机溶剂而易污染芒果苷成品，且在醇提时芒果苷提取率不是很高。中国专利(cn201210053385.9)报道一种从芒果果皮中分离纯化芒果苷的方法，该方法以芒果果皮干燥粉末为原料，经乙酸乙酯萃取、hpd100大孔树脂、hsccc分离纯化得到高纯度芒果苷，其流程合理，产品纯度高，成本较低，适用工业化生产，但该方法同样在制备过程中需要配制多种有机溶液，操作流程较复杂，且有机溶剂种类繁多，可能导致芒果苷产品污染；中国专利(cn201610099728.3)公开一种由从木棉叶中提取高纯度芒果苷的方法，该方法以木棉叶为原料，将其干燥、粉碎处理后用醇溶液提取，回收醇，得到芒果苷粗品，再ab-8大孔树脂富集纯化，并经hsccc分离纯化得到高纯度芒果苷，其发明步骤简单，产品纯度高，但该方法在醇提时芒果苷得不到最大程度地提取，原料利用率较低；中国专利(cn201710057903.7)公开一种从芒果叶中提取分离芒果苷的方法，该方法通过原料准备、酯提除杂、甲醇提取、浓缩洗涤和结晶纯化等工艺可获得纯度达90～98％的芒果苷纯品，且其工艺简单，易操作，但该方法对原料的提取不彻底，导致产率最高时仅约为84％。
技术实现要素：
针对现有的提取和分离芒果苷的方法，本发明的目的旨在提供一种高效提取和分离高纯芒果苷的方法，该方法扩宽和丰富现有芒果苷的提取和分离工艺，通过综合运用微波和超声辅助浸提、异相液态超微原露析取和高效液相色谱分离(hplc)等先进技术，可从相关原料中高效提取和分离出高纯芒果苷；同时，采用闪式浓缩和真空干燥，能够尽可能地保存芒果苷的活性，有助于产品品质的提升，芒果苷的提取率不低于93％，纯度不低于98.5％，品质较高；且整个工艺流程安全、环保、无污染，原料易得，成本低廉，具有较高的推广价值。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种提取和分离芒果苷的方法，其包括以下步骤：
1)在微波加热和超声振动辅助下，含芒果苷的原料采用醇水混合溶液浸提，得到浸提液和浸提渣；
2)所述浸提渣用异相液态超微原露析取仪进行析取，所得析取液与所述浸提液合并得到提取液；
3)所述提取液通过离心分离，取上层清液；
4)所述清液通过高效液相色谱分离，截取芒果苷单体馏分；
5)所述芒果苷单体馏分进行闪式蒸发浓缩、真空干燥，得到芒果苷。
本发明的方法适用现有技术中各种常见的含芒果苷的原料来提取分离芒果苷，如常规的含芒果苷的原料包括芒果叶、扁桃叶、芒果果皮中至少一种。
优选的方案，所述醇水混合溶液包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇中至少一种低碳醇。这些低碳醇在浸提过程中可以提高芒果苷的溶出率，同时低碳醇易于蒸馏回收。
优选的方案，所述醇水混合溶液中低碳醇的体积百分比浓度为20～50％。适量的低碳醇可以提高芒果苷的溶出率。
优选的方案，所述浸提条件：醇水混合溶液与含芒果苷的原料的质量比为10～20:1，微波加热温度至45～70℃，超声振动频率为30～40khz，浸提时间为15～30min。在微波结合超声辅助作用下可充分释放和溶出原料中的芒果苷，提高芒果苷提取率和原料利用率。
优选的方案，所述含芒果苷的原料通过洗净、干燥及粉碎预处理，含芒果苷的原料粉碎至粒径为30～50目。
优选的方案，将浸提渣用异相液态超微原露析取仪进行三轮析取，每轮析取完成后收集所得析取液，同时所得析取残渣返回异相液态超微原露析取仪进行下轮析取，合并析取三轮所得析取液。浸提渣通过异相液态超微原露析取，可以减少浸提渣的损失，且异相液态超微原露析取技术为纯物理提取技术，不会引入新杂质，保障产品纯度和品质。
优选的方案，第一轮析取的温度和时间分别为50～70℃和2～3h，第二轮析取的温度和时间分别为40～50℃和1.5～2h，第三轮析取的温度和时间分别为30～40℃和0.5～1h。
优选的方案，所述离心分离过程中的环境温度为25～45℃，环境压强为0.2～0.3mpa，离心处理时长为5～10min，离心机转速为3500～4500r/min。通过高速离心分离可极大降低颗粒型杂质和其他非目标化学成分的含量，提高色谱分离的效率，使整个生产流程效率较高，从而有利于后续的高效液相色谱分离。
优选的方案，所述高效液相色谱分离以c18为固定相，以甲醇-磷酸盐溶液为流动相，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，c18填料粒径为5μm。
