一种人乳中的功能组分及其制备和应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种人乳中的功能组分对早产儿坏死性小肠结肠炎的修复作用及该组分的制备方法。

背景技术：

人乳中游离的寡糖(低聚糖)是一类重要的成分，其含量在人乳干物质中排第三位，仅次于乳糖和脂肪。人乳寡糖由五种单糖组合而成，包括葡萄糖、半乳糖、n-乙酰半乳糖胺、岩藻糖、唾液酸。按照寡糖结构中是否含有唾液酸将其分为酸性寡糖与中性寡糖。人乳中酸性寡糖的种类数量约占总人乳寡糖的30％，含量约占总人乳寡糖15％，可以作为病原体和外源性毒素的特异性识别位点，从而抑制其向肠道上皮细胞的转移感染。唾液酸残基同时具有负电荷和亲水特性，可以协助调节细胞间的识别作用,例如唾液酸可以作为凝集素配体参与免疫反应调控，唾液酸在促进神经元的萌芽和可塑性方面也具有重要作用,是婴儿神经发育所必需的重要营养来源，不含唾液酸的中性人乳寡糖则无此作用。经实验证实酸性寡糖对早产儿的坏死性小肠结肠炎有很好的保护和修复作用。

早产儿的坏死性小肠结肠炎是一种获得性疾病，是多种原因引起的肠黏膜损害，使之缺血、缺氧，导致小肠、结肠发生弥漫性或局部坏死的一种疾病。主要在早产儿或患病的新生儿中发生，以腹胀，便血为主要症状，其特征为肠黏膜甚至为肠深层的坏死，最常发生在回肠远端和结肠近端，小肠很少受累。腹部x线平片部分肠壁囊样积气为特点，本症是新生儿消化系统极为严重的疾病。

目前，对人乳寡糖分离纯化主要有3种策略：(1)直接根据分子量的大小或所带电荷的多少，采用凝胶渗透色谱或高效阴离子交换色谱进行分离[eggeh.etal.,j.chromatogr.b,1996,685,211-221；sawatzkig.etal.,anal.chem.,1999,71(17),3755-3762]；(2)对天然母乳寡糖进行衍生化修饰后，再利用反相或正相色谱进行分离[lebrillacb.etal.,anal.chem.,2012,430,97-104]；(3)通过化学方法、酶促方法、化学-酶促方法，合成母乳寡糖[wongch.etal.,jamchemsoc1999,121,734-753；boomrm.etal.,biotechnolprog，2003,19,1391]。由于母乳寡糖异构体较多，策略1的选择性较低，时间周期长，制备效率低。策略2虽然具有一定的选择性，但得到的寡糖为衍生物形式，破坏了天然母乳寡糖的原始结构。策略3，化学方法面临糖基供体存在电子、空间的阻碍，使其较难形成糖苷键，同时在反应过程中还存在立体化学消旋产生的副产物等缺点。酶促反应中，糖基转移酶以及糖苷酶的来源以及活性底物受到一定的限制。

技术实现要素：

本发明涉及一种对早产儿的坏死性小肠结肠炎有保护和修复作用的的物质，即人乳中的功能组分酸性寡糖及其制备方法。

酸性寡糖的特征在于含有一个或两个以上的唾液酸，由d-葡萄糖(glc)、d-半乳糖(gal)、n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)和n-乙酰神经氨酸(唾液酸,neu5ac)，l-岩藻糖(fuc)这些单糖通过不同的组合和连接方式构成。

酸性寡糖的主要成分包括3’-sl、6’-sl、3f-3’-sl、lst-a、lst-b、lst-c、dslnt等，将人乳中的功能组分中3’-sl的量定为1，则该组分中则该组分中6’-sl的相对含量在0.1-5.0、3f-3’-sl的相对含量在0.1-2、lst-a的相对含量在0.01-0.5、lst-b的相对含量在0.01-0.5、lst-c的相对含量在0.1-1、dslnt的相对含量在0.1-2、6’-slnfpv的相对含量在0.01-0.5之间。