优选的方案，流动相组成为5～10vol％甲醇，0.2～0.4vol％nh4h2po4，94.8～89.6vol％水溶液；色谱柱的柱压为1.5～2.5mpa，柱温为30℃；清液浓度定容至0.6～1.1mg/ml。通过优选的液相色谱分离条件控制，可以提高芒果苷与杂质的分离效率，提高芒果苷的回收率及纯度。
优选的方案，所述闪式蒸发浓缩的温度为30～50℃。通过闪式浓缩及真空干燥处理芒果苷成品，可最大限度地避免芒果苷活性破坏。
本发明的浸提过程完成后，将浸提混合物通过蒸馏回收醇溶剂，降低有机溶剂的损耗及减少环境的污染。
本发明的技术方案中，凡未做特别说明的，均可采用本领域中的常规手段来实现本技术方案。
与现有芒果苷的提取和分离技术相比，本发明技术方案带来的有益技术效果：
1)本发明技术方案关键创新在于将微波和超声辅助浸提、异相液态超微原露析取、高效液相色谱分离(hplc)及闪式蒸发等先进技术完美结合综合运用于芒果叶、扁桃叶、芒果果皮等原料中的芒果苷的高效提取和分离，达到了很好提取分离效果。本发明首先通过微波加热和超声振动辅助作用下进行醇水混合溶液浸提，同时结合异相液态超微原露析取技术对浸提渣进一步析取，可充分释放和溶出原料中的芒果苷，提高芒果苷提取率和原料利用率，同时降低杂质引入，提取液采用高速离心分离和高效液相色谱分离结合处理，通过离心处理，可极大降低颗粒型杂质和其他非目标化学成分的含量，保证后续的色谱分离的效率，而高效液相色谱分离技术通过控制色谱条件可以获得高纯度的芒果苷馏分；在此基础上，芒果苷馏分通过闪式浓缩和真空干燥处理可最大限度地避免芒果苷活性破坏，保留芒果苷活性。因此，通过上述工艺，可以提高芒果苷的提取率，获得高纯度和品质芒果苷，原料中芒果苷的提取率不低于93％，纯度不低于98.5％，品质较高。
2)本发明方法可以适应现有技术中常见原料中芒果苷的提取，原料易得，价格低廉，生产成本较低。
3)本发明方法再芒果苷提取过程中，有机溶剂用量少，采用的醇类有机溶剂安全环保，且可以通过蒸馏回收并循环利用，工艺过程安全且环保。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种高效提取和分离高纯芒果苷的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为30目的碎块，随后向该碎块中添加20倍碎块质量的浓度为20％的有机水溶液，之后将其微波加热至50℃并在30khz的超声波作用下浸提处理25min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为芒果叶，有机水溶液由甲醇和纯净水配制而成。
(2)析取处理：将浸提渣用异相液态超微原露析取仪析取处理三次，析取完成后将析取液和浸提液合并得到提取液；其中，第一次析取处理的温度和时间分别为65℃和3h，第二次析取处理的温度和时间分别为50℃和1.5h，第三次析取处理的温度和时间分别为40℃和0.5h。
(3)离心处理：将提取液用离心机离心分离5min，收集上清液并将其用纯净水定容成浓度为0.8mg/ml的定容上清液；其中，离心处理环境温度为45℃，环境压强为0.2mpa，离心机转速为3500r/min。
(4)色谱分离处理：将定容上清液以c18为色谱固定相，以5％甲醇-0.4％nh4h2po4-94.6％水溶液(体积分数)为流动相，进行高效液相色谱分离并截取芒果苷单体馏分；其中，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm，柱压为2.3mpa，柱温为30℃。
(5)后处理：将芒果苷单体馏分在50℃下进行闪式蒸发浓缩，然后真空干燥得到高纯芒果苷，测得芒果苷的提取率为93％，纯度为98.5％，芒果苷活性成分未被破坏。
实施例2
一种高效提取和分离高纯芒果苷的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为50目的碎块，随后向该碎块中添加10倍碎块质量的浓度为40％的有机水溶液，之后将其微波加热至70℃并在35khz的超声波作用下浸提处理30min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为芒果果皮，有机水溶液由丙醇和纯净水配制而成。