为实现上述发明目的，本发明采用制备酸性寡糖的技术方法如下：

1)离心脱脂步骤为：取人乳样品，于0-10℃条件下，500-50000g离心5-500分钟，除去上层脂质，离心1-5次后，取下层既得脱脂人乳样品；

2)除蛋白步骤为：取脱脂人乳样品，加入1-5倍体积量的水溶解到脱脂人乳样品中，混匀，过膜，收集透过液，得到脱脂除蛋白的乳清液，过膜的材料可选择中空纤维膜、板框式膜包中的一种或/和两种以上，膜孔径为5-100kd；

3)柱色谱分离步骤为：取脱脂除蛋白样品，20-80％有机溶剂水溶液溶解样品，样品经液相色谱方法进行分离，以亲水性填料为色谱柱固定相，以水和有机溶剂或缓冲盐水溶液和有机溶剂为流动相，使用等度或梯度方法进行洗脱，

所述的固定相为亲水性填料，硅胶或聚合物的修饰物可以是两性离子、氨基、酰胺基等中的一种。

所述的洗脱液中的有机溶剂为甲醇，乙腈，乙醇，异丙醇，丙酮中的一种或几种。

所述缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及ph如下之一：

a)甲酸铵缓冲盐，浓度0-200mm，ph2.0-7.0；

b)乙酸铵缓冲盐，浓度0-200mm，ph2.0-7.0；

c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度0-200mm，ph6.0-9.0；

优化流动相梯度如下：

使用等度方法进行洗脱：流动相中水或缓冲盐水溶液与有机溶剂按体积比例为5/95～95/5作为洗脱液；

或使用线性梯度方法进行洗脱：流动相中水或缓冲盐水溶液的体积浓度从小到大变化，起始体积浓度为5-60％，终止体积浓度为40-95％；

或使用台阶梯度方法进行洗脱：按流动相中水或缓冲盐水溶液的体积比例从5％～95％中从小至大随机选取2个以上进行洗脱操作，

收集0-3倍柱体积的流出液，

优化色谱操作参数如下：固体载样量为0.01％-15％；流速为0.1-2倍柱体积/min；色谱柱内径为4.6-500mm；柱温为15-60℃；检测器为uv，检测波长190-280nm。

本发明所述人乳中的功能组分及其制备方法，其特征在于：该组分对早产儿的坏死性小肠结肠炎有很好的保护和修复作用，人乳样品经过低温离心脱脂、过膜除蛋白、柱色谱分离，最终获得人乳中的功能组分。

本发明具有如下优点：

1、选择性高：针对当前酸性寡糖制备遇到的问题，本发明提出使用亲水色谱填料作为固定相，酸性寡糖可以获得较好的分离，有效的解决了选择性不足的问题。

2、重复性好：实验操作简单可控，过程稳定，重复性好。

3、操作简单：样品无需衍生化，保留了酸性寡糖的原始结构。

4、效率高：制备周期时间段，很好的提高了生产效率。

附图说明

图1为实施例2人乳中酸性寡糖的制备谱图。

图2为实施例2人乳中酸性寡糖的lc-ms分析色谱图。

图3为实施例5大鼠实验模型中回肠末端组织病理学变化情况。

具体实施方式

实施例1

取一定量人乳，于4℃下4000g离心60min，除去上层脂质。取下层水层，加入2倍体积量的水溶解到脱脂人乳样品中，混匀，采用40kd的中空纤维膜，收集透过液，即的脱脂除蛋白的寡糖样品。

称取脱脂除蛋白寡糖样品，配置成浓度为10mg/ml的溶液，进样量为100μl，使用酰胺柱，色谱柱内径4.6mm，长度150mm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。流动相a为乙腈，b为水，c为100mm甲酸铵。乙腈为弱洗脱溶剂，梯度条件洗脱，洗脱条件为：0-30min，85％-50％a，c％保持10％不变。按时间收集0-5min馏分，即得脱脂除蛋白的酸性寡糖样品9.3mg，并经质谱和色谱检测确认其为纯的酸性寡糖混合物。

实施例2

取一定量人乳，于10℃下10000g离心30min，除去上层脂质。取下层水层，加入3倍体积量的水溶解到脱脂人乳样品中，混匀，采用50kd的中空纤维膜，收集透过液，即的脱脂除蛋白的寡糖样品。

称取脱脂除蛋白寡糖样品，配置成浓度为80mg/ml的溶液，进样量为100ml，使用谷胱甘肽亲水色谱柱，色谱柱内径50mm，长度250mm；流速为80ml/min；柱温为30℃。流动相a为乙腈，b为水。乙腈为弱洗脱溶剂，梯度条件洗脱，洗脱条件为：0-40min，85％-50％a。按时间收集0-10min馏分，即得脱脂除蛋白的酸性寡糖样品109.3mg，并经质谱和色谱检测确认其为纯的酸性寡糖混合物。

实施例3

取一定量人乳，于4℃下20000g离心5min，除去上层脂质。取下层水层，加入4倍体积量的水溶解到脱脂人乳样品中，混匀，采用80kd的板框式膜包，收集透过液，即的脱脂除蛋白的寡糖样品。

称取脱脂除蛋白寡糖样品，配置成浓度为100mg/ml的溶液，进样量为200ml，使用硅胶柱，色谱柱内径100mm，长度150mm；流速为240ml/min；柱温为30℃。流动相a为乙腈，b为水，c为100mm乙酸铵。乙腈为弱洗脱溶剂，梯度条件洗脱，洗脱条件为：0-30min，85％-50％a，c％保持10％。按时间收集0-5min馏分，即得脱脂除蛋白的酸性寡糖样品1025.3mg，并经质谱和色谱检测确认其为纯的酸性寡糖混合物。

实施例4

取人乳样品2ml在8000r/min的条件下于4℃离心10min，去除脂质后，冷冻干燥。由于样品量不多，采用沉淀除蛋白的方法，在干燥的粉末中加入1ml乙醇/水(2:1)溶液，然后在4℃条件下以8000r/min离心10分钟，除去大部分蛋白质。用上清液进行分析。

为了对复杂的酸性寡糖进行结构分析，将agilentq-tof质谱仪(agilenttechnologies6540uhd)连接到uhplc系统以形成lc-ms系统。采用x酰胺柱(5μm，150×2.1mm)，流速0.2ml/min，流动相由acn(a)、h2o(b)和100mm甲酸铵缓冲液(ph3.2(c))组成。溶剂梯度如下：0～40min，80/10/10(a/b/c)-50/40/10(a/b/c)。干燥气体温度为350℃，流速为8.0l/min，在负离子模式下，在m/z450-2000(ms)和m/z100-2000(ms/ms)的质量范围内，ms和ms/ms光谱的采集速率均为每谱1s。利用离子丰度数据系统自动进行前体离子选择。从每个ms谱中选择三个前体进行产品离子扫描。碰撞能量(40v)用于碰撞诱导解离(cid)。

实施例5

常州儿童医院用大鼠模型进行酸性寡糖对坏死性小肠结肠炎的的作用试验，其实验过程如下：

取6只正常的大鼠作为对照组；4只回肠末端受到损伤其它与对照组一致的大鼠作为患病组；5只回肠末端受到损伤但给与一定量的实施例2获得的酸性寡糖治疗，三组大鼠均已婴儿配方粉作为食物，其中治疗组在婴儿配方粉中添加了酸性寡糖，酸性寡糖使用剂量为每克体重每天食用量为2mg。一周后经观察发现对照组的大鼠回肠末端组织的绒毛长且正常；患病组的大鼠回肠末端组织出现上皮脱落、绒毛脱落和黏膜下坏死的现象；给药组的大鼠回肠末端绒毛虽然出现部分损伤，但是没有患病组的情况严重。

实施例6

采用与实施例5相同的实验过程，与其不同之处在于，所采用的酸性寡糖组成为3’-sl、6’-sl、3f-3’-sl、lst-a、lst-b、lst-c、dslnt按照1:2:0.5:0.2:0.3:0.6:1的比例混的混合寡糖一周后经观察发现对照组的大鼠回肠末端组织的绒毛长且正常；患病组的大鼠回肠末端组织出现上皮脱落、绒毛脱落和黏膜下坏死的现象；给药组的大鼠回肠末端绒毛虽然出现部分损伤，但是没有患病组的情况严重。