(2)析取处理：将浸提渣用异相液态超微原露析取仪析取处理三次，析取完成后将析取液和浸提液合并得到提取液；其中，第一次析取处理的温度和时间分别为60℃和2.5h，第二次析取处理的温度和时间分别为40℃和2h，第三次析取处理的温度和时间分别为35℃和1h。
(3)离心处理：将提取液用离心机离心分离10min，收集上清液并将其用纯净水定容成浓度为0.9mg/ml的定容上清液；其中，离心处理环境温度为25℃，环境压强为0.25mpa，离心机转速为4500r/min。
(4)色谱分离处理：将定容上清液以c18为色谱固定相，以10％甲醇-0.2％nh4h2po4-89.8％水溶液(体积分数)为流动相，进行高效液相色谱分离并截取芒果苷单体馏分；其中，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm，柱压为2mpa，柱温为30℃。
(5)后处理：将芒果苷单体馏分在30℃下进行闪式蒸发浓缩，然后真空干燥得到高纯芒果苷，测得芒果苷的提取率为94％，纯度为99％，芒果苷活性成分未被破坏。
实施例3
一种高效提取和分离高纯芒果苷的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为40目的碎块，随后向该碎块中添加14倍碎块质量的浓度为30％的有机水溶液，之后将其微波加热至65℃并在40khz的超声波作用下浸提处理20min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为扁桃叶，有机水溶液由乙醇和纯净水配制而成。
(2)析取处理：将浸提渣用异相液态超微原露析取仪析取处理三次，析取完成后将析取液和浸提液合并得到提取液；其中，第一次析取处理的温度和时间分别为70℃和2h，第二次析取处理的温度和时间分别为45℃和2h，第三次析取处理的温度和时间分别为30℃和1h。
(3)离心处理：将提取液用离心机离心分离8min，收集上清液并将其用纯净水定容成浓度为0.6mg/ml的定容上清液；其中，离心处理环境温度为35℃，环境压强为0.2mpa，离心机转速为3800r/min。
(4)色谱分离处理：将定容上清液以c18为色谱固定相，以7％甲醇-0.3％nh4h2po4-92.7％水溶液(体积分数)为流动相，进行高效液相色谱分离并截取芒果苷单体馏分；其中，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm，柱压为1.5mpa，柱温为30℃。
(5)后处理：将芒果苷单体馏分在40℃下进行闪式蒸发浓缩，然后真空干燥得到高纯芒果苷，测得芒果苷的提取率为95％，纯度为98.7％，芒果苷活性成分未被破坏。
实施例4
一种高效提取和分离高纯芒果苷的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为45目的碎块，随后向该碎块中添加15倍碎块质量的浓度为50％的有机水溶液，之后将其微波加热至45℃并在38khz的超声波作用下浸提处理15min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为芒果叶和芒果果皮的混合物，有机水溶液由丁醇和纯净水配制而成。
(2)析取处理：将浸提渣用异相液态超微原露析取仪析取处理三次，析取完成后将析取液和浸提液合并得到提取液；其中，第一次析取处理的温度和时间分别为50℃和3h，第二次析取处理的温度和时间分别为40℃和2h，第三次析取处理的温度和时间分别为40℃和0.5h。
(3)离心处理：将提取液用离心机离心分离6min，收集上清液并将其用纯净水定容成浓度为1.1mg/ml的定容上清液；其中，离心处理环境温度为40℃，环境压强为0.3mpa，离心机转速为4000r/min。
(4)色谱分离处理：将定容上清液以c18为色谱固定相，以8％甲醇-0.3％nh4h2po4-91.7％水溶液(体积分数)为流动相，进行高效液相色谱分离并截取芒果苷单体馏分；其中，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm，柱压为2.5mpa，柱温为30℃。
(5)后处理：将芒果苷单体馏分在45℃下进行闪式蒸发浓缩，然后真空干燥得到高纯芒果苷，测得芒果苷的提取率为95％，纯度为99.1％，芒果苷活性成分未被破坏。
对比实施例1
与实施例1-4不同，该对比实施例不使用异相液态超微原露析取技术，其工艺步骤为：
(1)前处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为40目的碎块，随后向该碎块中添加18倍碎块质量的浓度为30％的有机水溶液，之后将其微波加热至60℃并在35khz的超声波作用下浸提处理20min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为芒果叶，有机水溶液由甲醇和纯净水配制而成。
(2)离心处理：将浸提液用离心机离心分离10min，收集上清液并将其用纯净水定容成浓度为0.9mg/ml的定容上清液；其中，离心处理环境温度为35℃，环境压强为0.2mpa，离心机转速为4500r/min。
(3)色谱分离处理：将定容上清液以c18为色谱固定相，以9％甲醇-0.3％nh4h2po4-90.7％水溶液(体积分数)为流动相，进行高效液相色谱分离并截取芒果苷单体馏分；其中，色谱柱的内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm，柱压为2.5mpa，柱温为30℃。
(4)后处理：将芒果苷单体馏分在40℃下进行闪式蒸发浓缩，然后真空干燥得到高纯芒果苷，测得芒果苷的提取率为76％，纯度为98.5％。
对比实施例2
在此对比实施例中，用重结晶处理代替高效液相色谱分离处理，其工艺步骤为：
(1)前处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为30目的碎块，随后向该碎块中添加20倍碎块质量的浓度为45％的有机水溶液，之后将其微波加热至70℃并在35khz的超声波作用下浸提处理20min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为芒果叶和芒果果皮的混合物，有机水溶液由乙醇和纯净水配制而成。
(2)析取处理：将浸提渣用异相液态超微原露析取仪析取处理三次，析取完成后将析取液和浸提液合并得到提取液；其中，第一次析取处理的温度和时间分别为60℃和3h，第二次析取处理的温度和时间分别为45℃和2h，第三次析取处理的温度和时间分别为30℃和0.5h。
(3)离心处理：将提取液用离心机离心分离5min，收集上清液；其中，离心处理环境温度为25℃，环境压强为0.3mpa，离心机转速为4500r/min。
(4)重结晶处理：将上清液用40％乙醇溶液进行两次重结晶，得到芒果苷成品，测得芒果苷的提取率为91％，纯度为78％。
对比实施例3
在此对比实施例中，不采用异相液态超微原露析取技术，且用重结晶处理代替高效液相色谱分离处理，其工艺步骤为：
(1)前处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为35目的碎块，随后向该碎块中添加19倍碎块质量的浓度为40％的有机水溶液，之后将其微波加热至65℃并在37khz的超声波作用下浸提处理16min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为芒果果皮，有机水溶液由甲醇和纯净水配制而成。
(2)离心处理：将浸提液用离心机离心分离5min，收集上清液；其中，离心处理环境温度为25℃，环境压强为0.3mpa，离心机转速为4500r/min。
(3)重结晶处理：将上清液用40％乙醇溶液进行两次重结晶，得到芒果苷成品，测得芒果苷的提取率为74％，纯度为82％。
对比实施例4
此对比实施例采用常规提取方法提取芒果苷，即在醇提时不采用微波和超声辅助，后续采用重结晶处理分离芒果苷，其工艺步骤为：
(1)浸提处理：将原料洗净、干燥、粉碎成粒径为45目的碎块，随后向该碎块中添加17倍碎块质量的浓度为48％的有机水溶液，并在50℃下浸提处理30min，浸提完成后蒸馏回收有机水溶液中的有机溶剂并过滤得到浸提液和浸提渣。其中，原料为芒果叶，有机水溶液由乙醇和纯净水配制而成。
(2)重结晶处理：将浸提液蒸发浓缩，并用45％乙醇溶液进行两次重结晶，得到芒果苷成品，测得芒果苷的提取率为55％，纯度为73％。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。